張曉艷，溫春燕，陳 豪，佘菲菲

胃癌，全球最常見(jiàn)癌癥中排名第5，死亡率位居第4，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康[1]。幽門(mén)螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)是胃癌發(fā)生的I類(lèi)致癌原。該菌的細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白(cytotoxin associated antigen A，CagA)，是其最重要的毒素之一，已證實(shí)是致癌蛋白，在胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究中備受關(guān)注[2-3]。

YWHAE全稱(chēng)酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-單加氧酶激活蛋白ε肽(Tyrosine3-monooxygenase/tryptophan5-monooxygenase activation protein，epsilon)，為14-3-3蛋白家族ε亞型，是生物進(jìn)化中的保守蛋白。該蛋白能與多種細(xì)胞蛋白相互作用，調(diào)控細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡、遷移等過(guò)程，在肝癌、腎癌、乳腺癌等腫瘤中高表達(dá)，具有促癌作用[4]。但在胃癌研究中，不同團(tuán)隊(duì)報(bào)道不一。Leal MF團(tuán)隊(duì)[5-6]發(fā)現(xiàn)，臨床樣本中，YWHAE在胃癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織；胃癌細(xì)胞中，下調(diào)YWHAE可上調(diào)細(xì)胞周期分裂蛋白CDC25B，并促發(fā)原癌基因MYC的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。Gong XX團(tuán)隊(duì)[7]報(bào)道，在細(xì)胞和裸鼠水平，抑制YWHAE表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)；Yang M團(tuán)隊(duì)[8]報(bào)道，YWHAE受到核凋亡誘導(dǎo)因子1(NAIF1)的負(fù)調(diào)控，在胃癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)。胃癌中，YWHAE抑癌還是促癌，亟待深入探討。

CagA蛋白通?？煞譃镹-末端保守區(qū)(約占70%)和C-末端可變區(qū)(約占30%)。已有研究表明[3]，其N(xiāo)-末端可與RUNX3、ASPP2、β1整合素等互作，促進(jìn)RUNX3、ASPP2的降解，參與CagA移位和細(xì)胞內(nèi)漿膜面定位等；其C-末端可與CSK、SHP2、c-Met等互作，具有抑制SFK、FAK活性，增強(qiáng)細(xì)胞活性等功能；而SHP1、TAK1則與CagA的N-末端與C-末端均分別存在結(jié)合，具有介導(dǎo)CagA的酪氨酸去磷酸化，參與激活細(xì)胞NF-κB等作用。確定CagA與宿主蛋白互作的結(jié)合區(qū)段，是CagA與宿主蛋白相互作用機(jī)制研究的重要組成，有助于深入闡明CagA的致癌機(jī)制。

本研究團(tuán)隊(duì)，在CagA的致胃癌機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，YWHAE可與CagA互作，并激活胃癌細(xì)胞NF-κB的活性[9]，但二者互作的具體機(jī)制尚未闡明。因此，本研究擬在酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞水平，通過(guò)酵母雙雜交、免疫共沉淀及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)等方法，研究與YWHAE互作的CagA區(qū)段，旨在探討CagA與YWHAE互作的機(jī)制，以期進(jìn)一步揭示幽門(mén)螺桿菌相關(guān)胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要菌株、質(zhì)粒、病毒和細(xì)胞 酵母菌株AH109和Y187(Clontech)。質(zhì)粒pGBKT7-cagA、pcDNA3.1+cagA-FLAG、pcDNA3.1+cagA-N-FLAG、pcDNA3.1+cagA-M-FLAG、pcDNA3.1+cagA-C-FLAG和pGADT7-YWHAE、pcDNA3.1-myc-YWHAE[我室(消化道惡性腫瘤教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)構(gòu)建并保存][9-10]，pNF-κB-Luc(Clontech)，pRL-TK(Promega)。細(xì)胞COS-7和AGS(中科院上海細(xì)胞庫(kù))，AGS-siNC和AGS-siYWHAE細(xì)胞(我室構(gòu)建并保存)[11]。

1.2 主要試劑 酵母培養(yǎng)基及相關(guān)添加劑(Clontech)，3-AT、ONPG、F12K培養(yǎng)基(Sigma)，DMEM培養(yǎng)基、胰酶(GIBCO)，胎牛血清(FBS)(PAN)，F(xiàn)uGENE○R6 Transfection Reagent、the Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)，Western及IP細(xì)胞裂解液(碧云天)，Protein A&G Agarose(Santa cruz)。

1.3 酵母細(xì)胞水平檢測(cè)CagA與YWHAE互作的區(qū)段

1.3.1 CagA分段蛋白在酵母細(xì)胞中的表達(dá)鑒定 為檢測(cè)與YWHAE互作的CagA區(qū)段，將CagA蛋白分為CagA-N、CagA-M、CagA-(N+M)、CagA-C不同的區(qū)段[12]。以pGBKT7-cagA[9]為模板，PCR擴(kuò)增分段蛋白基因(所用引物“P1-P6”和目的片段詳情見(jiàn)表1和圖1-A)，將各基因片段分別插入pGBKT7質(zhì)粒中。按照《Yeast Protocols Handbook》(Clontech)的方法，各重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化酵母AH109細(xì)胞，并進(jìn)行Western blot檢測(cè)：使用Rabbit anti-CagA (b-300) 抗體(針對(duì)CagA 1-300氨基酸，1∶200， Santa Cruz)檢測(cè)CagA-N、-M和 (N+M)分段蛋白的表達(dá)；使用Myc-Tag (9B11) 抗體(1∶1 000，Cell Signaling Technology)檢測(cè)CagA-C蛋白的表達(dá)(Myc為表達(dá)載體的標(biāo)簽蛋白)。

1.3.2 酵母雙雜交檢測(cè)CagA互作區(qū)段 采用“the GAL4 yeast two-hybrid system”進(jìn)行酵母雙雜交檢測(cè)CagA互作區(qū)段。按照《Yeast Protocols Handbook》，為避免因CagA分段蛋白具有反式激活GAL4反應(yīng)元件的特性而造成酵母雙雜交結(jié)果假陽(yáng)性，首先采用“濾紙法”定性檢測(cè)各轉(zhuǎn)化菌株的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-gal)活性判斷 CagA分段蛋白是否具有該反式激活特性：將CagA分段蛋白及CagA蛋白重組質(zhì)粒各自轉(zhuǎn)化的酵母菌株AH109[pGBKT7-cagA]、AH109[pGBKT7-cagA-N]、AH109[pGBKT7-cagA-M]、AH109[pGBKT7-cagA-(N+M)]和AH109[pGBKT7-cagA-C]單克隆，各自劃雙斜線接種于Whatman○R3M濾紙上(濾紙?zhí)崆百N于SD/-Trp平板)，30 ℃培養(yǎng)20 h；將濾紙，于液氮中15 s、室溫30 min，置Z buffer檢測(cè)液進(jìn)行顯色檢測(cè)。AH109[pCL1](SD/-Leu平板)為陽(yáng)性對(duì)照， AH109[pGBKT7-lam]與AH109[pGBKT7]為陰性對(duì)照。其次，將CagA分段蛋白重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的AH109菌株與酵母Y187[pGADT7-YWHAE]菌株，分別進(jìn)行酵母一對(duì)一交配實(shí)驗(yàn)[9]，簡(jiǎn)述即：Y187[pGADT7-YWHAE]×AH109[pGBKT7-cagA-N]、Y187[pGADT7-YWHAE]×AH109[pGBKT7-cagA-M]、Y187[pGADT7-YWHAE]×AH109[pGBKT7-cagA-(N+M)]、Y187[pGADT7-YWHAE]×AH109[pGBKT7-cagA-C]， Y187[pGADT7-YWHAE]×AH109[pGBKT7-cagA]和Y187[pGADT7-T]×AH109[pGBKT7-53]均為陽(yáng)性對(duì)照，Y187[pGADT7]×AH109[pGBKT7]為陰性對(duì)照。最后，挑取上述交配產(chǎn)物的菌落(雜合子克隆)，采用“ONPG液相分析法”定量檢測(cè)β-gal活性，判斷與YWHAE互作的CagA區(qū)段，即：每種交配，挑取QDO/X-α-gal/3-AT平板上雜合子克隆各5個(gè)，若QDO/X-α-gal/3-AT平板上無(wú)克隆，則挑取SD/-Leu/-Trp平板上的雜合子克隆各5個(gè)，進(jìn)行液體培養(yǎng)并定量(檢測(cè)OD600值)，然后洗滌、離心濃縮，進(jìn)而液氮凍融裂解，用Z buffer(含終濃度4 mg/mL的ONPG)進(jìn)行計(jì)時(shí)顯色反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)(OD420值)，計(jì)算各樣品β-gal活性單位[β-galactosidase units=1 000×OD420/(t×0.5×OD600)]，判斷互作情況。

表1 CagA分段蛋白基因PCR擴(kuò)增引物Tab.1 Details of the PCR primers used for amplification of truncations of the gene encoding CagA

1.4 哺乳動(dòng)物細(xì)胞水平檢測(cè)與YWHAE互作的CagA區(qū)段

1.4.1 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)檢測(cè) 采用Co-IP檢測(cè)與YWHAE互作的CagA區(qū)段，方案參照前期研究[9]：將CagA分段蛋白哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體(pcDNA3.1+cagA-N-FLAG、pcDNA3.1+cagA-M-FLAG、pcDNA3.1+cagA-C-FLAG，pcDNA3.1+cagA-FLAG為陽(yáng)性對(duì)照，pcDNA3.1+FLAG為空白對(duì)照)各自與YWHAE表達(dá)載體pcDNA3.1-myc-YWHAE(pcDNA3.1-myc為空白對(duì)照)共轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞(2×106個(gè)/組)，每組DNA總量15 μg(表達(dá)載體間等摩爾，并用Herring sperm DNA平衡總量)，轉(zhuǎn)染試劑(FuGENE○R6 Transfection Reagent)30 μL，按轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)操作。轉(zhuǎn)染后48 h，收獲細(xì)胞，用Western及IP細(xì)胞裂解液[含1×PMSF 和Cocktail蛋白酶抑制劑(Roche)]裂解。裂解的可溶性產(chǎn)物，分別先經(jīng)預(yù)清除(1 μg normal IgG和20 μL Protein A&G Agarose)，再進(jìn)行Co-IP [5 μg anti-FLAG抗體(Sigma)和20 μL Protein A&G Agarose]，最后用標(biāo)簽抗體anti-FLAG和anti-Myc進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。

1.4.2 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)分析 為了進(jìn)一步在哺乳動(dòng)物細(xì)胞水平確定和YWHAE互作的CagA區(qū)段，進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)分析[13]CagA候選區(qū)段(N段和C段)與YWHAE互作對(duì)細(xì)胞NF-κB激活的影響。

上調(diào)細(xì)胞YWHAE表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)：選用AGS細(xì)胞(1.5×105個(gè)/組)，用FuGENE○R6 Transfection Reagent，共轉(zhuǎn)染YWHAE表達(dá)載體(0.75 μg)，和CagA-C表達(dá)載體(0.25 μg)或CagA-N表達(dá)載體(0.75 μg)，以及pNF-κB-luc (0.2 μg，報(bào)告質(zhì)粒)和 pRL-TK (0.02 μg，內(nèi)參質(zhì)粒，平衡轉(zhuǎn)染效率)，并用Herring sperm DNA平衡DNA總量，對(duì)照設(shè)置參照“Co-IP檢測(cè)”。轉(zhuǎn)染后48 h，收獲細(xì)胞，用the Dual-Luciferase Reporter Assay System 試劑盒檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶及海腎熒光素酶活性，并分析。

下調(diào)細(xì)胞YWHAE表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)：選用AGS-siYWHAE細(xì)胞(1.5×105個(gè)/組；AGS-siNC細(xì)胞為對(duì)照)，共轉(zhuǎn)染CagA-C或CagA-N表達(dá)載體(pcDNA3.1+FLAG為對(duì)照)，以及pNF-κB-Luc和pRL-TK(各質(zhì)粒劑量同“上調(diào)”方案)。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)染CagA蛋白(CagA-Full，0.25 μg)表達(dá)載體組的平行對(duì)照。轉(zhuǎn)染后48 h，收獲細(xì)胞，檢測(cè)并分析。

2 結(jié) 果

2.1 酵母細(xì)胞水平確定與YWHAE互作的CagA區(qū)段

2.1.1 CagA分段蛋白在酵母細(xì)胞中表達(dá) 成功構(gòu)建的pGBKT7-cagA-N、pGBKT7-cagA-M、pGBKT7-cagA-(N+M)和pGBKT7-cagA-C重組質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化AH109酵母菌株，經(jīng)Western Blot檢測(cè)，證明CagA分段蛋白基因在AH109中能相應(yīng)表達(dá)(圖1-A和B)。

A: CagA分段模式圖 B: Western Blot檢測(cè)圖1 Western Blot檢測(cè)CagA分段基因在酵母AH109中的表達(dá)Fig.1 Western Blot analysis of fragments of the CagA gene in AH109

2.1.2 酵母雙雜交檢測(cè)確定互作的CagA區(qū)段 經(jīng)濾紙法定性檢測(cè)酵母轉(zhuǎn)化子胞內(nèi)β-gal活性，AH109[pGBKT7-cagA]、AH109[pGBKT7-cagA-N]、AH109[pGBKT7-cagA-M]、AH109[pGBKT7-cagA-(N+M)]和AH109[pGBKT7-cagA-C]與陰性對(duì)照AH109[pGBKT7-lam]和AH109[pGBKT7]在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)均始終呈無(wú)色，證明CagA-N、CagA-M、CagA-(N+M)、CagA-C蛋白與CagA蛋白一樣，不會(huì)反式激活GAL4反應(yīng)元件(圖2 A)，可進(jìn)行后續(xù)的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。

A：濾紙法定性檢測(cè)：* AH109[pCL1]為陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)液加入1h即呈現(xiàn)藍(lán)色；** AH109[pGBKT7-lam]和AH109[pGBKT7]為陰性對(duì)照，檢測(cè)液加入8h始終呈無(wú)色；AH109[pGBKT7-cagA-N]、AH109[pGBKT7-cagA-M]、AH109[pGBKT7-cagA-(N+M)]和AH109[pGBKT7-cagA-C]，與AH109[pGBKT7-cagA]一樣，檢測(cè)液加入8 h始終均呈無(wú)色。B：液相分析法定量檢測(cè)：*與Y187[pGADT7]×AH109[pGBKT7]相比，P<0.01。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，n=5。圖2 β-gal活性檢測(cè)與YWHAE互作的CagA區(qū)段Fig.2 β-Galactosidase assays of the CagA fragments interacting with YWHAE

進(jìn)而，采用液相分析法定量檢測(cè)各雜交組酵母二倍體胞內(nèi)β-gal活性，結(jié)果顯示，Y187[pGADT7-YWHAE]×AH109[pGBKT7-cagA-N](t=23.19，P<0.001)， Y187[pGADT7-YWHAE]×AH109[pGBKT7-cagA-(N+M)](P<0.001)和Y187[pGADT7-YWHAE]×AH109[pGBKT7-cagA-C](t=13.955,P<0.001)，與 Y187[pGADT7-YWHAE]×AH109[pGBKT7-cagA](t=9.767,P<0.001)一樣，都高于陰性對(duì)照組Y187[pGADT7]×AH109[pGBKT7]，而Y187[pGADT7-YWHAE]×AH109[pGBKT7-cagA-M]與陰性對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在CagA與YWHAE蛋白相互作用中，CagA蛋白的N(1-254aa)段和C(aa 871-1146)段均參與其中。

2.2 哺乳動(dòng)物細(xì)胞水平確定與YWHAE互作的CagA區(qū)段

2.2.1 Co-IP檢測(cè)確定CagA互作區(qū)段 為了進(jìn)一步確定和YWHAE互作的CagA區(qū)段，將CagA分段蛋白的表達(dá)質(zhì)粒各自與YWHAE的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，用anti-FLAG抗體和Protein A&G Agarose進(jìn)行Co-IP，結(jié)果顯示CagA-N和CagA-C蛋白均與完整的CagA蛋白一樣，可將過(guò)表達(dá)的外源性YWHAE蛋白沉淀，而CagA-M蛋白則無(wú)法沉淀(見(jiàn)圖3)。證明，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)CagA的 N段和C段是與YWHAE發(fā)生互作的區(qū)段。

2.2.2 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)分析確定CagA互作區(qū)段 為進(jìn)一步確定和YWHAE互作的CagA區(qū)段，檢測(cè)CagA-C、CagA-N對(duì)經(jīng)YWHAE介導(dǎo)激活細(xì)胞NF-κB的影響。

共轉(zhuǎn)染YWHAE表達(dá)載體和CagA分段蛋白CagA-C或CagA-N表達(dá)載體(CagA全長(zhǎng)蛋白，即CagA-Full表達(dá)載體組，為陽(yáng)性對(duì)照)，以及pNF-κB-Luc載體，用螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè)評(píng)價(jià)CagA-C、CagA-N分別與YWHAE相互作用對(duì)NF-κB的影響。結(jié)果顯示(圖4A)，CagA分段蛋白CagA-C或CagA-N組的結(jié)果和CagA-Full陽(yáng)性對(duì)照組的結(jié)果類(lèi)似，即，當(dāng)CagA分段“C”、“N”各組單轉(zhuǎn)染CagA-C或CagA-N表達(dá)載體時(shí)，分別可見(jiàn)NF-κB活性增高(與空載體對(duì)照相比，tC=3.676，P=0.021；tN=4.392，P=0.012)；當(dāng)CagA分段“C”、“N””各組單轉(zhuǎn)染YWHAE表達(dá)載體時(shí)，可見(jiàn)NF-κB活性也增高(與空載體對(duì)照相比，tC=6.046，P=0.004；tN=7.81，P=0.001)；當(dāng)CagA分段“C”、“N”各組共轉(zhuǎn)染YWHAE表達(dá)載體和CagA-C或CagA-N表達(dá)載體時(shí)，NF-κB活性也增高(與空載體對(duì)照相比，tC=17.595，P<0.001；tN=12.44，P<0.001)，且均高于各自單轉(zhuǎn)染CagA-C(t=13.267，P<0.001)或YWHAE表達(dá)載體組(t=8.308，P=0.001)，CagA-N(t=28.238，P<0.001) 或YWHAE表達(dá)載體組(t=10.683，P<0.001)。

同時(shí)，當(dāng)慢病毒介導(dǎo)的siRNA下調(diào)內(nèi)源性YWHAE表達(dá)時(shí)(圖4B)，轉(zhuǎn)染CagA-C或CagA-N表達(dá)載體，NF-κB活性均無(wú)增高，與轉(zhuǎn)染CagA-Full表達(dá)載體組(t=2.18，P=0.081)，即陽(yáng)性對(duì)照組的結(jié)果一致。相對(duì)應(yīng)的，當(dāng)維持內(nèi)源性YWHAE表達(dá)水平時(shí)，與空載體對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染CagA-C(t=4.394，P=0.007)、CagA-N(t=3.209，P=0.024) 或CagA-Full(t=4.816，P=0.005)表達(dá)載體，各自NF-κB活性均增高。

證明CagA-C、CagA-N與YWHAE相互作用可激活NF-κB，確定CagA可通過(guò)CagA-C、CagA-N段與YWHAE相互作用。

CagA各分段蛋白和YWHAE表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞，將共轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解，用anti-FLAG抗體進(jìn)行免疫沉淀，借助anti-FLAG或anti-Myc抗體進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。圖3 免疫共沉淀檢測(cè)Fig.3 Co-IP assays

A: YWHAE表達(dá)上調(diào)增強(qiáng)CagA-C、CagA-N對(duì)NF-κB的激活: 采用AGS細(xì)胞，共轉(zhuǎn)染YWHAE(Myc標(biāo)簽)和CagA分段蛋白(CagA-C或CagA-N，CagA-Full為陽(yáng)性對(duì)照；Flag標(biāo)簽)表達(dá)載體，以及pNF-κB-Luc(報(bào)告載體)和pRL-TK(用于平衡轉(zhuǎn)染效率)?？蛰d體共轉(zhuǎn)染組作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染48 h后，收獲細(xì)胞，檢測(cè)相對(duì)熒光素酶的活性。B: YWHAE表達(dá)下調(diào)抑制CagA-C、CagA-N對(duì)NF-κB的激活: 采用AGS-siYWHAE細(xì)胞(AGS-siNC細(xì)胞為對(duì)照)，共轉(zhuǎn)染CagA分段蛋白(CagA-C或CagA-N，CagA-Full為陽(yáng)性對(duì)照；Flag標(biāo)簽)表達(dá)載體，以及pNF-κB-Luc和pRL-TK?？蛰d體共轉(zhuǎn)染組作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染48 h后，收獲細(xì)胞，檢測(cè)相對(duì)熒光素酶的活性。* P< 0.05，與對(duì)應(yīng)的空載體對(duì)照組相比；# P< 0.01，與對(duì)應(yīng)的“CagA fragment-YWHAE”組相比。配對(duì)t檢驗(yàn)，n≥5。圖4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)Fig.4 Dual luciferase reporter assays

3 討 論

蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)較多，包括酵母雙雜交、免疫共沉淀、GST pull-down、免疫熒光共定位、蛋白質(zhì)芯片、串聯(lián)親和純化等，不同技術(shù)有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)。本研究致力于檢測(cè)鑒定與YWHAE相互作用的CagA區(qū)段，吸取不同技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，從不同細(xì)胞水平開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。

本研究中，首先選用酵母細(xì)胞水平進(jìn)行初篩，其具有諸多優(yōu)勢(shì)，酵母細(xì)胞具真核細(xì)胞的屬性，接近體內(nèi)環(huán)境，相對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其培養(yǎng)簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)；不需蛋白抽提、純化等繁瑣操作；同時(shí)不需吸附、洗滌步驟，相對(duì)信號(hào)衰減少，提升了檢測(cè)的靈敏性。酵母雙雜交通常經(jīng)檢測(cè)細(xì)胞β-gal活性來(lái)判斷蛋白相互作用，可檢測(cè)基因表達(dá)產(chǎn)物相互作用的累積效應(yīng)，可測(cè)獲暫時(shí)或微弱的蛋白相互作用，常用方法包括瓊脂平板法、濾紙法和液相法等。前2種方法多用于大規(guī)模篩查，屬定性檢測(cè)；后1種方法常用于小規(guī)模樣品檢測(cè)，屬定量檢測(cè)。本研究選用液相法，一方面是因?yàn)楸狙芯酷槍?duì)YWHAE與CagA區(qū)段的互作檢測(cè)，樣品數(shù)量少；另一方面是因?yàn)橐合喾?儀器檢測(cè)，定量)較濾紙法(肉眼判斷，定性)更為客觀、靈敏，與瓊脂平板法相比也更敏感。通過(guò)液相法篩查，本研究發(fā)現(xiàn)CagA蛋白的N端與C端均存在與YWHAE相互作用的區(qū)段，此同CagA與SHP1、TAK1的互作模式[3]存在相似。

本研究雖然在酵母水平檢測(cè)到了與YWHAE互作的CagA蛋白區(qū)段，但酵母細(xì)胞內(nèi)蛋白的翻譯后加工修飾體系與哺乳動(dòng)物細(xì)胞存在差異，哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的互作檢測(cè)更接近人體內(nèi)的情況。因此，本研究進(jìn)一步采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)對(duì)酵母系統(tǒng)篩查的結(jié)果進(jìn)行鑒定。先通過(guò)經(jīng)典的Co-IP實(shí)驗(yàn)，將CagA蛋白區(qū)段與YWHAE分別進(jìn)行一對(duì)一互作鑒定。在該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中選用了Cos-7細(xì)胞，其源于經(jīng)病毒SV40(起始失活突變)基因轉(zhuǎn)化的非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞系，能表達(dá)SV40的T抗原，任何含SV40復(fù)制起點(diǎn)的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，如本研究中選用的pcDNA3.1載體質(zhì)粒，均能以高拷貝數(shù)進(jìn)行復(fù)制，確保了外源目的蛋白的高效表達(dá)。本研究借助pcDNA3.1質(zhì)粒與Cos-7細(xì)胞的組合，順利開(kāi)展了Co-IP實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了CagA蛋白的N、C兩端均與YWHAE存在相互作用。

但Cos-7細(xì)胞，與幽門(mén)螺桿菌感染的環(huán)境還是存在差距，因此，本研究進(jìn)一步選用了AGS細(xì)胞，一種常用的人胃腺癌細(xì)胞系，進(jìn)行功能檢測(cè)驗(yàn)證。通過(guò)共轉(zhuǎn)染含有5個(gè)NF-κB結(jié)合位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列的螢火蟲(chóng)熒光素酶基因報(bào)告質(zhì)粒(pNF-κB-luc)[13]，使細(xì)胞NF-κB活化效應(yīng)得以放大，提高了檢測(cè)效率，最終證實(shí)，在AGS細(xì)胞內(nèi)CagA的N、C兩區(qū)段均可經(jīng)YWHAE介導(dǎo)激活細(xì)胞NF-κB，具有類(lèi)似CagA全長(zhǎng)與YWHAE互作的細(xì)胞功能[9]，從功能上驗(yàn)證了CagA的N、C兩端均可分別與YWHAE互作。

綜上所述，本研究充分利用不同的蛋白相互作用研究方法，借助不同表達(dá)檢測(cè)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)，從多角度探明CagA通過(guò)其C-末端的“C區(qū)段”和N-末端的“N區(qū)段”與YWHAE相互作用，將有助于進(jìn)一步闡明CagA與YWHAE互作的功能效應(yīng)、深入揭示幽門(mén)螺桿菌CagA的致癌機(jī)制。而關(guān)于CagA的“C區(qū)段”和 “N區(qū)段”，能否單獨(dú)或組合替代CagA全長(zhǎng)蛋白成為抗癌機(jī)制研究的靶點(diǎn)，還有待進(jìn)一步的探究。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：張曉艷，溫春燕，陳豪，等. 幽門(mén)螺桿菌CagA與YWHAE互作區(qū)段的確定[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(11)：975-981. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.126