侯寶華，范東瀛，高 娜，陳 輝，2，安 靜，3

登革病毒(Dengue virus，DENV)隸屬于黃病毒科黃病毒屬，主要由埃及伊蚊和白紋伊蚊進(jìn)行傳播，在熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛分布。DENV包含4種血清型(DENV1-4)，每種血清型均可導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床疾病，其引起的登革熱被WHO列為疾病負(fù)擔(dān)增長最快的病種之一，因而亟需安全有效的疫苗用于登革熱的特異性防控[1]。

DENV為有包膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長約11 kb，可編碼衣殼蛋白(capcid protein，C)、前膜蛋白(precursor membrane protein, prM)、包膜蛋白(envelope protein，E)3種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structural protein，NS)。其中E蛋白為病毒吸附蛋白，在病毒入侵宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮著重要作用，prM蛋白為E蛋白成熟所必需。prM和E蛋白經(jīng)抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cell，APC)攝取加工并由MHC-Ⅱ分子遞呈給B細(xì)胞后，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體；另外，E蛋白含有T細(xì)胞表位，可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，清除胞內(nèi)病毒。因此，prM和E蛋白是登革熱疫苗研發(fā)的主要靶抗原[2-3]。

mRNA疫苗是一種相對(duì)新型的疫苗研發(fā)技術(shù)，與傳統(tǒng)疫苗相比，具有很多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：首先，沒有外源性DNA整合于宿主細(xì)胞基因組的潛在風(fēng)險(xiǎn)，安全性好；其次，制備方法通用且與靶標(biāo)無關(guān)，單一的 mRNA 疫苗可編碼多種抗原，能以單一配方靶向多種微生物或病毒變體；再次，以無細(xì)胞方式制造，生產(chǎn)快速、可擴(kuò)展，具有成本效益。

由于mRNA穩(wěn)定性差、極易被降解，且引起細(xì)胞過度的免疫反應(yīng)，早期其應(yīng)用未得到推廣[4]。近年來，隨著對(duì)mRNA藥理學(xué)、遞送載體和免疫原性的控制等方面的深入研究，基于mRNA的治療手段日趨成熟[5]。目前已有2種mRNA疫苗獲得FDA緊急授權(quán)使用。其中，新冠肺炎BNT162b2 mRNA疫苗免疫2劑后4個(gè)月內(nèi)的保護(hù)效力保持在90%以上，表明其高效性[6]。我國艾博生物、軍科院、沃森生物共同研制的新冠肺炎mRNA疫苗也已處于三期臨床試驗(yàn)階段[7]。

mRNA疫苗采用多種技術(shù)手段提升免疫效力。在體外合成mRNA的過程中，模擬天然真核mRNA結(jié)構(gòu)在mRNA序列內(nèi)引入5′端帽結(jié)構(gòu)、5′端非編碼區(qū)(5′UTR)、3′UTR、多聚腺苷酸(poly(A))尾、修飾核苷等元素，是防止mRNA疫苗降解、提高轉(zhuǎn)譯效果的重要手段[8]。此外，mRNA無法以自由擴(kuò)散的方式穿過細(xì)胞膜，因而高效的遞送載體是降低mRNA降解、提高轉(zhuǎn)染效率的重要技術(shù)保障。mRNA的遞送載體有脂質(zhì)納米顆粒(lipid nanoparticle，LNP)、聚合物納米顆粒、富含精氨酸的蛋白肽、病毒樣復(fù)制子顆粒和陽離子納米乳液等[9]。其中，LNP中的親水基團(tuán)將mRNA包裹于核心位置，保護(hù)其不被核酸酶降解；同時(shí)，其脂質(zhì)成分易與宿主細(xì)胞膜融合，進(jìn)而以內(nèi)吞的方式將mRNA傳遞至胞內(nèi)，提高轉(zhuǎn)染效率，因此在臨床上的應(yīng)用最廣泛[10]。

本研究選擇DENV1的prM、E序列作為靶基因，探索設(shè)計(jì)登革熱mRNA候選疫苗；利用LNP作為遞送載體，通過免疫C57BL/6小鼠，評(píng)價(jià)其免疫原性，并通過DENV1攻毒實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其特異性保護(hù)效應(yīng)，以期為登革熱疫苗研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 毒株 DENV1 Hawaii株(GenBank序列號(hào)：EU848545)由廣東省疾病預(yù)防控制中心惠贈(zèng)，以C6/36細(xì)胞增殖，空斑法利用Vero細(xì)胞檢測病毒滴度。

1.1.2 動(dòng)物 6～8周齡雌性近交系C57BL/ 6小鼠(SPF級(jí))購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于感染動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立通氣籠。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵從《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，并由首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理編號(hào)：AEEI-2019-050)。

1.1.3 質(zhì)粒 含DENV1目的基因prME的重組質(zhì)粒pVAX1-D1ME由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，目的基因D1ME為EU848545的438 bp到2 420 bp，長度1 983 bp。

1.2 方 法

1.2.1 mRNA體外合成

1.2.1.1 體外合成mRNA模板質(zhì)粒制備 選用pUC57-Kan克隆質(zhì)粒為載體，用EcoRI和BamHI限制性內(nèi)切酶將體外合成mRNA所需元件克隆至其lacZa操縱子內(nèi)，依次為T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子、5′UTR、kozak序列、IgE信號(hào)肽、3′UTR(源自α1珠蛋白基因)。隨后，用引物對(duì)1(引物序列見表1)在IgE信號(hào)肽和3′UTR之間將質(zhì)粒載體線性化，用引物對(duì)2將pVAX1重組質(zhì)粒中的目的基因D1ME線性化，并在其兩端引入線性化載體末端同源序列。最后，在一步法快速克隆試劑盒(Yeasen Biotech，中國)的重組酶催化下重組目的片段和載體，完成目的基因到IgE信號(hào)肽和3′UTR之間的克隆，將攜帶目的基因的重組質(zhì)粒命名為pUCK-D1ME(圖1)。用通用引物M13-F、M13-R對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定。

表1 構(gòu)建pUCK-D1ME及體外合成mRNA所用引物Tab.1 Sequences of primers used in the construction of the pUCK-D1ME plasmid and in vitro synthesis of mRNA

注：①～⑥為體外合成mRNA所需元件；a1a2～d1d2為各引物序列所處位置。圖1 pUCK-D1ME克隆質(zhì)粒組成元件Fig.1 Components of the pUCK-D1ME plasmid

1.2.1.2 模板質(zhì)粒擴(kuò)增、提取 以42 ℃熱激法將pUCK-D1ME質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)，以卡那霉素篩選陽性菌落，以引物對(duì)3進(jìn)行PCR鑒定后，用NucleoBond Xtra Maxi試劑盒(MACHEREY-NAGEL，德國)以堿裂解法提取、純化菌液中的重組質(zhì)粒，以進(jìn)行mRNA的后續(xù)制備。

1.2.1.3 體外合成mRNA 以pUCK-D1ME質(zhì)粒為模板，用高保真DNA聚合酶(TaKaRa，日本)、引物對(duì)3擴(kuò)增體外轉(zhuǎn)錄(invitrotranscription，IVT)所需的線性化模板。瓊脂糖凝膠電泳后，用硅膠膜膠回收試劑盒(promega，美國)回收線性化模板，用20 μL無核酸酶水洗脫。在IVT試劑盒(NEB，美國)中的T7 RNA聚合酶作用下將此模板轉(zhuǎn)錄為RNA，其中UTP全部用假尿嘧啶核苷酸(TriLink Biotechnologies，美國)替代，以降低RNA自身的免疫原性，37 ℃溫育2 h；用DNaseⅠ(NEB，美國)將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的DNA模板降解，37 ℃溫育15 min；向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中加入LiCl，使其終濃度為2.5 mol/L，-30 ℃沉淀1 h，4 ℃、16 000× g離心30 min使RNA沉淀，用1 mL 70%乙醇將RNA清洗1次，4 ℃、16 000×g離心4 min，最后用DEPC處理水溶解RNA，將產(chǎn)物命名為IVT-D1ME。

用牛痘病毒加帽酶(NEB，美國)、mRNA帽結(jié)構(gòu)2′-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(NEB，美國)在RNA 5′端加入cap1帽結(jié)構(gòu)(m7Gpppm2′NpNp)，37 ℃溫育1 h，經(jīng)LiCl沉淀后用DEPC處理水溶解。用E.colipoly(A)聚合酶(NEB，美國)在RNA 3′端加入100個(gè)左右的腺嘌呤核糖核苷酸以形成poly(A)尾，37 ℃溫育30 min，經(jīng)LiCl沉淀后用DEPC處理水溶解。將體外合成的mRNA命名為D1ME-mRNA。

1.2.2 LNP制備及mRNA包裹 以無水乙醇作為乳化劑，按照50∶10∶38.5∶1.5的濃度比溶解陽離子脂質(zhì)體D-Lin-MC3-DMA(Medchemexpress，美國)、二硬脂酰基磷脂酰膽堿(DSPC，Avanti Polar Lipids，美國)、膽固醇(Sigma，美國)、二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000(DMG-PEG2000，Avanti Polar Lipids，美國)4種脂質(zhì)，混勻后以10 μL/次的速度將其緩慢加入50 mmol、pH=4.0的檸檬酸鹽緩沖液中，充分?jǐn)嚢枋蛊渥匀蝗榛寥榛褐幸掖嫉捏w積分?jǐn)?shù)為30%。隨后在密閉的擠出器(Avestin LF1，Canada)中用80 nm的濾膜反復(fù)擠出水合后的脂質(zhì)溶液約20次，使其納米化，制備LNP。

同樣方法將D1ME-mRNA加入含乙醇的檸檬酸鹽緩沖液，并加入LNP中充分?jǐn)嚢?，至mRNA與脂質(zhì)的質(zhì)量比為0.05。42 ℃溫育1 h，使mRNA與LNP中的D-Lin-MC3-DMA通過電荷間的相互作用力充分結(jié)合，從而被包裹進(jìn)LNP中，命名為D1ME mRNA-LNP。PBS中透析過夜，用超濾管濃縮，經(jīng)0.45 μm的濾膜除菌后儲(chǔ)存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測mRNA表達(dá) 利用2 μL lipo2000(invitrogen，美國)將500 ng mRNA轉(zhuǎn)染至2×105個(gè)HEK293T細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。PBS清洗轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用破膜固定劑固定、通透；1∶3稀釋的4G2雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為一抗，4 ℃孵育30 min；洗液清洗后，1∶1 000稀釋的AF488標(biāo)記的驢抗鼠IgG(Abcam，英國)作為二抗，4 ℃避光孵育30 min，PBS清洗及重懸，在DxFLEX流式細(xì)胞儀(Beckman，美國)中計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞。

1.2.4 免疫熒光檢測mRNA表達(dá) 利用2 μL lipo2000將500 ng mRNA轉(zhuǎn)染至24孔板內(nèi)的Vero細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。PBS清洗細(xì)胞后，4%多聚甲醛室溫固定15 min；清洗后，0.3% Triton X-100室溫通透5 min；清洗后，3%牛血清白蛋白液室溫封閉1 h；清洗后，1∶3稀釋的4G2雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為一抗，4 ℃孵育過夜；PBS清洗后，1∶1 000稀釋AF488標(biāo)記的驢抗鼠IgG作為二抗，室溫避光孵育1 h；PBS清洗后，1∶1 000稀釋DAPI熒光封片劑(中杉金橋，中國)，室溫避光孵育5 min，置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 LNP粒徑分析 使用經(jīng)0.22 μm濾器抽濾的0.1 mmol/L PBS稀釋LNP，加入四通光的石英比色皿中，終濃度最低為0.1 mg/mL，在Zeta電位及粒度分析儀(Brookhaven PALS 90plus，美國)中用動(dòng)態(tài)光散射的方法檢測室溫時(shí)90°檢測角上的流體力學(xué)直徑。同一樣本重復(fù)測量3次。

1.2.6 包封率檢測 用含有1% Triton X-100的TE緩沖液破壞含有0.5 μg D1ME-mRNA的LNP，RNA濃度為1 μg/mL，42 ℃溫育15 min，作為A組；取同劑量D1ME-mRNA LNP用TE緩沖液稀釋至1 μg/mL，42 ℃溫育15 min，作為B組。在96孔板中梯度稀釋1 μg/mL、500 ng/mL及100 ng/mL 3個(gè)稀釋度，每孔加入100 μL 200倍稀釋的RiboGreen RNA染料(invitrogen，美國)，混勻，室溫避光孵育5 min。在化學(xué)發(fā)光儀上檢測各稀釋度的樣本經(jīng)480 nm激發(fā)光激發(fā)后在520 nm波長下的熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各孔對(duì)應(yīng)的mRNA濃度，包封率(%)=(mRNAA-mRNAB)/mRNAA×100%。

1.2.7 小鼠免疫及取材 免疫時(shí)，向小鼠雙后肢股四頭肌注射(Intramuscular，i.m.)共10 μg D1ME mRNA-LNP候選疫苗，對(duì)照組小鼠注射同劑量LNP；于首次免疫后3周進(jìn)行加強(qiáng)免疫，于末次免疫后2周取脾、末次免疫后3周取血以評(píng)價(jià)疫苗免疫原性，于末次免疫后3周進(jìn)行動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)以評(píng)價(jià)疫苗保護(hù)性。

1.2.8 噬斑減少中和試驗(yàn)(plaque reduction neutralization test，PRNT)檢測血清DENV1中和抗體(neutralizing antibody，NAb) 將Vero細(xì)胞傳代至24孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過夜。血清經(jīng)56 ℃溫育30 min滅活補(bǔ)體后，用含2%胎牛血清的MEM維持液進(jìn)行2倍比稀釋；向血清稀釋液中加入等體積DENV1稀釋液，每孔150噬斑形成單位(plaque-forming unit，PFU)，37 ℃溫育1 h；用MEM維持液清洗細(xì)胞后，每孔加入200 μL血清病毒混合液，37 ℃感染1 h；每孔加入3 mL 1.05%甲基纖維素-MEM覆蓋培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)至噬斑形成；拍凈培養(yǎng)基后，以飽和結(jié)晶紫染液室溫染色30 min，流水洗凈后自然干燥。計(jì)數(shù)噬斑數(shù)目，以樣本孔比37 ℃孔噬斑數(shù)量減少50%的最大稀釋度計(jì)算效價(jià)，將每個(gè)樣本的原孔及復(fù)孔效價(jià)的幾何平均滴度記為該樣本的NAb效價(jià)，即PRNT50。

1.2.9 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)檢測脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子 根據(jù)試劑說明書，將捕獲抗體加入已潤濕ELISPOT板(BD，美國)中，4 ℃包被過夜；脫椎處死小鼠后，無菌取小鼠脾臟，分離脾淋巴細(xì)胞(達(dá)科為，中國)、裂解紅細(xì)胞(BD，美國)以制備脾淋巴細(xì)胞懸液；用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基封閉非特異位點(diǎn)后，每孔加入4×105～1×106個(gè)細(xì)胞，以DENV1 Hawaii株prME區(qū)域細(xì)胞表位的相應(yīng)肽段為刺激物，每條肽段的終濃度為5 μg/mL，以不加刺激物的細(xì)胞為陰性對(duì)照，37 ℃、5% CO2、99%濕度孵育48 h。充分清洗后，加入生物素化檢測抗體(BD，美國)，室溫孵育2 h；充分清洗后，加入HRP酶標(biāo)親和素(BD，美國)，室溫孵育1 h；充分清洗后，加入底物3-氨基-9-乙基咔唑(BD，美國)，室溫孵育至出現(xiàn)肉眼可見斑點(diǎn)后吸出顯色液，終止顯色過程；充分清洗、自然晾干后，使用自動(dòng)酶聯(lián)斑點(diǎn)圖像分析儀(Cellular Technology Ltd.，美國)進(jìn)行計(jì)數(shù)，以每2×105個(gè)脾細(xì)胞產(chǎn)生的斑點(diǎn)形成單位(spot forming unit，SFU)表示。

1.2.10 保護(hù)性實(shí)驗(yàn) 末次免疫C57BL/6小鼠后3周，用二段針于小鼠顱骨骨縫處向顱內(nèi)注射(Intracerebral，i.c.)1×106PFU的DENV1液，連續(xù)觀察攻毒后21 d小鼠的發(fā)病情況，并記錄體重，以其占初始體重的百分比計(jì)算體重變化幅度。

1.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。體重變化數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析，疫苗免疫與時(shí)間變量之間無交互效應(yīng)；PRNT及ELISPOT實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 體外合成D1ME-mRNA 將重組質(zhì)粒pUCK-D1ME進(jìn)行測序，結(jié)果表明，目的片段基因序列正確且插入方向無誤。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α菌株內(nèi)，在菌株內(nèi)擴(kuò)增并提取重組質(zhì)粒后，使用PCR法制備IVT的線性化模板。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增片段長度在(2～3) kb，與預(yù)期(2.256 kb)相符(圖2a)。經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄將線性化模板轉(zhuǎn)錄為IVT-D1ME，并給RNA加帽及加尾后合成D1ME-mRNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定mRNA完整性，結(jié)果顯示，大部分mRNA在(2～3) kb，與預(yù)期(2.297 kb)相符(圖2b)。

a. 電泳分離PCR擴(kuò)增的體外轉(zhuǎn)錄模板；b.電泳鑒定D1ME-mRNA完整性。a、b均為普通瓊脂糖凝膠電泳，濃度分別為1%、3%。圖2 瓊脂糖凝膠電泳鑒定體外合成的D1ME-mRNAFig.2 Identification of D1ME-mRNA by agarose gel electrophoresis

2.2 D1ME-mRNA的表達(dá)鑒定

2.2.1 流式細(xì)胞術(shù)鑒定D1ME-mRNA在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá) 為檢測D1ME-mRNA在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測D1ME-mRNA在HEK293T細(xì)胞胞內(nèi)的瞬時(shí)表達(dá)情況。結(jié)果如圖3a，D1ME-mRNA轉(zhuǎn)染組有49%的陽性細(xì)胞，證明D1ME-mRNA可正常表達(dá)目的蛋白prME，并可被4G2抗體識(shí)別并結(jié)合。

2.2.2 間接免疫熒光染色鑒定mRNA在Vero細(xì)胞中的表達(dá) 利用間接免疫熒光染色檢測D1ME-mRNA在Vero細(xì)胞胞內(nèi)的瞬時(shí)表達(dá)情況，結(jié)果如圖3b，D1ME-mRNA組的胞質(zhì)呈現(xiàn)廣泛的綠色熒光，而陰性對(duì)照則無綠色熒光，進(jìn)一步證明D1ME-mRNA可正常表達(dá)目的蛋白prME，并可被4G2抗體識(shí)別并結(jié)合。

2.3 LNP制備及D1ME mRNA-LNP疫苗理化性質(zhì)檢測 用D-Lin-MC3-DMA、DSPC、膽固醇、C14-PEG-2000 4種脂質(zhì)構(gòu)建LNP后，在粒度及Zeta電位分析儀中用動(dòng)態(tài)光散射的方法檢測室溫時(shí)90°檢測角上的流體力學(xué)直徑，采用CONTIN分析模型將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為LNP粒徑正態(tài)分布曲線，結(jié)果顯示，3次檢測的LNP流體力學(xué)直徑在135.85 ～136.64 nm，多分散度(polydispersity)為0.198～0.207(圖3c)。

Triton X-100破壞D1ME mRNA-LNP候選疫苗后，用RNA熒光染料檢測破壞前和破壞后mRNA的含量。經(jīng)計(jì)算可知，LNP包裹D1ME-mRNA的效率為60%。

注：a為流式細(xì)胞術(shù)鑒定D1ME-mRNA在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)；b為間接免疫熒光染色鑒定D1ME-mRNA在Vero細(xì)胞中的表達(dá)；c為粒度及Zeta電位分析儀檢測LNP流體力學(xué)直徑，同一樣本檢測3次。圖3 D1ME-mRNA的表達(dá)鑒定及LNP粒徑檢測Fig.3 Identification of D1ME-mRNA expression and detection of LNP particle size

2.4 D1ME mRNA-LNP候選疫苗的保護(hù)性及免疫原性評(píng)價(jià)

2.4.1 動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 小鼠免疫程序如圖4a，于首次免疫后3周進(jìn)行加強(qiáng)免疫。二次免疫后3周，顱內(nèi)注射攻毒，檢測之后21 d小鼠的體重變化(圖4b)。攻毒后，LNP對(duì)照組小鼠逐漸出現(xiàn)弓背、聳毛、行動(dòng)遲緩等發(fā)病癥狀，隨著時(shí)間延長癥狀逐漸恢復(fù)；疫苗組小鼠無明顯發(fā)病癥狀。LNP對(duì)照組小鼠平均體重在DENV1攻毒后第7 d出現(xiàn)較為明顯下降，第12 d時(shí)平均體重達(dá)到最低值，為攻毒前的88%，個(gè)別小鼠下降幅度達(dá)15%。而D1ME mRNA-LNP候選疫苗組小鼠體重呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，平均體重為攻毒前的91%，顯著小于對(duì)照組。經(jīng)重復(fù)測量方差分析，疫苗組的體重變化與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.716，P=0.049)，說明D1ME mRNA-LNP候選疫苗經(jīng)2劑次10 μg免疫后，可保護(hù)小鼠抵抗DENV1的感染。

2.4.2 血清NAb水平 2次免疫后3周，小鼠血清中抗DENV1 NAb的檢測結(jié)果如圖4c。結(jié)果表明，D1ME mRNA-LNP候選疫苗組小鼠的NAb幾何平均效價(jià)為1∶20，高于對(duì)照組(t=7.319，P<0.001)，說明疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定水平的NAb。

2.4.3 脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5的水平 2次免疫后2周，小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)肽段刺激后產(chǎn)生IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5的水平如圖4 d。結(jié)果表明，D1ME mRNA-LNP候選疫苗組小鼠每2×105個(gè)脾細(xì)胞分泌的IFN-γ平均斑點(diǎn)數(shù)為181，TNF-α平均斑點(diǎn)數(shù)為45.2，IL-4平均斑點(diǎn)數(shù)為14.4，IL-5平均斑點(diǎn)數(shù)為0.36。與對(duì)照組相比，疫苗組IFN-γ(t=5.689,P=0.000 5)、TNF-α的水平明顯升高(t=4.932，P=0.001 1)，而IL-4(t=1.590，P=0.150 6)、IL-5(t=0.057 3，P=0.955 7)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于IFN-γ和TNF-α主要由Th1型細(xì)胞產(chǎn)生，參與誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的細(xì)胞免疫應(yīng)答，IL-4和IL-5主要由Th2型細(xì)胞產(chǎn)生，參與誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的體液免疫應(yīng)答[11]，結(jié)合中和抗體檢測結(jié)果，提示2次免疫D1ME mRNA-LNP候選疫苗更傾向于誘導(dǎo)高水平的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

注：a為小鼠免疫、取材及攻毒流程示意圖；b為攻毒后21 d小鼠體重變化情況(n=6)；c為二次免疫后小鼠血清中抗DENV1 NAb水平(n=5)；d為二次免疫后小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)抗原刺激產(chǎn)生IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5的水平(n=5)。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。圖4 D1ME-LNP候選疫苗在C57BL/6小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)流程及保護(hù)性、免疫原性評(píng)價(jià)Fig.4 In vivo evaluation of immunogenicity and protective effects of the D1ME-LNP vaccine candidate in a C57BL/6 mouse model

3 討 論

目前，已處于臨床試驗(yàn)階段的登革熱疫苗包括滅活疫苗、減毒活疫苗、DNA疫苗及亞單位疫苗等[12]。其中，以黃熱病毒-17D減毒株為骨架、DENV1-4型prM、E序列為靶標(biāo)的嵌合體減毒活疫苗Dengvaxia○R已于2015年在墨西哥上市，并在多個(gè)國家取得許可，但它僅能對(duì)9歲及以上年齡的人群產(chǎn)生較好的保護(hù)效應(yīng)，并且可導(dǎo)致在接種疫苗前DENV血清抗體為陰性的志愿者在感染DENV時(shí)的住院率增高[13-14]。登革熱DNA疫苗TVDV的一期臨床試驗(yàn)表明，其免疫原性不理想，與DNA疫苗免疫原性較低的特性一致[15]。DENV獨(dú)特的抗體依賴性感染增強(qiáng)現(xiàn)象也使登革熱疫苗的研發(fā)處于瓶頸[16-17]。因而仍需開發(fā)更安全、有效的新型登革熱疫苗。

本研究以DENV1 Hawaii株的prM、E序列為靶基因，搭建了非復(fù)制型mRNA疫苗在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上的制造平臺(tái)，通過IVT、加帽及加尾3歩流程在體外合成mRNA，并經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)和間接免疫熒光驗(yàn)證了其在細(xì)胞內(nèi)的高效表達(dá)能力；同時(shí)通過LNP遞送系統(tǒng)，在C57BL/6小鼠模型中評(píng)價(jià)了其2次免疫時(shí)的免疫原性及保護(hù)性。

本研究所搭建的mRNA疫苗制造平臺(tái)較簡單，適合大部分實(shí)驗(yàn)室開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)。首先，在mRNA疫苗的制備過程中，由于mRNA為單鏈且極易被降解，所以在IVT、加帽、加尾過程中應(yīng)盡量減少其凍融，并將制備好的mRNA或中間產(chǎn)物凍存于-80 ℃，以降低可能存在的RNase的活性。另外，在體外合成mRNA時(shí)需嚴(yán)格防范RNase污染，例如在各反應(yīng)體系中加入RNase抑制劑，在超凈臺(tái)等密閉環(huán)境中進(jìn)行操作，使用RNase去污劑去除操作環(huán)境中的RNase以及使用無核酸酶水等。在LNP的制備過程中，按照正確比例配制各脂質(zhì)組分至關(guān)重要，否則將難以形成澄清的脂質(zhì)納米液。

免疫評(píng)價(jià)結(jié)果表明，二次免疫10 μg條件下，D1ME mRNA-LNP候選疫苗可保護(hù)小鼠抵抗DENV1的感染，并誘導(dǎo)有限的體液免疫應(yīng)答、高水平的細(xì)胞免疫應(yīng)答，說明該疫苗提供的免疫保護(hù)作用主要由特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答介導(dǎo)。類似的低體液免疫應(yīng)答也同樣出現(xiàn)在基于RBD-T4f的mRNA疫苗免疫效果中，高或低劑量的復(fù)制型mRNA疫苗和非復(fù)制型mRNA疫苗均沒能誘導(dǎo)高水平的體液免疫，僅聚合物脂質(zhì)納米顆粒包裹的mRNA疫苗以30 μg免疫3次，才誘導(dǎo)滴度為1∶100的中和抗體活性[18]。有研究表明，mRNA疫苗可誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答[19]。mRNA經(jīng)LNP遞送后，以內(nèi)吞形式進(jìn)入胞內(nèi)，表達(dá)的蛋白經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶體降解后形成內(nèi)源性抗原，由MHCⅠ類分子遞呈給CTL，可誘導(dǎo)更強(qiáng)的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答[20-21]。與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)論相符，一項(xiàng)同樣以DENV1prM、E序列為靶基因的mRNA疫苗研究表明，二劑次10 μg該疫苗免疫后可使免疫缺陷小鼠抵抗DENV1的致死性攻擊[22]。

本研究完成了一種新型登革熱mRNA候選疫苗的構(gòu)建和效果的初步評(píng)估，在未來研究中可在LNP組分中引入甘露糖基團(tuán)等靶向修飾以提高mRNA轉(zhuǎn)染效率[23]，進(jìn)一步優(yōu)化這一技術(shù)路線；另外，探究細(xì)胞免疫應(yīng)答在保護(hù)性實(shí)驗(yàn)中的作用也是mRNA疫苗保護(hù)機(jī)制研究中不可缺少的組成部分。我們期望本研究能為登革熱疫苗的研發(fā)提供參考。

本研究獲得上海市公共衛(wèi)生臨床中心轉(zhuǎn)化條線技術(shù)研發(fā)部金俠研究員和張夢(mèng)玲博士提供的技術(shù)指導(dǎo)，在此致以誠摯的謝意。

利益沖突：無

引用本文格式：侯寶華，范東瀛，高娜，等. 基于登革病毒prME序列mRNA候選疫苗的構(gòu)建與評(píng)價(jià)[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(11)：947-955. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.150