崔朋

黃山學(xué)院分析測(cè)試中心 安徽黃山 245041

近年來(lái)，綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)的教學(xué)模式引起諸多學(xué)校的關(guān)注，綜合實(shí)驗(yàn)把多學(xué)科的知識(shí)與技能綜合交叉起來(lái)，有效地將各學(xué)科的實(shí)驗(yàn)操作及數(shù)據(jù)分析融合為一體，接受實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練的學(xué)生可在一次實(shí)驗(yàn)中充分鍛煉提升綜合實(shí)驗(yàn)操作能力。同常規(guī)的專業(yè)實(shí)驗(yàn)對(duì)比，綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)更加注重的是學(xué)生對(duì)基本知識(shí)的掌握和實(shí)驗(yàn)技能的訓(xùn)練操作，以及對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的解析。同時(shí)重點(diǎn)培養(yǎng)學(xué)生在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分析問(wèn)題和解決問(wèn)題以及運(yùn)用已掌握的知識(shí)歸納分析和總結(jié)實(shí)驗(yàn)的能力[1]。所以綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展內(nèi)容囊括經(jīng)典化學(xué)實(shí)驗(yàn)操作的同時(shí)，還應(yīng)該根據(jù)地域及關(guān)注熱點(diǎn)的變化及時(shí)調(diào)整更新，本實(shí)驗(yàn)介紹一個(gè)取材于黃山當(dāng)?shù)匾约t茶為原料開(kāi)展綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)——紅茶發(fā)酵過(guò)程中茶黃素的提取與鑒定分析。

茶黃色素由Roberts發(fā)現(xiàn)，最初單指紅茶中溶于有機(jī)相中呈橙黃色的物質(zhì)，該類物質(zhì)由多酚類及其衍生物在酶等物質(zhì)的作用下氧化縮合而來(lái)，紅茶中茶黃素類的含量一般為1%左右，對(duì)紅茶的色、香、味及品質(zhì)起著重要的作用。近年來(lái)，由于茶黃色素具有多種與人體健康有益的潛在功能，如抗自由基氧化、心血管疾病的防治、降血壓血脂等，因而受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注，成為茶葉品質(zhì)化學(xué)與功能成分的研究熱點(diǎn)。因此，茶黃素的研究受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注[2-3]，使紅茶的品質(zhì)化學(xué)與功能成分研究成為熱點(diǎn)[4]。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)國(guó)標(biāo)推薦方法中的溶劑體系和提取方法對(duì)紅茶中的茶黃素進(jìn)行提取，提取液經(jīng)處理完成后，采用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜，結(jié)合UNIFI數(shù)據(jù)處理篩查軟件對(duì)提取液中的茶黃素進(jìn)行分離鑒定分析。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

熟悉天然產(chǎn)物提取的流程和方法；了解高分辨質(zhì)譜的進(jìn)樣要求、基本原理和一般操作流程；掌握天然產(chǎn)物分離分析的步驟和鑒定方法。

2 實(shí)驗(yàn)原理

2.1 茶黃素的提取

茶黃色素以多酚類物質(zhì)和兒茶素類物質(zhì)為主要成分，還含有氨基酸、黃酮及黃酮醇等。茶黃素是茶色素的主要成分，目前資料顯示有12種組分，其中茶黃色素以多酚類物質(zhì)、兒茶素為主要成分，還含有氨基酸、維生索C、維生素E、維生素A原、黃酮及黃酮醇等。這些主要成分的12種組分，其中茶黃素(Cas：4670-05-7)，茶黃素-3-沒(méi)食子酸酯(Cas：28543-07-9)、茶黃素-3，3’-雙沒(méi)食子酸酯(Cas：30462-35-2)和茶黃素-3’-沒(méi)食子酸酯(Cas：33377-72-9)是四種最主要的茶黃素。本實(shí)驗(yàn)即圍繞上述四種茶黃素物質(zhì)的提取及檢測(cè)開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。因茶黃素均為多羥基化合物，固本體系參照國(guó)標(biāo)同樣采用無(wú)水乙醇和水對(duì)紅茶中的茶黃素化合物進(jìn)行提取，具體提取操作如下所述。稱取0.2g左右的紅茶樣品，將其粉碎后研磨均勻，倒進(jìn)10mL的玻璃刻度試管中，加入預(yù)熱過(guò)的無(wú)水乙醇溶液3.5mL，再加入水1.5mL，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杈鶆驖駶?rùn)，轉(zhuǎn)移到水浴鍋中，將水浴鍋溫度加熱至70℃，浸提10min(隔5min攪拌一次)，浸提后冷卻至室溫，將上清液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中。殘?jiān)儆?.5mL的70℃無(wú)水乙醇溶液和1.5mL水提取一次，合并提取液定容至50mL容量瓶中，搖勻，過(guò)0.25μm膜待測(cè)。

2.2 茶黃素的快速篩查檢測(cè)

高分辨飛行時(shí)間(HR-Tof)質(zhì)譜系統(tǒng)為在構(gòu)建包括蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、天然活性成分、中藥、藥物代謝、糖肽等物質(zhì)的研究中起著非常重要的作用，作為高端技術(shù)平臺(tái)，該系統(tǒng)具有高分辨的定性篩查功能和高靈敏度的準(zhǔn)確定量功能，輔以UNIFI數(shù)據(jù)篩查軟件和自行建立的篩查平臺(tái)，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物準(zhǔn)確有效、快速篩查。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用UNIFI軟件包(UNIFI科學(xué)信息系統(tǒng)，Waters Corp.，MA)建立了一個(gè)信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)。該軟件包融合了超高效液相色譜和飛行時(shí)間質(zhì)譜的操作、質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集、可視化的數(shù)據(jù)分析和使用先前建立的信息中獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。該實(shí)驗(yàn)建立數(shù)據(jù)庫(kù)包含用于在UNIF中自動(dòng)識(shí)別兒茶素的關(guān)鍵檢測(cè)參數(shù)，其中包括每種化合物的理論質(zhì)荷比和碎片離子。實(shí)驗(yàn)前先明確設(shè)置上述參數(shù)，就可以使用UNIFI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)四種目標(biāo)茶黃素進(jìn)行快速篩選和鑒定。

本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相體系采用0.1%的甲酸水溶液和甲醇對(duì)提取樣品進(jìn)行洗脫，經(jīng)優(yōu)化后的質(zhì)譜條件可獲得信號(hào)較好的總離子流圖及紫外信號(hào)圖，如圖1所示，二者具有良好的對(duì)應(yīng)，信號(hào)最強(qiáng)的為咖啡因信號(hào)，前端的信號(hào)主要為兒茶素類化合物，因其極性較大，色譜柱對(duì)該類化合物的保留能力相對(duì)較弱，故出峰較為靠前。在質(zhì)譜總離子流及紫外檢測(cè)器的信號(hào)譜圖中的14.6～15.4min中，紫外圖譜中的四個(gè)檢出信號(hào)(圖1右上所示)即為四種茶黃素類化合物，檢出目標(biāo)物的出峰順序與國(guó)標(biāo)(GB/T 30483-2013)推薦圖譜的信息一致。

以國(guó)標(biāo)推薦的方法為參考對(duì)紅茶的提取液進(jìn)行測(cè)試，質(zhì)譜信號(hào)明顯清晰，隨后將采集的數(shù)據(jù)導(dǎo)入U(xiǎn)NIFI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行篩查，篩查出的一種茶黃素類物質(zhì)如圖2所示。采用上述提取及檢測(cè)處理方式可獲得目標(biāo)化合物的檢測(cè)信號(hào)，其準(zhǔn)分子離子峰、碎片及碎裂方式均可直觀地顯示在一張圖中。

圖2 基于UNIFI篩查數(shù)據(jù)庫(kù)篩查出的3，3'-二沒(méi)食子酸酯茶黃素Fig2 The Theaflavin-3，3-digallate(TF3)screened based on UNIFI database

采用上述方法對(duì)紅茶提取液進(jìn)行檢測(cè)，成功鑒定出了四種茶黃素(因篇幅有限及篩查原理一致，本實(shí)驗(yàn)報(bào)告只展示了圖2一種，本實(shí)驗(yàn)的檢出結(jié)果與文獻(xiàn)資料報(bào)道一致)。由于茶黃素-3-沒(méi)食子酸酯存在異構(gòu)體，無(wú)精準(zhǔn)保留時(shí)間篩查系統(tǒng)無(wú)法精準(zhǔn)識(shí)別二者，因采用的色譜柱類型和洗脫流動(dòng)相體系與國(guó)標(biāo)大致相同，目標(biāo)物的出峰順序應(yīng)與國(guó)標(biāo)一致，最終確定篩查出的四種茶黃素依次是茶黃素、茶黃素-3-沒(méi)食子酸酯、茶黃素-3′-沒(méi)食子酸酯和3，3’-二沒(méi)食子酸酯茶黃素。高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)作為一種高效精準(zhǔn)的方法，在本實(shí)驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)了四種茶黃素的快速鑒定識(shí)別。同理，高分辨質(zhì)譜結(jié)合UNIFI篩查軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)之后也可用于其他目標(biāo)物的快速篩查鑒定。

3 儀器與試劑

儀器：可控溫水浴槽，分析天平，超高效液相串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)配備UNIFI篩查軟件。

試劑：乙醇，水，甲醇，甲酸。

4 實(shí)驗(yàn)步驟

4.1 紅茶中茶黃素的提取

本文參照國(guó)標(biāo)GB/T 30483-2013中茶黃素的提取方法，稱取0.1g均勻碾磨后的茶葉樣品于10mL玻璃離心管中，加入預(yù)熱的甲醇水溶液5mL，震蕩后轉(zhuǎn)移至恒溫?zé)崴≈徐o置浸提10min，隨后冷卻至室溫后采用離心機(jī)離心3min，取上清液移至10mL容量瓶中。殘?jiān)捎蒙鲜鰲l件重復(fù)操作一次，合并提取液并定容至刻度，為防止氧化，提取液震蕩搖勻后盡快取樣稀釋做測(cè)試。

4.2 提取液的質(zhì)譜測(cè)試

洗脫體系實(shí)驗(yàn)采用甲醇及0.1%的甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，洗脫從10%甲醇開(kāi)始，流速為0.3mL/min。溶劑甲醇在13min內(nèi)以線性梯度從10%增加到35%，在35%下保持4min，隨后在13min內(nèi)增加到70%，然后在70%下保持5min。在下一次進(jìn)樣之前，流動(dòng)相在1min內(nèi)重置為10%A，并保持4min以重新平衡系統(tǒng)，進(jìn)樣量1μL，色譜柱為HSS T3色譜柱，柱溫40℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為278nm；四極桿飛行時(shí)間的測(cè)試采用全通過(guò)模式，采集模式為continuum模式，亮氨酸腦啡肽為實(shí)時(shí)校正液(m/z 556.2771)，毛細(xì)管電壓3kV，錐孔電壓40V，質(zhì)荷比(M/Z)測(cè)試范圍為50～1200，離子源溫度120℃，干燥氣溫度450℃，干燥氣流速800L/h，質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集模式為雙通道模式，即MSE模式以利于UNIFI篩查使用。數(shù)據(jù)采集前用70%的甲醇水溶液為空白樣品做測(cè)試，以排除系統(tǒng)殘留及干擾信號(hào)。

4.3 茶黃素的鑒定

首先查閱相關(guān)資料及文獻(xiàn)報(bào)道，采用Chemdraw畫(huà)圖軟件精準(zhǔn)繪制四種茶黃素化合物的結(jié)構(gòu)式，并導(dǎo)入U(xiǎn)NIFI軟件建立篩查信息庫(kù)。提取液經(jīng)超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜在優(yōu)化后的測(cè)試條件下測(cè)試完成后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入至UNIFI數(shù)據(jù)篩查系統(tǒng)，設(shè)置允許誤差±10mDa及信號(hào)最小峰面積等篩查參數(shù)進(jìn)行篩查，篩查結(jié)果見(jiàn)圖2的陳述。

5 注意事項(xiàng)

(1)注意提取液中乙醇和水的比例。

(2)提取過(guò)程中注意搖勻，保證目標(biāo)物提取充分。

(3)提取液冷卻后補(bǔ)充定容并放入冰箱，盡快測(cè)試，防止茶黃素的氧化后信號(hào)減弱。

6 思考題

(1)目前未知物的鑒定與篩查方式有哪些？

(2)查閱相關(guān)資料，總結(jié)高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)的功能與作用。

7 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以黃山本地名茶祁門(mén)紅茶為原料，采用國(guó)標(biāo)推薦的方法對(duì)茶葉中的茶黃素進(jìn)行提取，并采用高分辨飛行時(shí)間(HR-Tof)質(zhì)譜系統(tǒng)，結(jié)合UNIFI篩查軟件對(duì)紅茶提取液中的目標(biāo)物進(jìn)行鑒定分析。本實(shí)驗(yàn)可以讓學(xué)生通過(guò)簡(jiǎn)單的提取獲得紅茶發(fā)酵過(guò)程中的提取液，借助高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定提取液中的茶黃素物質(zhì)，引導(dǎo)學(xué)生了解天然產(chǎn)物的提取鑒定一般流程，領(lǐng)略高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)的魅力，從而激發(fā)學(xué)生對(duì)未來(lái)的知識(shí)學(xué)習(xí)和科學(xué)研究探索的興趣。