王帥宇，張子騰,，謝愛婷，董杰, 楊建國，張愛環(huán)

我國草地貪夜蛾種群殺蟲劑靶標(biāo)基因突變分析

王帥宇1，張子騰1,2，謝愛婷1，董杰1, 楊建國1，張愛環(huán)2

1北京市植物保護(hù)站，北京 100029；2北京農(nóng)學(xué)院生物與資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206

【背景】草地貪夜蛾（）原產(chǎn)于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，是重大遷飛性農(nóng)業(yè)害蟲。2016年以來迅速擴(kuò)散至全球100多個(gè)國家，目前已入侵我國27省（自治區(qū)、直轄市），對糧食安全構(gòu)成極大威脅?；瘜W(xué)防治是草地貪夜蛾的重要應(yīng)急防控措施，經(jīng)過幾年的藥劑防治，草地貪夜蛾的抗藥性可能會發(fā)生變化，進(jìn)而影響防治策略的有效性。其發(fā)生范圍持續(xù)北擴(kuò)，而目前2020—2021年國內(nèi)不同種群及長城防線種群抗藥性現(xiàn)狀以及年度間變化性研究較少?！灸康摹棵鞔_我國不同區(qū)域種群（包括長城防線）的抗藥性現(xiàn)狀與差異，為草地貪夜蛾防控的科學(xué)用藥提供指導(dǎo)?！痉椒ā坎杉?3?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）的草地貪夜蛾田間種群樣本，通過對單頭樣本殺蟲劑靶標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序，分析2020—2021年采自13?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）47市（區(qū)）草地貪夜蛾種群的362頭個(gè)體氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類和雙酰胺類殺蟲劑靶標(biāo)基因的突變情況?！窘Y(jié)果】草地貪夜蛾部分個(gè)體在氨基甲酸酯類藥劑靶標(biāo)乙酰膽堿酯酶（acetylcholine esterase）基因-1上存在突變，種群有6種-1基因型。-1基因檢測到A201S和F290V位點(diǎn)突變；其中A201S均為抗性雜合突變，突變頻率為8.4%；F290V為14.9%的抗性純合突變和25.7%的雜合突變，未檢測到G227A位點(diǎn)突變。重點(diǎn)防范區(qū)F290V位點(diǎn)突變頻率高于遷飛過渡區(qū)和周年繁殖區(qū)，而在A201S位點(diǎn)突變頻率均低于兩區(qū)。長城防線、黃淮海阻截攻堅(jiān)帶、長江流域以及西南華南監(jiān)測防控帶-1基因突變頻率均較高。A201S和F290V突變頻率在2021年均較2020年種群略有下降，但無顯著性差異。擬除蟲菊酯類藥劑靶標(biāo)電壓門控鈉通道（voltage-gated sodium channel）基因和雙酰胺類藥劑靶標(biāo)魚尼丁受體（ryanodine receptor）基因均未檢測到靶標(biāo)基因突變?！窘Y(jié)論】草地貪夜蛾種群氨基甲酸酯類靶標(biāo)基因已發(fā)生較高頻率的突變，說明對氨基甲酸酯類殺蟲劑已產(chǎn)生較高水平的抗藥性，在草地貪夜蛾的防控中應(yīng)盡量減少使用。本研究顯示草地貪夜蛾擬除蟲菊酯類和雙酰胺類殺蟲劑靶標(biāo)基因尚未檢測到突變，這兩類殺蟲劑可與其他作用機(jī)制藥劑科學(xué)輪換用于草地貪夜蛾的防控，鑒于目前已檢測到這兩類藥劑的靶標(biāo)基因突變個(gè)體，以及其國內(nèi)近緣種甜菜夜蛾對這兩類藥劑存在較為普遍的殺蟲劑靶標(biāo)基因突變等情況，今后應(yīng)開展草地貪夜蛾在室內(nèi)外藥劑高選擇壓力下以及寄主變化對主要防控藥劑的靶標(biāo)基因突變的影響，并加快抗藥性快速檢測技術(shù)和產(chǎn)品研究。

草地貪夜蛾；抗藥性；氨基甲酸酯；擬除蟲菊酯；雙酰胺；靶標(biāo)基因；突變頻率

0 引言

【研究意義】草地貪夜蛾（）是重要的農(nóng)業(yè)害蟲，原產(chǎn)于美洲，近年迅速擴(kuò)展到其他國家，并于2018年12月首次入侵我國，目前已在我國27?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）1 338縣（市、區(qū)）發(fā)生危害[1-3]。草地貪夜蛾寄主范圍廣、遷飛和繁殖能力強(qiáng)、危害重，在我國主要危害玉米，但也發(fā)現(xiàn)其在水稻、小麥、花生、高粱等糧食作物上進(jìn)行危害，對我國糧食生產(chǎn)安全構(gòu)成極大威脅[4-5]。20世紀(jì)90年代前，使用化學(xué)殺蟲劑是防控草地貪夜蛾的重要手段，常用藥劑主要是傳統(tǒng)的有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類殺蟲劑，而長期的藥劑選擇壓力及不合理的使用使草地貪夜蛾田間種群對多種藥劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性[6-7]。草地貪夜蛾入侵我國后，化學(xué)防治是主要的應(yīng)急防控措施，開展草地貪夜蛾種群抗性基因突變檢測，對明確草地貪夜蛾對常用藥劑敏感性現(xiàn)狀及科學(xué)防控具有重要指導(dǎo)意義。【前人研究進(jìn)展】目前室內(nèi)毒力及靶標(biāo)基因檢測結(jié)果均表明不同國家（包括原發(fā)地和入侵地）草地貪夜蛾已對41種殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗性。產(chǎn)生抗性的殺蟲劑既包括有機(jī)磷、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯等傳統(tǒng)殺蟲劑，也包括雙酰胺、多殺菌素等新型殺蟲劑[8-12]，部分種群對新型藥劑已產(chǎn)生極高水平抗性[8,13-14]，且雙酰胺類部分藥劑間交互抗性高于40 000倍[15-16]。草地貪夜蛾對殺蟲劑的抗藥性機(jī)制較為復(fù)雜且不斷變化。目前普遍認(rèn)為，草地貪夜蛾對殺蟲劑的抗性機(jī)制主要包括表皮穿透性降低、解毒作用增強(qiáng)和靶標(biāo)敏感型下降。關(guān)于草地貪夜蛾抗性機(jī)理的研究以靶標(biāo)抗性為主[11]。乙酰膽堿酯酶（acetylcholine esterase）基因-1、電壓門控鈉通道（voltage-gated sodium channel）基因和魚尼丁受體（ryanodine receptor）基因分別是氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類和雙酰胺類藥劑的作用靶標(biāo)[9,17-18]，而靶標(biāo)基因上的點(diǎn)突變引起靶標(biāo)敏感性降低導(dǎo)致抗藥性的產(chǎn)生，不同地域種群的突變位點(diǎn)在數(shù)量和頻率上有較大的差異。田間種群氨基甲酸酯類藥劑靶標(biāo)基因突變頻率較高，突變類型主要為A201S、G227A和F290V，但經(jīng)過多年抗性治理以及Bt轉(zhuǎn)基因作物的種植，抗性水平有所下降[18-20]。擬除蟲菊酯類靶標(biāo)基因位點(diǎn)突變在各類害蟲中也有廣泛報(bào)道，突變類型主要為T929I、L932F和L1014F，田間種群抗性基因突變頻率相對較低[19,21]。鱗翅目害蟲的雙酰胺類藥劑靶標(biāo)突變較為普遍，主要為I4734M和G4891E[21-24]，草地貪夜蛾田間種群抗性基因突變頻率也較低。目前國內(nèi)部分種群對3類藥劑抗性基因突變情況與前人研究結(jié)果相近，田間種群以氨基甲酸酯類藥劑靶標(biāo)基因1的突變?yōu)橹?，主要為A201S和F290V突變；目前報(bào)道的數(shù)千頭個(gè)體僅有幾頭檢測到擬除蟲菊酯類藥劑靶標(biāo)基因的T929I、L932F和L1014F突變和雙酰胺類藥劑靶標(biāo)基因的I4734M和G4891E突變，且不同位點(diǎn)突變分別出現(xiàn)在不同個(gè)體中[20,25-30]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】草地貪夜蛾的高繁殖力和強(qiáng)遷飛能力等生物學(xué)特性非常有利于抗性基因的擴(kuò)散[11]，入侵種群對殺蟲劑抗性主要取決于原發(fā)地種群的抗性等位基因頻率和入侵地用藥的選擇壓力以及擴(kuò)散情況[31]。目前國內(nèi)不同地區(qū)采取的防控策略有差異，入侵種群的抗性等位基因和對藥劑敏感性可能會產(chǎn)生變化[6,32-33]。京津冀是草地貪夜蛾長城防線省份和重點(diǎn)區(qū)域，該地區(qū)鱗翅目害蟲常用防控藥劑是擬除蟲菊酯類和雙酰胺類藥劑，經(jīng)過幾年藥劑防治的累積效應(yīng)，草地貪夜蛾的抗藥性可能發(fā)生變化[34]，但目前關(guān)于京津冀地區(qū)和2020年以來國內(nèi)不同種群抗藥性研究報(bào)道較少，長城防線種群與其他區(qū)域種群抗藥性現(xiàn)狀如何，以及是否有差別并不清楚。【擬解決的關(guān)鍵問題】基于此，開展2020—2021年草地貪夜蛾防控帶種群及其他區(qū)域的草地貪夜蛾種群3類殺蟲劑靶標(biāo)基因的突變檢測和分析，旨在明晰草地貪夜蛾種群抗藥性現(xiàn)狀及各區(qū)域抗藥性的差別，為草地貪夜蛾及其他鱗翅目害蟲的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試草地貪夜蛾樣品為2020年8月至2021年10月采自我國13?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）47市（區(qū)）的362個(gè)樣本，幼蟲為田間隨機(jī)采集，成蟲為田間隨機(jī)采集和誘捕器誘集，經(jīng)室內(nèi)形態(tài)檢查確定為草地貪夜蛾后，于-80℃保存，具體采集信息見表1。3個(gè)生態(tài)區(qū)為周年繁殖區(qū)、遷飛過渡區(qū)和重點(diǎn)防范區(qū)，其中周年繁殖區(qū)主要為熱帶和南亞熱帶氣候分布區(qū)；遷飛過渡區(qū)包括中亞熱帶和北亞熱帶氣候分布區(qū)；重點(diǎn)防范區(qū)主要為溫帶氣候區(qū)[32]。4個(gè)防控帶主要包括西南華南監(jiān)測防控帶、長江流域監(jiān)測防控帶、黃淮海阻截攻堅(jiān)帶和長城防線[33-34]。

1.2 靶標(biāo)片段擴(kuò)增

DNA提取：采集的樣本分別采用組織/細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒（北京博邁德基因技術(shù)有限公司）進(jìn)行DNA提取。將單頭蟲體置于培養(yǎng)皿，用滅菌后的剪刀剪取頭部、腹部或足，剪切細(xì)碎后置于離心管，加入30 μL裂解液，用研磨棒充分研磨后，按說明書操作。純化后的DNA經(jīng)過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，選取合適濃度的DNA用于PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增：分別對草地貪夜蛾1、和基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列部分參考Carvalho和Boaventura等[9,17]，和部分引物為本試驗(yàn)設(shè)計(jì)，具體信息見表2。采用2×PCR Mix（北京博邁德基因技術(shù)有限公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系總體積20 μL：DNA模板1 μL，正反向引物各0.5 μL，2×PCR Mix 10 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；每個(gè)循環(huán)95℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增結(jié)束后，使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，選取與目標(biāo)長度一致的單一片段PCR產(chǎn)物送北京博邁德基因技術(shù)有限公司測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Chromas軟件對獲得的基因序列進(jìn)行峰圖分析，確定1、和編碼蛋白在上述位置對應(yīng)核苷酸是否發(fā)生點(diǎn)突變。用Excel記錄統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本的基因型以及每個(gè)種群的突變頻率。靶標(biāo)基因突變頻率（%）= [（抗性純合子個(gè)體數(shù)/檢測總數(shù)）+（抗性雜合子個(gè)體數(shù)/檢測總數(shù)/2）]×100。采用SPSS26.0（IBM，Armonk，NY，USA），通過Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)得出本研究中的頻率數(shù)據(jù)非正態(tài)分布，因此采用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)分析突變間抗性等位基因頻率的差異。

2 結(jié)果

2.1 草地貪夜蛾種群ace-1基因型和突變頻率

2.1.11基因型、突變類型與突變頻率 通過1的特異性引物對草地貪夜蛾樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測，所有擴(kuò)增樣品均得到和預(yù)期片段大小一致的基因片段，長度為760 bp。通過序列比對和峰圖分析發(fā)現(xiàn)，1檢測到A201S和F290V位點(diǎn)突變，未檢測到G227A位點(diǎn)突變。所有種群A201S突變頻率為8.4%，均為雜合突變；F290V突變頻率為40.6%，發(fā)生雜合突變和純合突變，突變頻率分別為25.7%和14.9%。F290V突變頻率明顯高于A201S，且與地域無明顯相關(guān)性。

表1 2020—2021年草地貪夜蛾采集信息

表2 PCR擴(kuò)增ace-1、vgsc和ryr所用引物

對種群的基因型分析發(fā)現(xiàn)，本研究測定的草地貪夜蛾種群的所有個(gè)體共有6種1基因型：（1）1未發(fā)生突變的野生型，占比29.8%；（2）位點(diǎn)雜合突變獨(dú)立發(fā)生，占比38.7%；（3）位點(diǎn)純合突變獨(dú)立發(fā)生，占比14.6%；（4）位點(diǎn)雜合突變獨(dú)立發(fā)生，占比3.9%；（5）位點(diǎn)雜合突變和F290V位點(diǎn)雜合突變同時(shí)發(fā)生，占比12.7%；（6）位點(diǎn)雜合突變和F290V位點(diǎn)純合突變同時(shí)發(fā)生占比極少，僅占0.2%。所有種群1發(fā)生突變的個(gè)體占比（存在A201S或F290V突變）為70.2%，其中2020年和2021年占比分別為72%和68.2%，同時(shí)發(fā)生A201S和F290V位點(diǎn)突變的個(gè)體占比為12.9%（表3）。

2.1.2 不同區(qū)域草地貪夜蛾種群1基因突變分析 不同地理區(qū)域的1基因突變情況顯示，所有地區(qū)種群位點(diǎn)的突變頻率均低于F290V位點(diǎn)的突變頻率。山東種群F290V位點(diǎn)的突變頻率最高，為66.7%，廣西種群F290V位點(diǎn)的突變頻率最低，為16.7%；海南種群A201S位點(diǎn)的突變頻率最高，為25%，廣西種群A201S位點(diǎn)突變頻率最低，未發(fā)生突變（圖1）。

圖1 草地貪夜蛾不同省區(qū)種群ace-1 A201S和F290V突變頻率

表3 2020—2021年草地貪夜蛾不同種群ace-1基因型及突變頻率

SS：敏感型純合子Susceptible homozygote；RS：抗性雜合子Resistant heterozygote；RR：抗性純合子Resistant homozygote

3個(gè)生態(tài)區(qū)的1基因突變結(jié)果表明，重點(diǎn)防范區(qū)草地貪夜蛾種群A201S位點(diǎn)和F290V位點(diǎn)的突變頻率分別為7.9%、44.6%；遷飛過渡區(qū)突變頻率分別為8.4%、34.2%；周年繁殖區(qū)突變頻率分別為9.7%、39.6%。重點(diǎn)防范區(qū)位點(diǎn)突變頻率高于遷飛過渡區(qū)和周年繁殖區(qū)，而在A201S位點(diǎn)突變頻率均低于兩區(qū)（圖2）。

4個(gè)防控帶的1基因突變結(jié)果表明，長城防線種群A201S位點(diǎn)和F290V位點(diǎn)的突變頻率分別為9%、41.6%；黃淮海阻截攻堅(jiān)帶突變頻率分別為6.9%、47%；長江流域監(jiān)測防控帶突變頻率分別為8.9%、34.7%；西南華南監(jiān)測防控帶突變頻率分別為9.1%、39%。長城防線、長江流域以及西南華南監(jiān)測防控帶A201S位點(diǎn)突變頻率相近且較高，黃淮海阻截攻堅(jiān)帶突變頻率較低。長城防線、黃淮海阻截攻堅(jiān)帶F290V位點(diǎn)突變頻率高于長江流域和西南華南監(jiān)測防控帶（圖2）。

2.1.3 不同年份草地貪夜蛾種群-1基因突變分析 2020年和2021年草地貪夜蛾A201S平均突變頻率分別為9.3%和7.5%；F290V平均突變頻率分別為42.1%和39%（表3）。在2020年草地貪夜蛾種群中，四川種群F290V位點(diǎn)的突變頻率最高，為75%，河北種群F290V位點(diǎn)的突變頻率最低，未發(fā)生突變；海南種群A201S位點(diǎn)的突變頻率最高，為25%，河北、四川、廣西種群A201S位點(diǎn)的突變頻率最低，未發(fā)生突變。在2021年草地貪夜蛾種群中，天津種群F290V位點(diǎn)的突變頻率最高，為75%，四川種群F290V位點(diǎn)的突變頻率最低，為16.7%；四川種群A201S位點(diǎn)的突變頻率最高，為16.7%，北京、天津種群A201S位點(diǎn)的突變頻率最低，未發(fā)生突變。

圖2 3個(gè)生態(tài)區(qū)和4個(gè)防控帶的草地貪夜蛾種群ace-1 A201S和F290V突變頻率

2020年長城防線、黃淮海阻截攻堅(jiān)帶、長江流域監(jiān)測防控帶、西南華南監(jiān)測防控帶草地貪夜蛾種群在A201S位點(diǎn)的平均突變頻率分別為14.9%、5.3%、8.3%、9.8%；F290V位點(diǎn)的平均突變頻率分別為37.8%、43.6%、39.8%、46.1%。2021年A201S位點(diǎn)在“四帶”的平均突變頻率分別為4.3%、8.3%、9%、8.7%；F290V位點(diǎn)的平均突變頻率分別為44.6%、50%、27%、28.3%（圖3）。在長城防線A201S位點(diǎn)突變頻率2021年較2020年下降，而F290V位點(diǎn)突變頻率2021年較2020年上升；黃淮海阻截攻堅(jiān)帶A201S和F290V位點(diǎn)突變頻率2021年較2020年上升；長江流域監(jiān)測防控帶和西南華南監(jiān)測防控帶A201S位點(diǎn)兩年間突變頻率無明顯變化，F(xiàn)290V位點(diǎn)突變頻率2021年較2020年有所下降。

2020年重點(diǎn)防范區(qū)、遷飛過渡區(qū)、周年繁殖區(qū)草地貪夜蛾種群在A201S位點(diǎn)的平均突變頻率分別為9.5%、8.3%、9.8%；F290V位點(diǎn)的平均突變頻率分別為41.1%、39.8%、46.1%。2021年A201S位點(diǎn)在3個(gè)區(qū)域的平均突變頻率分別為6.5%、8.5%、9.6%，F(xiàn)290V位點(diǎn)的平均突變頻率分別為47.5%、27.7%、26.9%。重點(diǎn)防范區(qū)A201S位點(diǎn)突變頻率2021年明顯低于2020年，F(xiàn)290V位點(diǎn)突變頻率2021年明顯高于2020年；遷飛過渡區(qū)和周年繁殖區(qū)A201S位點(diǎn)突變頻率2021與2020年較為接近，F(xiàn)290V位點(diǎn)突變頻率2021年的低于2020年。

國內(nèi)不同種群已有測定結(jié)果表明A201S位點(diǎn)突變頻率大多低于10%，最高為18%[35]，F(xiàn)290V位點(diǎn)突變頻率為25%—70%，最高達(dá)91.7%[26]。本研究中，A201S和F290V位點(diǎn)突變頻率與國內(nèi)及其他入侵非洲和亞洲國家的結(jié)果較接近，略高于原發(fā)地巴西等國[27,29,31]。2021年種群-1 A201S和F290V位點(diǎn)突變頻率較2020年略有下降，但無顯著性差異（圖3）。

圖3 2020—2021年3個(gè)生態(tài)區(qū)和4個(gè)防控帶草地貪夜蛾種群ace-1 A201S和F290V突變頻率差異

2.2 草地貪夜蛾種群vgsc和ryr基因型和突變頻率分析

采用和的特異性引物對草地貪夜蛾樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測，362個(gè)樣本和基因擴(kuò)增情況：所有擴(kuò)增樣品均得到和預(yù)期片段大小一致的基因片段，其中基因片段長度為253、360 bp，未檢測到T929I、L932F、L1014F及其他類型突變。基因片段長度764 bp，未發(fā)現(xiàn)I4734M、G4891E和其他類型突變。

3 討論

3.1 草地貪夜蛾氨基甲酸酯類藥劑靶標(biāo)ace-1基因突變情況

本研究對2020—2021年13省（自治區(qū)、直轄市）的草地貪夜蛾田間種群氨基甲酸酯類藥劑靶標(biāo)基因1進(jìn)行突變檢測，發(fā)現(xiàn)A201S和F290V位點(diǎn)突變，未檢測到G227A位點(diǎn)突變。其中F290V位點(diǎn)突變頻率較高，A201S位點(diǎn)突變頻率較低，所有地區(qū)種群位點(diǎn)的突變頻率均低于F290V位點(diǎn)的突變頻率，與國內(nèi)2018—2019年18省種群抗藥性結(jié)果相似[20,26-27,29]。本研究明確了長城防線種群3種殺蟲劑靶基因的突變情況及與其他防控帶種群的差異，長城防線A201S和F290V位點(diǎn)突變頻率均較高，在制定防控策略時(shí)應(yīng)予以重視。

本研究草地貪夜蛾種群與亞洲入侵種群（印度尼西亞、印度）和非洲入侵種群（肯尼亞、烏干達(dá)、馬拉維、貝寧）在A201S和F290V位點(diǎn)的突變頻率接近[31]，推測國內(nèi)草地貪夜蛾種群1基因突變可能是從非洲攜帶而來，且未來非洲當(dāng)?shù)氐倪x擇壓力可能會迅速增加這些抗性突變的頻率[26]。毒力測定結(jié)果也表明國外及入侵中國的草地貪夜蛾對氨基甲酸酯類殺蟲劑抗性較高[35-39]，國內(nèi)目前較少使用該類藥劑防控草地貪夜蛾，該靶標(biāo)基因的檢出和頻率主要與蟲源地的抗性頻率相關(guān)。有研究表明巴西的草地貪夜蛾種群抗性突變頻率較早期變低，這可能與經(jīng)過連年抗性治理且該藥使用頻次減少有關(guān)[9,31]。此外在G227A位點(diǎn)除巴西種群外，國內(nèi)外其他種群極少發(fā)生突變[20,26]。

3.2 草地貪夜蛾擬除蟲菊酯類靶標(biāo)vgsc基因突變情況

本研究草地貪夜蛾種群均未檢測到T929I、L932F和L1014F靶標(biāo)位點(diǎn)和其他位點(diǎn)的突變。自草地貪夜蛾入侵我國以來，國內(nèi)已報(bào)道的不同省份數(shù)千頭樣品均未發(fā)現(xiàn)L932位點(diǎn)突變，T929和L1014位點(diǎn)抗性基因突變頻率極低，T929位點(diǎn)僅檢測到云南2頭和廣東1頭有抗性雜合子，抗性基因突變頻率為0.2%（3/727頭）；在L1014位點(diǎn)，僅云南2頭和廣東2頭檢測到抗性純合子，抗性基因突變頻率為0.4%（4/929）[27-28]。國外對原產(chǎn)地美洲（美國、巴西、墨西哥）和入侵地區(qū)非洲、亞洲等不同國家的多個(gè)種群的分析發(fā)現(xiàn)基因突變頻率很低，僅印尼種群和巴西室內(nèi)種群的2頭個(gè)體（2/396頭）在T929和L1014位點(diǎn)有突變[31]，這可能與田間殺蟲劑劑量選擇壓力不足以引起群體普遍突變，而優(yōu)先選擇個(gè)體攜帶突變有關(guān)[40]。

3.3 草地貪夜蛾雙酰胺類靶標(biāo)ryr基因突變情況

本研究中草地貪夜蛾種群均未檢測到基因突變，目前田間種群G4891E和I4734M（鱗翅目部分種類位置為G4946E和I4790M，本文均用G4891E和I4734M表示）突變檢出頻率低，國內(nèi)僅2019年在周年繁殖區(qū)廣西和遷飛過渡區(qū)貴州檢測到I4734位點(diǎn)極低頻率的突變（各1個(gè)個(gè)體），突變頻率分別為1.7%和1.4%，且該突變種群對雙酰胺類藥劑的敏感性顯著降低[14]。來自美洲、非洲、亞洲等多個(gè)國家不同種群并未檢測到草地貪夜蛾G4891E和I4734M突變[17,26,29-31]，田間種群基因突變頻率低。整體而言，僅室內(nèi)藥劑篩選抗性種群檢測到低頻的I4743M突變，可能與抗性發(fā)生的頻率過低有關(guān)[17]。

通過實(shí)驗(yàn)室引入突變，發(fā)現(xiàn)I4734M突變型與5種雙酰胺類殺蟲劑的親和力與自然種群無明顯差別，但G4891E突變型親和力下降，進(jìn)一步表明G4891E突變會導(dǎo)致草地貪夜蛾對雙酰胺類藥劑產(chǎn)生抗性[21]。巴西和中國部分田間種群對該類藥劑已產(chǎn)生一定水平抗性，但未導(dǎo)致G4891E和I4734M位點(diǎn)突變[13]。但鱗翅目其他害蟲包括草地貪夜蛾近緣種甜菜夜蛾（）這兩個(gè)位點(diǎn)的靶標(biāo)突變較為常見[22]，草地貪夜蛾與國內(nèi)近緣種甜菜夜蛾生態(tài)位重疊，有基因滲入的潛在生態(tài)安全威脅[41]。

3.4 草地貪夜蛾對3類殺蟲劑的抗性機(jī)理

目前草地貪夜蛾對氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類和雙酰胺類藥劑的抗性機(jī)理研究結(jié)果表明，其主要均以靶標(biāo)抗性為主[8,11,17,31]，田間種群對氨基甲酸酯類藥劑的抗性主要表現(xiàn)為靶標(biāo)基因1的A201S和F290V突變。本研究結(jié)果與前人研究一致[35-39]。草地貪夜蛾對擬除蟲菊酯類藥劑靶標(biāo)抗性機(jī)理以的T929、L932和L1014突變?yōu)橹鳎粚﹄p酰胺類藥劑以G4946E和I4790M的突變頻率最高。本研究草地貪夜蛾各種群中未檢測到和相關(guān)位點(diǎn)突變，但在其近緣種甜菜夜蛾中擬除蟲菊酯類和雙酰胺類藥劑的部分靶標(biāo)突變較為普遍（數(shù)據(jù)未發(fā)表），推測草地貪夜蛾對3類藥劑靶標(biāo)抗性突變的差異可能與氨基甲酸酯類藥劑長時(shí)間大范圍使用，而擬除蟲菊酯和雙酰胺類藥劑防控草地貪夜蛾使用頻次較低用藥策略較為科學(xué)有關(guān)[6-8,17,42]；另外可能與草地貪夜蛾對3類殺蟲劑抗性均為常染色體不完全隱性遺傳，其抗性形成速度比顯性遺傳要慢一些，且抗性種群衰退速度較慢有關(guān)[7]。

國內(nèi)外部分種群生物測定結(jié)果表明草地貪夜蛾對氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯藥劑已產(chǎn)生中至高水平抗性[38]，其對氨基甲酸酯類藥劑解毒作用增強(qiáng)和乙酰膽堿酯酶敏感性下降，說明其代謝抗性也起到了重要作用[7,16,38-40,43]。擬除蟲菊酯類藥劑抗性種群表達(dá)量降低[25,44]，雙酰胺類抗性種群的mRNA表達(dá)量發(fā)生了變化[13,25]，說明草地貪夜蛾對3類藥劑可能存在靶標(biāo)突變和由靶標(biāo)基因表達(dá)水平及mRNA表達(dá)量的變化導(dǎo)致的藥劑敏感性降低等多種抗性機(jī)理。為實(shí)現(xiàn)草地貪夜蛾的可持續(xù)控制，應(yīng)長期開展生物測定和基于基因組學(xué)的分子診斷，為草地貪夜蛾抗性治理提供依據(jù)[20,25-29,45-50]。

4 結(jié)論

對2020—2021年采自我國13省（自治區(qū)、直轄市）的362頭草地貪夜蛾田間種群進(jìn)行了3類殺蟲劑靶標(biāo)基因的突變檢測，發(fā)現(xiàn)氨基甲酸酯類靶標(biāo)基因1上存在突變，種群有6種1基因型。位點(diǎn)發(fā)生雜合突變，F(xiàn)290V位點(diǎn)發(fā)生雜合和純和突變，未檢測到G227A位點(diǎn)突變。突變頻率與國內(nèi)種群遷飛路徑和地域分布無明顯關(guān)聯(lián)，長城防線種群A201S和F290V突變頻率在“四帶”中均處于較高水平。2021年種群和F290V位點(diǎn)突變頻率較2020年種群略有下降，但無顯著性差異。本研究未檢測到和的突變。綜上，氨基甲酸酯類殺蟲劑應(yīng)盡可能減少使用，擬除蟲菊酯類和雙酰胺類殺蟲劑可與其他作用機(jī)理藥劑科學(xué)輪換用于草地貪夜蛾的防控，同時(shí)應(yīng)持續(xù)開展抗藥性監(jiān)測。

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Mutation Analysis of Insecticide Target Genes in Populations ofin China

WANG ShuaiYu1, ZHANG ZiTeng1,2, XIE AiTing1, DONG Jie1, YANG JianGuo1, ZHANG AiHuan2

1Beijing Plant Protection Station, Beijing 100029;2College of Bioscience and Resource Environment,Beijing University of Agriculture/Key Laboratory of Urban Agriculture (North China), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 102206

【Background】The fall armyworm () is a major migratory agricultural pest in the tropical and subtropical areas of America, it has rapidly expanded to more than 100 countries around the world since 2016, and has now invaded 27 provinces (Autonomous Region, Municipality) in China, posing a great threat to food security. Resistance may become an increasingly serious problem in many regions with the heavy reliance on insecticides for several years and lead to low control efficiency.had spread to the north of the Great Wall rapidly. However, there are few studies on insecticide resistance and annual variation in China, especially the Great Wall protection zone in 2020 and 2021.【Objective】The objective of this study is to clarify the susceptibility and differences ofpopulations to insecticides in the Great Wall protection zone and other areas of China, and to provide guidance for scientific insecticide use for the prevention and control of.【Method】Samples ofwere collected from maize fields in 13 provinces (Autonomous Region, Municipality) in China, and the genomic DNA was extracted. The mutations of target genes of carbamate, pyrethroid and diamide insecticides in 362 individuals collected from 47 cities (districts) of 13 provinces (Autonomous Region, Municipality) in 2020 and 2021 were analyzed through direct sequencing of the PCR products individually.【Result】There were 6 genotypes of mutations in-1 to carbamate insecticides in all the samples. A201S and F290V mutations were detected in-1. The frequency of A201S heterozygous mutation was 8.4%, and the frequency of F290V homozygous and heterozygous mutations was 14.9% and 25.7%, respectively. No G227A mutation was detected. The mutation frequency at F290V in the key prevention region was higher than that in the migratory transition region and annual breeding region, while the mutation frequency at A201S was lower than that in the above two regions. The average frequency of-1 mutation was high in the Great Wall protection zone, Huang-Huai-Hai interception zone, Yangtze River Basin and southwest and South China protection zone. There was no significant difference in the frequency of-1 mutation between the populations in 2021 and 2020. No mutations were detected in pyrethroidand diamide.【Conclusion】A201S and F290V mutations with high frequency in-1 is one of the mechanisms conferring carbamate resistance in many populations in China. The use of carbamates should be restricted in the control of. No mutations had been detected in theand, suggesting susceptibility to pyrethroids and diamides for rational rotation, however, the low frequency of mutation inand common mutation in(relatives of) to pyrethroids and diamides have been detected. In the future, the effect of high insecticide selection stress in the lab and field populations fed by different hosts on the target gene mutation should be evaluated, and the research of rapid diagnostics methods and products of insecticide resistance should be accelerated.

; insecticide resistance; carbamate; pyrethroid; diamide; target gene; mutation frequency

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.20.007

2022-06-28；

2022-07-20

2021年北京市農(nóng)藥減量監(jiān)測評價(jià)項(xiàng)目（PXM2021_036203_000019）

王帥宇（通信作者），E-mail：shuaiyu3@126.com。通信作者張愛環(huán)，E-mail：zhangaihuan@126.com

（責(zé)任編輯 岳梅）