閆強(qiáng)，薛冬，胡亞群，周琰琰，韋雅雯，袁星星，陳新

大豆根特異性啟動(dòng)子的鑒定及其在根腐病抗性中的應(yīng)用

閆強(qiáng)，薛冬，胡亞群，周琰琰，韋雅雯，袁星星，陳新

江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014

【目的】鑒定大豆根特異性啟動(dòng)子及其最小調(diào)控片段，并利用啟動(dòng)子工程技術(shù)構(gòu)建時(shí)空特異人工啟動(dòng)子并評(píng)價(jià)其在根腐病抗性中的應(yīng)用價(jià)值，為大豆抗疫霉根腐病的遺傳改良提供遺傳元件?！痉椒ā客ㄟ^(guò)分析大豆根、莖和葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選在根中特異高水平表達(dá)的基因，克隆獲得其啟動(dòng)子序列。根據(jù)順式元件的分布位置構(gòu)建截短載體，并驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因在大豆發(fā)狀根組織中超表達(dá)，篩選控制根特異性表達(dá)的核心片段。將獲得的核心啟動(dòng)子片段與疫霉菌誘導(dǎo)啟動(dòng)子元件p4XD串聯(lián)構(gòu)建人工啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)疫霉抗性相關(guān)基因在大豆發(fā)狀根中超表達(dá)，分析轉(zhuǎn)基因組織對(duì)疫霉菌抗性水平及目的基因在病原菌侵染過(guò)程中的表達(dá)水平。利用轉(zhuǎn)基因本氏煙草從整株水平評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因材料對(duì)疫霉菌的抗性水平?！窘Y(jié)果】通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)6個(gè)大豆根特異性表達(dá)的PR1同源基因，其中，具有最高的啟動(dòng)子表達(dá)活性。PLACE在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子區(qū)域含有大量的根特異表達(dá)相關(guān)順式元件。對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行截短試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)5′端截短片段L1、L2、L3、L4和L5均具有啟動(dòng)表達(dá)活性，長(zhǎng)度為166 bp的L5（-166—-1）片段具有全長(zhǎng)啟動(dòng)子80%的活性，并可驅(qū)動(dòng)在轉(zhuǎn)基因煙草根中特異表達(dá)；3個(gè)3′端截短片段R1、R2、R3和1個(gè)雙端截短片段M1幾乎檢測(cè)不到GUS酶活性。p4XD-L5融合片段驅(qū)動(dòng)在大豆發(fā)狀根中超表達(dá)后可顯著提高大豆發(fā)狀根對(duì)疫霉菌的抗性，超表達(dá)發(fā)狀根接種病原菌后發(fā)病程度和病斑長(zhǎng)度顯著低于對(duì)照，疫霉菌絲積累量在接種48 h時(shí)減少66.5%。在超表達(dá)組織中始終維持在高表達(dá)水平，在接種前，表達(dá)量是對(duì)照組織的39.2倍，接種后，表達(dá)量受疫霉菌侵染誘導(dǎo)進(jìn)一步上調(diào)，并在36 h達(dá)到最高。在p4XD-L5::NDR1轉(zhuǎn)基因本氏煙草根中的表達(dá)量顯著高于莖和葉片，表現(xiàn)出明顯的根部表達(dá)偏好性。超表達(dá)株系接種辣椒疫霉菌15 d后的株高、根長(zhǎng)和鮮重顯著高于對(duì)照，同時(shí)葉片萎蔫率和病斑長(zhǎng)度顯著低于對(duì)照植株。【結(jié)論】鑒定獲得一個(gè)大豆根特異性表達(dá)啟動(dòng)子及其核心序列，融合誘導(dǎo)性和組織特異性啟動(dòng)子核心元件的人工啟動(dòng)子p4XD-L5驅(qū)動(dòng)抗性基因超表達(dá)，可顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根和本氏煙草對(duì)疫霉菌的抗病性。

大豆（）；根特異性啟動(dòng)子；；人工啟動(dòng)子；根腐病抗性

0 引言

【研究意義】大豆是植物蛋白最佳來(lái)源之一，也是全球重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物。在大豆生產(chǎn)過(guò)程中，由土傳病原菌引起的大豆根部病害是嚴(yán)重危害大豆生產(chǎn)的世界性病害。其中，由大豆疫霉菌引起的疫霉根腐病已成為世界大豆生產(chǎn)中的第二大病害，每年造成10億—20億美元的損失[1]。將作物天然抗病基因、人工設(shè)計(jì)廣譜持久的免疫受體蛋白以及優(yōu)化整合不同類型的作物抗病基因?qū)肽康淖魑?，通過(guò)激發(fā)和強(qiáng)化作物自身免疫實(shí)現(xiàn)作物廣譜持久抗病是轉(zhuǎn)基因抗病育種的重要目標(biāo)[2-3]。但植物的免疫與生長(zhǎng)發(fā)育往往相互拮抗，同時(shí)抗病基因在目的植物中的非特異性表達(dá)往往存在適合度代價(jià)（fitness cost）的問(wèn)題[4-5]。此外，外源基因在轉(zhuǎn)基因作物收獲器官的表達(dá)也會(huì)引起公眾對(duì)于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全性的擔(dān)憂。如何確保作物免疫與其他農(nóng)藝性狀的協(xié)同調(diào)控，精準(zhǔn)調(diào)控抗病基因在轉(zhuǎn)基因作物中的時(shí)空表達(dá)模式，是植物抗病轉(zhuǎn)基因育種的一個(gè)重要環(huán)節(jié)[3]。挖掘大豆根特異性啟動(dòng)子并鑒定其核心調(diào)控元件；進(jìn)而通過(guò)人工設(shè)計(jì)的手段構(gòu)建根特異性且受疫霉菌誘導(dǎo)表達(dá)的人工啟動(dòng)子，使抗病基因在高度可控的方式下驅(qū)動(dòng)目的基因的表達(dá)，為轉(zhuǎn)基因技術(shù)在大豆抗病育種中的運(yùn)用提供了新的思路，并進(jìn)一步提高抗病基因在轉(zhuǎn)基因抗病育種中的利用價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】啟動(dòng)子是調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵元件，其序列包含眾多順式調(diào)控元件，通過(guò)調(diào)控基因在時(shí)間和空間上的有序表達(dá)確保植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育和生命周期[6-7]。根據(jù)順式調(diào)控元件的表達(dá)特征，啟動(dòng)子可以分為組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組織特異性啟動(dòng)子3種類型。作為植物遺傳操作的重要組成元件，目前，使用最多的是組成型啟動(dòng)子，例如來(lái)自花椰菜花葉病毒的35S（CaMV35s）啟動(dòng)子、水稻的Actin啟動(dòng)子和玉米的Ubiquitin啟動(dòng)子[8]。采用組成型超表達(dá)抗性基因的方式雖然使轉(zhuǎn)基因作物抗病性得到提高，但往往是在損失作物正常生長(zhǎng)、發(fā)育和產(chǎn)量的前提下實(shí)現(xiàn)的，通過(guò)基因工程手段精確控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)是提高植物抗病的關(guān)鍵[5]。將擬南芥脅迫誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子融合轉(zhuǎn)錄因子基因，導(dǎo)入煙草可以提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)干旱及低溫的抗性，同時(shí)，在正常生長(zhǎng)條件下能夠顯著緩解由超表達(dá)引起的生長(zhǎng)遲緩[9]。利用擬南芥根冠特異性表達(dá)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)線蟲(chóng)殺蟲(chóng)肽在擬南芥和馬鈴薯中超表達(dá)，顯著增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因株系對(duì)甜菜胞囊線蟲(chóng)和馬鈴薯胞囊線蟲(chóng)的抗性[10]。啟動(dòng)子在限制殺蟲(chóng)肽組成型表達(dá)的同時(shí)維持甚至提高了轉(zhuǎn)基因植物對(duì)胞囊線蟲(chóng)的抗性。以上研究表明，病原誘導(dǎo)型或組織特異性啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因育種中具有巨大應(yīng)用潛力。目前，從多種植物中分離獲得的根特異性啟動(dòng)子被證明能夠驅(qū)動(dòng)目的基因在轉(zhuǎn)基因植物根中特異表達(dá)[8, 11]。大豆根特異性啟動(dòng)子及疫霉菌特異誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子也有報(bào)道，和啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)在模式植物擬南芥根中特異表達(dá)[12-13]。人工合成啟動(dòng)子122 bp片段的四重復(fù)單元，在煙草葉片中能夠響應(yīng)疫霉菌侵染并驅(qū)動(dòng)觸發(fā)細(xì)胞死亡[14]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，與其他作物相比，大豆根特異性啟動(dòng)子及其核心啟動(dòng)元件的研究仍有待深入，而組織特異性和誘導(dǎo)性啟動(dòng)子在大豆抗疫霉根腐病中的應(yīng)用鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究擬通過(guò)分析大豆幼苗期根、莖和葉片組織中基因表達(dá)水平，篩選根特異性啟動(dòng)子并鑒定核心調(diào)控元件。進(jìn)一步通過(guò)融合根特異性和疫霉菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子核心元件構(gòu)建人工啟動(dòng)子并驅(qū)動(dòng)抗性基因在大豆發(fā)狀根和本氏煙草中超表達(dá)，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因材料對(duì)病原菌的抗性，探討組織特異性、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因大豆抗病育種中的利用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料及培養(yǎng)條件

大豆Williams和本氏煙（）種子均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所豆類研究室保存。組培室及培養(yǎng)室均設(shè)置25℃，16 h光照/8 h黑暗光周期培養(yǎng)條件。大豆疫霉菌株P(guān)6497和辣椒疫霉菌株P(guān)c35在25℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 序列比對(duì)及啟動(dòng)子順式元件分析

從大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Wm82.a4）中分別提取、、、、和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 500 bp啟動(dòng)子序列。利用PLACE在線數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.dna.affrc.go.jp/ PLACE/?action= newplace）預(yù)測(cè)啟動(dòng)子順式調(diào)控元件，利用TBtools軟件對(duì)根部特異表達(dá)相關(guān)元件在啟動(dòng)子上的分布進(jìn)行可視化分析[15]。

1.3 基因組織特異性表達(dá)分析

收集生長(zhǎng)3周齡大豆Williams幼苗根、莖和葉片組織樣品，采用RNAsimple Total RNA Kit試劑盒（天根，北京）提取不同組織樣品總RNA，采用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（Vazyme，南京）去除基因組和反轉(zhuǎn)錄，按照說(shuō)明書(shū)操作獲得各組織cDNA。選擇6個(gè)候選基因的保守區(qū)段，利用Primer6軟件設(shè)計(jì)RT-PCR引物，擴(kuò)增片段大小為450 bp（RT- GmPR1-9-F：5′-GCCTACGCTCAAGATTCA-3′；RT- GmPR1-9-R：5′-CAGTTTGTAGGGTCTTTCAC-3′）。大豆作為內(nèi)參基因（GmACT11-F：5′-GGTG GTTCTATCTTGGCATC-3′；GmACT11-R：5′-CTTTC GCTTCAATAACCCTA-3′）。利用RT-PCR方法分析組織表達(dá)特異性。

1.4 啟動(dòng)子克隆和載體構(gòu)建

根據(jù)的1 500 bp啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)啟動(dòng)子擴(kuò)增引物（GmPR1-9-F：5′-gacctgcaggcatgcTTATCTGTGTGTCTGTGCTAAATAAATCA-3′；GmPR1-9-R：5′-ttaccctcagatctaTATATTAATTA TGCTTAATAGTATCACTTTCTTTAGC-3′），上、下游引物5′端分別含有pCAMBIA3301-GFP載體dⅢ和Ⅰ酶切位點(diǎn)同源臂序列。啟動(dòng)子序列經(jīng)純化后與線性化處理后的pCAMBIA3301-GFP進(jìn)行同源重組反應(yīng)（ClonExpress II One Step Cloning Kit，Vazyme，南京），轉(zhuǎn)化后挑取陽(yáng)性克隆送南京擎科生物公司測(cè)序。截短載體構(gòu)建與啟動(dòng)子全長(zhǎng)載體構(gòu)建采用相同策略，與融合，與pCAMBIA3301-GFP載體連接，3′端引入mini35s小啟動(dòng)子。所構(gòu)載體經(jīng)驗(yàn)證后轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌K599，用于大豆發(fā)狀根轉(zhuǎn)化。

人工啟動(dòng)子p4XD-L5由南京擎科生物公司合成。PCR擴(kuò)增獲得包含同源臂的p4XD-L5啟動(dòng)子序列及序列[16]，并與經(jīng)dⅢ、HⅠ雙酶切的pCAMBIA3300-GFP同源重組構(gòu)建pCAMBIA3300- GFP-p4XD-L5::NDR1。該載體分別轉(zhuǎn)入K599和EHA105，用于大豆發(fā)狀根及煙草穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。

1.5 大豆發(fā)狀根及煙草穩(wěn)定轉(zhuǎn)化

參考Yan等[17]方法，利用培養(yǎng)5 d的大豆子葉作為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生發(fā)狀根。待發(fā)狀根長(zhǎng)出約3 cm時(shí)，用體視熒光顯微鏡篩選GFP陽(yáng)性發(fā)狀根，切下，轉(zhuǎn)接到新鮮White培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)1周，切取根尖部位進(jìn)行GUS染色分析，剩余組織材料液氮速凍后-70℃保存，用于GUS酶活性檢測(cè)。

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法構(gòu)建煙草轉(zhuǎn)基因材料，并收獲T0植株種子[18]。T1轉(zhuǎn)基因幼苗經(jīng)50 mg·L-1草銨膦抗性篩選及熒光篩選后，移栽至營(yíng)養(yǎng)土中繼續(xù)生長(zhǎng)，并收集T2轉(zhuǎn)基因種子。

1.6 GUS染色及酶活性檢測(cè)

收集萌發(fā)10 d（MS培養(yǎng)基）且經(jīng)熒光和草銨膦抗性篩選后的T2轉(zhuǎn)基因煙草幼苗和發(fā)狀根組織，用GUS染色液（50 mmol·L-1磷酸緩沖液、0.1%（v/v）Triton·X-100、2 mmol·L-1K4[Fe(CN)6]·3H2O、2 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]、10 mmol·L-1EDTA和2 mmol·L-1X-Gluc，pH7.0）37℃黑暗孵育12 h。然后，用70%酒精隔水加熱脫色處理直至背景無(wú)色，拍照記錄。

將大豆發(fā)狀根組織用液氮研磨成粉末，利用定量檢測(cè)試劑盒（Coolaber，北京）和Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Coolaber，北京）進(jìn)行蛋白提取、濃度測(cè)定、標(biāo)準(zhǔn)溶液及反應(yīng)液配制。反應(yīng)結(jié)束后，在激發(fā)光365 nm發(fā)射光455 nm條件下檢測(cè)熒光信號(hào)值。GUS酶活以每微克蛋白在單位時(shí)間（min）中生成4-MU的量（pmol）表示。

1.7 轉(zhuǎn)基因材料抗病性分析

采取以下2種方案接種大豆發(fā)狀根：（1）菌絲塊接種。從新鮮培養(yǎng)4 d大豆疫霉P6497菌絲邊緣切取3 mm3大小菌絲塊接種在發(fā)狀根伸長(zhǎng)區(qū)，在接種24和48 h后測(cè)量病斑長(zhǎng)度。（2）游動(dòng)孢子液接種。從培養(yǎng)4d大豆疫霉菌絲邊緣用無(wú)菌手術(shù)刀切割2 mm3菌絲塊接種液體V8培養(yǎng)基中，25℃暗培養(yǎng)3 d。清洗菌絲3—4遍，至菌絲呈白色，加入少量滅菌自來(lái)水后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，即有大量游動(dòng)孢子釋放。過(guò)濾收集游動(dòng)孢子，并稀釋至1×104個(gè)/mL備用。選擇生長(zhǎng)狀態(tài)一致的發(fā)狀根幼嫩部位組織，浸泡在含有5 mL游動(dòng)孢子液的離心管中。在接種后0、12、24、36和48 h收集樣品，利用qRT-PCR方法檢測(cè)組織中的表達(dá)水平和疫霉菌的相對(duì)生物量。疫霉菌相對(duì)生物量以疫霉菌內(nèi)參基因積累水平與大豆內(nèi)參基因積累水平的比值來(lái)衡量。

選擇生長(zhǎng)6周齡且生長(zhǎng)狀態(tài)一致的WT（野生型煙草植株）、EV（轉(zhuǎn)空載體植株）和3個(gè)p4XD-L5:: NDR1超表達(dá)本氏煙植株，緊靠煙草植株莖基部戳一個(gè)1 cm深的小洞，滴加1 mL（1×104個(gè)/mL）辣椒疫霉Pc35菌株游動(dòng)孢子液。在接種0、5和10 d后拍照記錄發(fā)病表型，并在15 d統(tǒng)計(jì)接種植株地上莖上的病斑長(zhǎng)度、葉片萎蔫比例、株高、主根長(zhǎng)和植株鮮重指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 大豆根特異表達(dá)基因篩選及啟動(dòng)子分析

從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)6個(gè)根特異性表達(dá)的病程相關(guān)蛋白（pathogenesis-related protein 1）基因：（）、（）、（）、（）、（）和（）（圖1-A）。其中，至位于第13染色體的同一基因座內(nèi)，為串聯(lián)重復(fù)的同一家族基因；位于第15染色體。轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析顯示在根中表達(dá)水平最高（圖1-A），并且僅在根中檢測(cè)到基因表達(dá)（圖1-B）。

PLACE預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，6個(gè)PR1基因啟動(dòng)子區(qū)均含有大量根特異表達(dá)相關(guān)的作用元件：MYCCONSENSUSAT、OSE1ROOTNODULE、OSE2ROOTNODULE、RAV1AAT、ROOTMOTIFTAPOX1、SP8BFIBSP8AIB和SP8BFIBSP8BIB[19]。其中，包含最多的是MYCCONSENSUSAT和ROOTMOTIFTAPOX1（圖2）。前期試驗(yàn)證明，啟動(dòng)子在大豆發(fā)狀根中具有更強(qiáng)的驅(qū)動(dòng)活性，因此，選擇該基因進(jìn)行后續(xù)研究。

A：GmPR1-9及其同源基因的表達(dá)熱圖（log10FPKM）；B：GmPR1-9的RT-PCR分析

2.2 根特異性表達(dá)核心調(diào)控元件的篩選

為了挖掘啟動(dòng)子核心調(diào)控元件，根據(jù)根特異性相關(guān)元件的位置，構(gòu)建系列啟動(dòng)子截短載體（圖3）。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，結(jié)果表明，啟動(dòng)子-405—-1 bp序列足以驅(qū)動(dòng)表達(dá)?；诖耍挥?405—-311（95 bp）、-310—-171（140 bp）、-166—-1（166 bp）的啟動(dòng)子片段均能驅(qū)動(dòng)表達(dá)。GUS酶活性檢測(cè)結(jié)果表明，啟動(dòng)子全長(zhǎng)與L1片段（-1 253—-1 bp）啟動(dòng)活性相當(dāng)；166 bp啟動(dòng)子片段（L5）驅(qū)動(dòng)活性為全長(zhǎng)啟動(dòng)子活性的80%；3個(gè)3′端缺失片段R1（-1 500—-171 bp）、R2（-1 500—-406 bp）、R3（-1 500—-1 254 bp）和1個(gè)雙端缺失片段M1（-1 253—-406 bp）幾乎檢測(cè)不到GUS酶活性（圖3和圖4）。以上結(jié)果說(shuō)明，位于3′端的166 bp啟動(dòng)子序列（L5）對(duì)于驅(qū)動(dòng)在大豆發(fā)狀根中表達(dá)具有重要功能，該片段啟動(dòng)子含有1個(gè)ROOTMOTIFTAPOX1和1個(gè)SP8BFIBSP8BIB順式元件（圖2）。

圖2 啟動(dòng)子序列中根部特異表達(dá)相關(guān)的順式作用元件分布

A：pGmPR1-9啟動(dòng)子截短示意圖。L1—M1：?jiǎn)?dòng)子截短位置信息；B：轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根GUS組織化學(xué)染色

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。下同 Different letters indicate significant differences (P<0.05). The same as below

為進(jìn)一步驗(yàn)證L5啟動(dòng)子片段的根特異表達(dá)活性，將L5啟動(dòng)子融合并導(dǎo)入本氏煙草植株。T2轉(zhuǎn)基因煙草種子在含有草銨膦的MS培養(yǎng)基上萌發(fā)并經(jīng)GFP熒光篩選（圖5-A）。對(duì)生長(zhǎng)10 d的陽(yáng)性植株進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因煙草根部均被染成藍(lán)色，而在葉片和莖中觀察不到藍(lán)色（圖5-B—圖5-E）。表明L5片段能夠驅(qū)動(dòng)在煙草根部特異性表達(dá)。

2.3 p4XD-L5::NDR1超表達(dá)增強(qiáng)大豆發(fā)狀根對(duì)疫霉菌的抗性

為進(jìn)一步確保L5片段能高水平啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，在5′端融合488 bp的4XD疫霉菌誘導(dǎo)表達(dá)核心元件[14]，構(gòu)建人工啟動(dòng)子p4XD-L5，以確保驅(qū)動(dòng)目的基因在感受病原菌侵染時(shí)的高水平表達(dá)。通過(guò)該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)大豆疫霉菌抗性基因在大豆發(fā)狀根中超表達(dá)，比較轉(zhuǎn)基因組織對(duì)大豆疫霉菌的抗性水平，從而評(píng)價(jià)根特異性啟動(dòng)子L5在植物抗病中的應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果顯示，在接種24 h后，對(duì)照發(fā)狀根出現(xiàn)明顯病斑，菌絲在接種點(diǎn)迅速積累并沿根表面向兩側(cè)擴(kuò)展；接種48 h后，褐色病斑進(jìn)一步擴(kuò)展并出現(xiàn)水漬，菌絲在病斑區(qū)域大量積累（圖6-A）。p4XD-L5::NDR1轉(zhuǎn)基因根發(fā)病程度顯著低于對(duì)照，病斑長(zhǎng)度也顯著小于對(duì)照（圖6-A和圖6-B）。p4XD-L5::NDR1轉(zhuǎn)基因根中的疫霉菌絲積累量在接種后的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著低于對(duì)照組織，在接種48 h時(shí)，疫霉菌絲積累量與對(duì)照相比減少66.5%（圖6-C）。接種后表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)照組織中在接種后上調(diào)表達(dá)并在48 h達(dá)到最高值（圖6-D）。而在p4XD-L5::NDR1轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根中，始終維持在高表達(dá)水平。在接種前的表達(dá)量是對(duì)照組織的39.2倍，接種后表達(dá)量進(jìn)一步提高并在36 h達(dá)到最高水平；接種48 h表達(dá)量略微降低，但仍是對(duì)照組織中表達(dá)量的22.5倍。以上結(jié)果說(shuō)明，人工構(gòu)建的p4XD-L5啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)在大豆發(fā)狀根中表達(dá)且保持病原菌誘導(dǎo)表達(dá)特性，并增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因根組織對(duì)疫霉菌的抗性。

A：轉(zhuǎn)基因煙草種子熒光篩選；B—E：10 d轉(zhuǎn)基因煙草幼苗、葉片、莖和根的GUS組織化學(xué)染色，bar=1 mm

A：發(fā)狀根接種大豆疫霉菌絲塊的病斑表型；B：病斑長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)；C：大豆發(fā)狀根組織中疫霉菌相對(duì)生物量積累；D：大豆發(fā)狀根組織中GmNDR1的相對(duì)表達(dá)量。EV表示空載體對(duì)照。**表示處理間差異極顯著（P<0.01）。下同

2.4 p4XD-L5::NDR1超表達(dá)增強(qiáng)煙草對(duì)疫霉菌的抗性

為了從整株水平評(píng)價(jià)p4XD-L5::NDR1在植物對(duì)疫霉菌抗性中的功能，將p4XD-L5::NDR1轉(zhuǎn)入本氏煙草，并獲得T2轉(zhuǎn)基因株系。p4XD-L5驅(qū)動(dòng)目的基因在根中表達(dá)量顯著高于莖和葉片（圖7）。WT、EV和3個(gè)p4XD-L5::NDR1轉(zhuǎn)基因株系接種5 d后均出現(xiàn)不同程度的萎蔫，但3個(gè)p4XD- L5::NDR1轉(zhuǎn)基因株系僅底部葉片發(fā)生萎蔫，且植株高度受影響較?。▓D8-A和圖8-B）。接種10 d后，WT和EV植株出現(xiàn)明顯矮化、葉片萎蔫黃化，而3個(gè)p4XD-L5::NDR1轉(zhuǎn)基因株系發(fā)病表型明顯較輕，株高顯著高于對(duì)照（圖8-C和圖9-A），萎蔫葉片比例顯著降低（圖8-C和圖9-B）。p4XD-L5::NDR1轉(zhuǎn)基因株系莖基部病斑長(zhǎng)度顯著小于對(duì)照接種植株（圖8-D和圖9-C）。此外，4XD-L5::NDR1轉(zhuǎn)基因株系主根長(zhǎng)顯著大于對(duì)照植株（圖8-E和圖9-D），且植株鮮重高于對(duì)照（圖9-E）。以上結(jié)果表明，p4XD-L5::NDR1轉(zhuǎn)基因株系對(duì)辣椒疫霉菌的抗性顯著提高。

圖7 GmNDR1在轉(zhuǎn)基因煙草根、莖和葉片中的表達(dá)量

A—C：辣椒疫霉菌株P(guān)c35游動(dòng)孢子接種煙草0、5和10 d后整株表型；D—E：接種10 d后煙草莖基部和根系組織的病斑表型

A：株高；B：葉片萎蔫比例；C：病斑長(zhǎng)度；D：主根長(zhǎng)；E：植株鮮重

3 討論

3.1 pGmPR1-9是一個(gè)大豆根特異性啟動(dòng)子

根特異性啟動(dòng)子的挖掘及核心調(diào)控元件的鑒定，對(duì)于利用基因工程手段改良作物養(yǎng)分吸收、干旱及鹽堿等非生物脅迫和根部病蟲(chóng)害等生物脅迫抗性具有重要意義[20-21]。目前，在水稻、煙草、馬鈴薯、番茄、大豆等作物中鑒定到一批根特異性啟動(dòng)子，但其在作物遺傳改良中的應(yīng)用還缺乏深入的研究[22-24]。本研究通過(guò)分析大豆幼苗期根、莖和葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)6個(gè)具有根特異表達(dá)特性的PR1同源基因。PR基因家族作為植物抗病研究中的一個(gè)明星基因，其表達(dá)強(qiáng)烈受到如卵菌、真菌、細(xì)菌、病毒侵染及昆蟲(chóng)取食誘導(dǎo)。PR基因是一個(gè)包含17個(gè)家族成員的基因家族，其中PR1家族蛋白是一個(gè)富含半胱氨酸的分泌蛋白，其核心區(qū)域在不同物種中相對(duì)保守[25]。

在大豆中，通過(guò)對(duì)已公布的大豆轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)24個(gè)PR1家族成員廣泛受到生物和非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，其組織表達(dá)特異性也存在多樣性[26]。PR基因的組織特異性在植物不同發(fā)育時(shí)期也存在差異，高麗參在3周齡幼苗期具有明顯的根表達(dá)偏好性，而在2年期植株體內(nèi)則表現(xiàn)出葉片表達(dá)特異性[27]。豌豆中一個(gè)PR同源基因表現(xiàn)出根表皮及幼胚表達(dá)特異性[28]。小麥和均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的根表達(dá)特異性，但是在葉片接種白粉菌后和的表達(dá)量受病原菌侵染誘導(dǎo)不斷升高[29]。擬南芥中屬于PR-5家族的類甜蛋白基因在受熒光假單胞誘導(dǎo)后在根維管組織中特異表達(dá)[30]。大豆則具有明顯的葉片表達(dá)偏好性[31]。以上研究表明PR基因組織特異性并非一成不變的，在本底表達(dá)水平極低的組織中，由于啟動(dòng)子上病原誘導(dǎo)等順式調(diào)控元件的調(diào)控而表現(xiàn)出誘導(dǎo)表達(dá)特性。

本研究6個(gè)PR1基因啟動(dòng)子區(qū)域均含有大量與調(diào)節(jié)根特異性表達(dá)相關(guān)的順式元件，通過(guò)截短試驗(yàn)獲得具有全長(zhǎng)啟動(dòng)子80%活性的啟動(dòng)子片段L5（166 bp）。轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)證明L5片段能夠驅(qū)動(dòng)在轉(zhuǎn)基因煙草根部特異性表達(dá)，說(shuō)明L5片段上的ROOTMOTIFTAPOX1和SP8BFIBSP8BIB調(diào)控元件對(duì)于驅(qū)動(dòng)目的基因在根中特異性表達(dá)起著重要功能。前人報(bào)道將4拷貝的根特異性順式作用元件OSE1ROOTNODULE、OSE2ROOTNODULE、SP8BFIBSP8AIB和ROOTMOTIFAPOX1以串聯(lián)排列方式設(shè)計(jì)合成的根特異性模塊能夠驅(qū)動(dòng)在轉(zhuǎn)基因煙草根中特異性表達(dá)[32]。本研究結(jié)果表明僅含有單拷貝ROOTMOTIFTAPOX1和SP8BFIBSP8BIB作用元件的更短序列仍在轉(zhuǎn)基因植株中賦予目的基因根特異表達(dá)特性。

3.2 植物時(shí)空調(diào)控啟動(dòng)子在作物遺傳改良中的應(yīng)用

外源基因的組成型高表達(dá)通常會(huì)產(chǎn)生多種不良效應(yīng)。例如，超表達(dá)調(diào)控次生壁形成的轉(zhuǎn)錄因子基因和會(huì)引起薄壁細(xì)胞中的異位次生壁增厚，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物嚴(yán)重矮化[33-34]。因此，需要確保啟動(dòng)子能夠在高度可控的方式下驅(qū)動(dòng)目的基因的表達(dá)，以達(dá)到既能避免不良性狀的產(chǎn)生，又能在特定的組織或發(fā)育階段獲得目標(biāo)性狀的目的。最近一個(gè)利用啟動(dòng)子精確地修改作物性狀的例子是對(duì)水稻啟動(dòng)子的研究，IPA啟動(dòng)子一段54 bp關(guān)鍵順式作用元件的缺失使突變體表現(xiàn)出穗重和穗粒數(shù)同時(shí)增加、株高變高、莖稈和根系粗壯，實(shí)現(xiàn)了不同表型的特異性調(diào)控，從而打破了產(chǎn)量因素之間的負(fù)效應(yīng)[35]。

由土傳病原菌引起的大豆根部病害是嚴(yán)重危害大豆生產(chǎn)的世界性病害。由于根部侵染的特性，在田間發(fā)生肉眼可辨病癥的時(shí)候往往已經(jīng)處于發(fā)病后期，此時(shí)進(jìn)行農(nóng)藥防治難以取得預(yù)期效果[36]。因此，通過(guò)基因工程手段構(gòu)建僅在根中特異表達(dá)抗病基因的轉(zhuǎn)基因品種是一種有前途的改良策略。本研究p4XD-L5不僅能夠驅(qū)動(dòng)在根中高水平表達(dá)，而且保持受病原菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的能力，從而增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根組織和煙草植株對(duì)病原菌的抗性。在煙草中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照植株之間存在生長(zhǎng)速度及株型上的明顯差異，但在轉(zhuǎn)基因煙草株系莖和葉片中均檢測(cè)到低水平的表達(dá)，說(shuō)明4XD病原誘導(dǎo)啟動(dòng)元件在其他器官中仍具有部分表達(dá)活性。通過(guò)研究不同調(diào)控元件排列順序?qū)Ρ磉_(dá)特異性的影響，降低病原誘導(dǎo)啟動(dòng)元件在非目的器官中的表達(dá)水平仍需要進(jìn)一步的研究。此外，在轉(zhuǎn)基因大豆中，該策略是否對(duì)農(nóng)藝性狀產(chǎn)生不良影響還需要進(jìn)一步的大豆穩(wěn)定轉(zhuǎn)化驗(yàn)證，并且需要選擇更多的抗性基因進(jìn)行評(píng)價(jià)。雖然如此，本研究為通過(guò)基因工程手段培育大豆抗疫霉根腐病品種進(jìn)行了有益探索，提出一個(gè)精準(zhǔn)調(diào)控抗性基因表達(dá)的可行思路。

4 結(jié)論

大豆是一個(gè)根特異性啟動(dòng)子，166 bp長(zhǎng)度的L5片段為控制根特異表達(dá)的關(guān)鍵片段。融合誘導(dǎo)性和根特異性核心元件的人工啟動(dòng)子p4XD-L5能夠驅(qū)動(dòng)目的基因在根中高效表達(dá)，該人工啟動(dòng)子可作為轉(zhuǎn)基因大豆根腐病改良中調(diào)控轉(zhuǎn)基因時(shí)空特異表達(dá)的候選遺傳操作元件。

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2023年全國(guó)畜牧獸醫(yī)期刊征訂目錄

序號(hào)期刊名稱郵發(fā)代號(hào)刊期年定價(jià)/元聯(lián)系人電話地址郵編E-mail 16飼料博覽14-184雙月刊90.00 倪樹(shù)森0451-55190639黑龍江省哈爾濱市香坊區(qū)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)150030slbl@vip.163.com 17獸醫(yī)導(dǎo)刊（上半月）80-328半月刊150.00 趙 曉13520538616北京市朝陽(yáng)區(qū)麥子店街20號(hào)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北辦公區(qū)001室100125sydk2007@263.net 18經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào)自辦發(fā)行季刊100.00 劉兆娟0431-84533130 吉林省長(zhǎng)春市新城大街2888號(hào)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)130118jjdwxb@163.com 19廣東飼料自辦發(fā)行月刊120.00 周風(fēng)珍020-37288820廣東省廣州市天河區(qū)先烈東路135號(hào)4號(hào)樓609室510500gdfeed@vip.163.com 20Journal of Animal Science and Biotechnology自辦發(fā)行雙月刊600.00 劉 萍010-62734403北京市海淀區(qū)圓明園西路2號(hào)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院154室100193jasbeditor@gmail.com 21中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)54-33月刊180.00 張文舉0931-8342195 0931-8310086甘肅省蘭州市鹽場(chǎng)堡徐家坪1號(hào)730046zgsykx@zgsykx.com 22中國(guó)獸醫(yī)雜志2-137月刊240.00 黃長(zhǎng)欽010-62733040北京市海淀區(qū)圓明園西路2號(hào)中國(guó)農(nóng)大動(dòng)物醫(yī)學(xué)院100193vetzzhi@cau.edu.cn 23中國(guó)乳業(yè)82-764月刊240.00 張愛(ài)華010-82106274北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街12號(hào)100081zhgry@caas.cn 24中國(guó)豬業(yè)80-493雙月刊180.00 張愛(ài)華010-82106274北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街12號(hào)100081zhuye@caas.cn 25中國(guó)牛業(yè)科學(xué)52-113雙月刊72.00 張 琪029-87091423陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院712100Huangn2002813@aliyun.com 26動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展52-60月刊180.00 黃建文029-87092574陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院712100dyjzyilan@263.net 27家畜生態(tài)學(xué)報(bào)52-112月刊72.00 陳小強(qiáng)029-87091130陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院712100jcst@x263.net 28畜牧產(chǎn)業(yè)82-612月刊180.00 黃 偉010-62123852北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街12號(hào)農(nóng)科院飼料所輔助樓504100081xmcy@caaa.cn 29畜牧與飼料科學(xué)16-101雙月刊90.00 趙俊利0471-5294608內(nèi)蒙古呼和浩特市昭君路22號(hào)內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院010031cnmxky@vip.163.com

Identification of the root-specific soybeanpromoter and application inroot-rot resistance

YAN Qiang, XUE Dong, HU YaQun, ZHOU YanYan, WEI YaWen, YUAN XingXing, CHEN Xin

Institute of Industrial Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement, Nanjing 210014

【Objective】The objective of this study is to identify the root-specific promotors and the core regulatory sequence of soybean. Then evaluate the potential application of the synthetic promoter inroot-rot resistance.【Method】The genes which specifically expressed in roots with high expression levels were screened based on the transcriptome date of soybean root, stem and leaf tissues in the seedling stage. Based on the distribution of theelements, the promoter truncation approach was used to map the minimal promoter controlling root specific expression in soybean hairy roots. The obtained minimal promoter fragment was concatenated with theinducible promoter elements p4XD to construct the synthetic promoter. The synthetic promoter driven over-expression ofresistance related genein soybean hairy roots, then the resistance level of transgenic tissue toand the expression profiles ofduring the interaction had been analyzed. Furthermore, the transgenicplants were generated to evaluate the resistance at plant level. 【Result】Though screening, six soybean PR1 homologues with significant root specific expression manner were identified, andhad the highest promoter activity. Numbers of root specific expression relatedelements were identified in promoter sequence using the online tool PLACE. Truncation analysis of the promoter showed that serial 5’ end deletions L1, L2, L3, L4 and L5 had different GUS activities. The L5 (-166 to -1) fragment had 80% activity of the full-length promoter, and was able to driveexpression in roots of transgenic. GUS enzyme activity was almost undetectable in three 3’ end deletions R1, R2 and R3, and the double terminal deletion mutant M1. When the fusion promoter p4XD-L5 drivenexpression in soybean hairy roots, the resistance towas significantly enhanced. The disease severity and lesion length were significantly reduced in the over-expression hairy roots when compared with control, and the relative biomass of Phytophthora decreased by 66.5% at 48 h post inoculation.maintained high expression level in over-expression tissues, with 39.2 times of that in control tissues. The expressions were further up-regulated after inoculation, and reached the highest level at 36 h. In p4XD-L5::NDR1 transgenicplants, the expression ofwas significantly higher in roots than that in stems and leaves. Fifteen days afterinoculation, the plant height, root length and fresh weight ofover-expression plants were significantly higher, and meanwhile the leaf wilting rate and lesion length were significantly lower. 【Conclusion】This study obtained a soybean root specific promoter and identified the core regulation sequence. The strategy which driven the expression ofby the synthetic promoter p4XD-L5 combined theinducible and tissue-specific promoter core elements can significantly enhance the resistance of transgenic soybean hairy roots andplantstopathogens.

soybean (); root specific promotor;; synthetic promoter;root-rot resistance

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.20.002

2022-05-05；

2022-06-27

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金（CX（20）3119）、國(guó)家自然科學(xué)基金（32101668）、江蘇省特糧特經(jīng)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系集成創(chuàng)新中心（[2021]423）

閆強(qiáng)，E-mail：yanqiang@jaas.ac.cn。通信作者陳新，E-mail：cx@jaas.ac.cn

（責(zé)任編輯 李莉）