張 鑫，田 蕾，朱金朋，史 璇，李迪諾

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化三病區(qū)，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外胃一病區(qū)，遼寧 錦州 121001)

胃腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，來源于胃黏膜腺上皮，腫瘤細(xì)胞異型性大、侵襲性強(qiáng)、轉(zhuǎn)移快，患者預(yù)后差[1-2]。近年研究[3]顯示胃癌中存在多種基因、蛋白和遺傳物質(zhì)的異常表達(dá)。Krüppel樣因子 16 (Krüppel-like transcription factor 16，KLF16)是近年學(xué)者關(guān)注到的與腫瘤形成有關(guān)的基因，其不僅具有物種特異性，在機(jī)體中還具有器官特異性。有研究[4]發(fā)現(xiàn)KLF16在胃癌中高表達(dá)，其可能是促進(jìn)腫瘤形成的重要因子。微小RNA(microRNA，miR)與多種惡性腫瘤相關(guān)，主要通過與靶基因3’UTR結(jié)合調(diào)控靶基因，發(fā)揮生物學(xué)作用[5]。課題組前期應(yīng)用二代測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)KLF16在胃癌中高表達(dá)，并應(yīng)用生物信息技術(shù)發(fā)現(xiàn)KLF16與微小RNA-135a-5p(microRNA-135a-5p，miR-135a-5p)具有可能結(jié)合的堿基序列。本研究探討胃腺癌中miR-135a-5p和KLF16的表達(dá)特征，并分析兩者的靶向關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2021年1月至2022年5月在我院就診并確診為胃腺癌的患者45例為研究對(duì)象，其中男性23例，女性22例；年齡32～82歲，中位年齡60歲；高分化5例，中分化10例，低分化30例；有脈管癌栓16例，無脈管癌栓29例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)胃鏡活檢組織病理確診為胃腺癌后行根治性手術(shù)治療，術(shù)后30 min內(nèi)取材行病理學(xué)檢查，并經(jīng)2位病理科主治醫(yī)師復(fù)核切片再次明確；符合WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：雙原發(fā)癌或多原發(fā)癌；術(shù)前有放療或化療史。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 材料與試劑 腫瘤組織和距腫物邊緣>3 cm正常胃黏膜組織新鮮標(biāo)本(-80 ℃凍存)和石蠟包埋標(biāo)本；人胃癌細(xì)胞株MGC-803和SGC-7901、人正常胃細(xì)胞株GES-1購自中科院上海細(xì)胞庫；TRIzol、DEPC、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海碧云天公司；質(zhì)粒均由上海生工公司合成；Lipofectamine 2000試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒、KLF16濃縮液(批號(hào)：Ag20503)購自武漢三鷹公司；二抗、DAB均購自武漢博士德生物公司。

1.3 研究方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人胃癌MGC-803和SGC-7901細(xì)胞株、人正常胃GES-1細(xì)胞株均用含有10% FBS與1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取處于對(duì)數(shù)生長期的人胃癌細(xì)胞株MGC-803，以105個(gè)/孔接種于6孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞整合度為75%時(shí)用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別建立si-KLF16組和miR-135a-5p mimic組，并設(shè)立無關(guān)序列組。

1.3.3 miR-135a-5p和KLF16 mRNA表達(dá)量檢測：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)進(jìn)行檢測。TRIzol提取總RNA，檢測純度后逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。miR-135a-5p正向引物序列為5’-AGTGAAACCGCTATCGACGTGGCGCT-3’， 反向引物序列為5’-CCAACGTGTGGAAATCACGTAGGACG-3’。KLF16 mRNA正向引物序列為5’-GTGAACATTAACTTGCACACGT-

CGG-3’， 反向引物序列為5’-GGACGCGTGGCGTGTCCGACGTTATG-3’。以U6作為內(nèi)參，正向引物序列為5’-CCTCGTTCTTCGCACATATACACA-3’， 反向引物序列為5’-TAACGGTGCAGCCGAGG-TATCGT-3’。執(zhí)行PCR程序設(shè)定：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性30 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.3.4 免疫組化染色：基于術(shù)后石蠟包埋標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。KLF16為濃縮液，先梯度稀釋后行預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇顯色最好的1∶200進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用免疫組化Envision法檢測KLF16的表達(dá)，嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)步驟操作，DAB顯色。結(jié)果由2位病理主治醫(yī)師雙盲閱片后得出。先在低倍鏡(100倍)下選擇顯色密集且良好的上皮細(xì)胞區(qū)域，然后在高倍鏡(200倍)下觀察并計(jì)數(shù)，共觀察5個(gè)視野。顯色強(qiáng)度評(píng)分：無著色為0分，弱著色為1分，中等著色為2分，強(qiáng)著色為3分。陽性率評(píng)分：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分[6]。兩者相乘為最終評(píng)分，總分范圍0～12分，≤5分為陰性，>5分為陽性。

1.3.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：構(gòu)建含有野生型KLF16的質(zhì)粒(WT-KLF16)和突變型KLF16的質(zhì)粒(MT-KLF16)，分別與miR-135a-5p mimic、miR-135a-5p空白對(duì)照組(NC)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，觀察螢火蟲發(fā)光值和海腎發(fā)光值(對(duì)照)。相對(duì)熒光素酶活性=螢火蟲發(fā)光值/海腎發(fā)光值×100%。

2 結(jié) 果

2.1 正常胃黏膜與胃腺癌組織miR-135a-5p表達(dá)、KLF16陽性情況比較 見表1(圖1)。胃腺癌組織中miR-135a-5p表達(dá)量明顯低于正常胃黏膜組織，KLF16陽性率明顯高于正常胃黏膜組織(均P<0.05)。

表1 正常胃黏膜與胃腺癌組織miR-135a-5p表達(dá)、KLF16陽性情況比較

圖1 在正常胃黏膜(A)和胃腺癌(B)組織KLF16免疫組化染色結(jié)果(×200)

2.2 不同臨床病理特征胃腺癌患者miR-135a-5p表達(dá)量及KLF16陽性表達(dá)情況比較 見表2。不同腫瘤最大徑和浸潤深度胃腺癌患者miR-135a-5p相對(duì)表達(dá)量及KLF16陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表2 不同臨床病理特征胃腺癌患者miR-135a-5p表達(dá)量及KLF16陽性表達(dá)情況比較

2.3 胃腺癌組織miR-135a-5p表達(dá)與KLF16陽性的相關(guān)性 線性相關(guān)分析顯示，miR-135a-5p表達(dá)與KLF16陽性呈負(fù)相關(guān)(r=-0.623，P=0.001)。

2.4 MGC-803、SGC-7901與GES-1細(xì)胞株miR-135a-5p、KLF16 mRNA表達(dá)比較 見表3。胃癌細(xì)胞株MGC-803、SGC-7901細(xì)胞株miR-135a-5p表達(dá)明顯低于正常胃GES-1細(xì)胞株，KLF16 mRNA表達(dá)明顯高于GES-1細(xì)胞株(均P<0.05)。

表3 MGC-803、SGC-7901與GES-1細(xì)胞株miR-135a-5p、KLF16 mRNA表達(dá)比較

2.5 MGC-803 si-KLF16組與無關(guān)序列組miR-135a-5p表達(dá)比較 基于MGC-803細(xì)胞株，應(yīng)用qRT-PCR檢測miR-135a-5p表達(dá)，結(jié)果顯示si-KLF16組中miR-135a-5p表達(dá)明顯高于無關(guān)序列組(1.98±0.38與1.22±0.18，t=4.323，P=0.013)。

2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果 見圖2?；贛GC-803細(xì)胞株，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，miR-135a-5p mimic+WT-KLF16與NC+WT-KLF16、miR-135a-5p mimic+MT-KLF16、NC+MT-KLF16比較，相對(duì)熒光素酶活性下降(均P<0.05)，提示miR-135a-5p和KLF16具有靶向關(guān)系。

注：與miR-135a-5p mimic+WT-KLF16比較，*P<0.05

3 討 論

KLFs主要通過與富含GC序列中的多個(gè)基因啟動(dòng)子結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用，其家族每個(gè)成員的N端均具有特異性區(qū)域，因此其功能各異[7]。KLF16的功能不僅與家族中其他成員不完全相關(guān)，而且表現(xiàn)出明顯的器官特異性[8-9]。研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，KLF16上調(diào)時(shí)對(duì)肺腺癌、鱗癌形成有抑制作用。但有研究[12]在前列腺癌的組織學(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)KLF16表達(dá)增高，并認(rèn)為KLF16對(duì)前列腺癌形成有促進(jìn)作用。

本研究顯示，胃腺癌組織中miR-135a-5p低表達(dá)，KLF16高表達(dá)，并在組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)研究中均得到證實(shí)，提示miR-135a-5p和KLF16異常表達(dá)是胃腺癌形成中的重要分子事件，這與Ma等[13]研究結(jié)果一致。本研究中，miR-135a-5p和KLF16在胃腺癌不同腫瘤最大徑、不同浸潤深度表達(dá)的比較中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示兩者異常表達(dá)對(duì)腫瘤生長、侵襲等生物學(xué)行為有促進(jìn)作用。另外，miR-135a-5p和KLF16具有靶向負(fù)調(diào)控關(guān)系，提示miR-135a-5p對(duì)胃腺癌的調(diào)控是通過靶基因KLF16實(shí)現(xiàn)的。

KLF16是miR-135a-5p/KLF16通路中調(diào)控胃癌的主要靶基因，其活化后可能有以下作用：①促進(jìn)細(xì)胞增殖。有學(xué)者[7]發(fā)現(xiàn)敲除KLF16能直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，引起腫瘤細(xì)胞增殖活性下降，腫瘤生長緩慢。而在KLF16上調(diào)時(shí)能通過lamin B2等基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[14]。顧清等[15]通過觀察KLF16對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和克隆能力的影響發(fā)現(xiàn)，KLF16對(duì)細(xì)胞增殖的作用可能與調(diào)控P21和細(xì)胞周期蛋白素依賴性激酶4(CDK4)有關(guān)，并證實(shí)了P21蛋白通過其N末端特異性地與增殖細(xì)胞核抗原、Cyclin-CDK結(jié)合，抑制CDK活性，阻滯細(xì)胞周期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖；同時(shí)發(fā)現(xiàn)CDK4蛋白正向調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化。②抑制細(xì)胞凋亡。KLF16能直接抑制細(xì)胞凋亡，如對(duì)凋亡因子Bax和Bcl-2的調(diào)控作用，使腫瘤細(xì)胞具有永生化的特征[11]。有研究[16]顯示KLF16能通過維甲酸結(jié)合蛋白-2活化整合素β1/黏著斑激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶途徑抑制細(xì)胞凋亡。有學(xué)者[8]通過觀察人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中KLF16的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，KLF16能抑制U87細(xì)胞凋亡。因此，KLF16加速腫瘤細(xì)胞增殖及抑制凋亡可能是其經(jīng)典作用，因此趙舒楊等[9]通過應(yīng)用龍葵堿聯(lián)合沉默KLF16基因觀察對(duì)膠質(zhì)瘤的增殖和凋亡的作用，證實(shí)了龍葵堿聯(lián)合沉默KLF16基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控效果。③促進(jìn)侵襲和遷移。研究[17]顯示KLF16能通過下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子受體3促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，使腫瘤細(xì)胞黏附性下降，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。也學(xué)者[18]發(fā)現(xiàn)，KLF16能通過調(diào)控BCL2樣15促凋亡蛋白促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移。KLF16是miR-135a-5p下游基因，基于兩者的關(guān)系進(jìn)行干預(yù)研究可能對(duì)闡明胃腺癌的形成和進(jìn)展提供重要支持。miR-135a-5p作為腫瘤細(xì)胞形成中的直接啟動(dòng)基因，可引起腫瘤細(xì)胞異型增生和遷移[19-20]，這是一種直接作用。但是多種研究[21-22]發(fā)現(xiàn)，miR-135a-5p的調(diào)控是通過多種下游通路實(shí)現(xiàn)的，其作用可能更復(fù)雜。張莉等[23]在甲狀腺腫瘤中發(fā)現(xiàn)，miR-135a-5p能通過介導(dǎo)硫氧還蛋白互作蛋白發(fā)揮調(diào)控腫瘤進(jìn)展的作用。張夢等[24]在子宮頸鱗癌研究中發(fā)現(xiàn)，miR-135a-5p可能與GATA結(jié)合蛋白3、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3的作用有關(guān)聯(lián)。miR-135a-5p通過下游因子在非腫瘤中對(duì)凋亡的調(diào)控也有研究報(bào)道。例如，謝九冰等[25]發(fā)現(xiàn)miR-135a-5p在青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中低表達(dá)，且miR-135a-5p高表達(dá)能降低青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡，認(rèn)為其機(jī)制可能是通過調(diào)控 miR-135a-5p/Bcl-2/Bax軸實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，胃腺癌miR-135a-5p低表達(dá)，KLF16高表達(dá)，它們都參與腫瘤的形成和進(jìn)展，且具有靶向關(guān)系?；趍iR-135a-5p/KLF16的調(diào)控作用可能是胃癌形成的關(guān)鍵作用，其上游、下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，后續(xù)將重點(diǎn)進(jìn)行此方向的研究，同時(shí)關(guān)注其干擾因素及干預(yù)措施，對(duì)揭示miR-135a-5p/KLF16在胃腺癌中的具體機(jī)制有重要價(jià)值。