呂士紅 王長杰 朱洪春 楊白婧

牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江牡丹江 157000

膠質(zhì)細胞包括星形膠質(zhì)細胞、無突膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞，對神經(jīng)元有支持和引導(dǎo)遷移的作用，在神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)中發(fā)揮重要的作用，參與髓鞘的形成，參與血腦屏障。發(fā)生在神經(jīng)外胚層的膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)常見的腫瘤，起源于神經(jīng)間質(zhì)細胞，惡性膠質(zhì)瘤的五年生存率低，平均生存期短[1]。延長患者的生存期，提高患者生活質(zhì)量是科研和醫(yī)療工作者的急迫任務(wù)。細胞骨架的功能包括維持細胞形態(tài)、保持內(nèi)部細胞結(jié)構(gòu)有序性、基因表達、細胞分化，微絲是細胞骨架的主要成分之一[2]。微絲解聚因子（cofilin）是肌動蛋白結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)微絲骨架重建，影響其細胞增殖、遷移、凋亡等功能[3-4]。本研究分析cofilin 對膠質(zhì)瘤遷移和浸潤的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

膠質(zhì)母細胞瘤干細胞（GSC）株來自牡丹江醫(yī)學(xué)院實驗室，包括基因沉默GSC 細胞（對照組）與過表達cofilin 的GSC 細胞（觀察組）。細胞培養(yǎng)液（賽默飛），10%胎牛血清，細胞培養(yǎng)箱（博科集團），熒光顯微鏡（奧林巴斯）。Tracking Tool PRO v2.1 軟件，Transwell 實驗板。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 10% 胎牛血清，細胞培養(yǎng)液DMEM，37℃，5%CO2濃度的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3 d 細胞傳代一次。

1.2.2 劃痕實驗[5]將所用的器械消毒滅菌。在6 孔板上使用記號筆過孔均勻劃線，間隔1 cm。在6 孔板中接種對數(shù)生長期細胞，待細胞完全生長融合，再進行劃痕實驗。用移液器洗頭垂直劃線用力均勻勻速劃痕，用PBS 液洗滌。將細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，分別于0、12 以及48 h，用顯微鏡拍攝細胞圖片。用Image J 軟件測量細胞的測量距離。遷移速率=（0 時的傷口寬度-觀察時點的傷口寬度）/0 h 時傷口寬度×100%，評價cofilin 對膠質(zhì)瘤細胞遷移的影響。

1.2.3 浸潤實驗[5]制備Transwell 小室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液600 μl。取對數(shù)生長的細胞0.25%的胰蛋白酶消化，PBS 清洗3 次，用細胞培養(yǎng)液（無血清）制備細胞懸液，調(diào)整濃度為1×105/ml。Transwell 板做好標(biāo)記，取300 μl 細胞懸液加入Transwell 板的上室，移入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出Transwell 小室，刮出未浸潤細胞，甲醛固定，晾干，吉姆薩液避光染色，PBS 液洗滌3 次。晾干，顯微鏡下隨機觀察5 個視野，計數(shù)穿越小室膜的細胞數(shù)量，評價cofilin 對膠質(zhì)瘤細胞浸潤的影響。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，行t檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組膠質(zhì)瘤細胞遷移速率比較

24、48 h 觀察組膠質(zhì)瘤細胞遷移速率顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05）。見表1。

表1 兩組膠質(zhì)瘤細胞遷移速率比較（%，±s）

組別n24 h48 ht 值P 值觀察組 633.32±5.6168.95±4.3312.3150.000對照組 613.18±2.1625.22±3.477.2150.000 t 值8.20619.304 P 值0.0000.000

2.2 兩組膠質(zhì)瘤細胞浸潤個數(shù)比較

觀察組觀察到的膠質(zhì)瘤細胞浸潤個數(shù)[（196.33±38.43）個]顯著高于對照組[（83.26±25.52）個]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.481，P=0.001）。見圖1。

3 討論

膠質(zhì)瘤占腦腫瘤的40%～50%，臨床常見。膠質(zhì)瘤很難根治，術(shù)后往往容易復(fù)發(fā)，不同級別的膠質(zhì)瘤預(yù)后各不相同，高級別膠質(zhì)瘤患者病情進展較快，術(shù)后短時間內(nèi)就可復(fù)發(fā)，生存時間也往往相對較短。對膠質(zhì)瘤的治療主要是早發(fā)現(xiàn)、早治療，以改善預(yù)后。微絲與微管、中等纖維共同組成細胞質(zhì)骨架。細胞質(zhì)骨架具有彌散性、整體性、變動性，維持細胞形態(tài)，在細胞運動、能量轉(zhuǎn)換、物質(zhì)運輸、細胞分裂、信息傳遞、基因表達、細胞分化等過程中發(fā)揮重要的作用。真核細胞中的微絲由肌動蛋白組成，直徑7 nm，程度不一，實心細絲狀骨架纖維。微絲具有支架功能，肌肉收縮功能，細胞定向運動、保質(zhì)環(huán)流、細胞內(nèi)吞、外涂，細胞分裂，細胞分化，微絨毛收縮，信息傳遞等作用[6-8]。cofilin 蛋白通過磷酸化、去磷酸化、磷酸肌醇、pH 改變等進行調(diào)節(jié)細胞內(nèi)結(jié)合和解聚F 肌動蛋白，介導(dǎo)細胞內(nèi)信號途徑，從而調(diào)節(jié)肌動蛋白骨架的重組[9-11]。在神經(jīng)細胞中，細胞骨架中的肌動蛋白在多種重要的生理活動中發(fā)揮作用，包括肌肉收縮，胞質(zhì)，神經(jīng)纖維再生，神經(jīng)纖維退行性改變等。在這個過程中還需要一些調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合和解聚的蛋白參與。在一定條件下，cofilin 蛋白可使肌動蛋白微絲解聚，從而影響細胞骨架蛋白動力學(xué)。從基因上，cofilin 基因主要有cofilin-1 和cofilin-2，表達相應(yīng)的蛋白質(zhì)。cofilin-1 主要表達在非肌肉組織，尤其以腦組織為主。而cofilin-2 主要表達在肌肉組織中，例如骨骼肌、心肌等。cofilin-1 參與神經(jīng)元的分化。在神經(jīng)細胞中，微絲的解聚與重塑影響神經(jīng)元的極化以及樹突和軸突的形成，cofilin-1 通過解聚微絲參與神經(jīng)元的分化過程。cofilin-1 調(diào)節(jié)細胞骨架的變化，影響神經(jīng)元的定向運動，進而影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育以及損傷后的修復(fù)過程。cofilin 蛋白還參與調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸的可塑性[12]。

研究顯示，食管癌組織cofilin-1 陽性高表達與臨床分期晚、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后差有關(guān)[13]。王靜等[14]的研究結(jié)果也顯示，cofilin-1 的表達水平與慢性粒細胞白血病患者的不良生存預(yù)后有關(guān)。cofilin-1 與胃腸道間質(zhì)瘤浸潤的深度、腫瘤的直徑、病理性核分裂象正相關(guān)[15]。本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果相似，過表達cofilin 的GSC 單核細胞遷移速率要顯著高于基因沉默的細胞，發(fā)生浸潤的細胞個數(shù)也顯著多于基因沉默的細胞（P< 0.05）。cofilin 通過誘導(dǎo)片狀偽足的形成，進而影響細胞運動的方向。cofilin參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)從而參與細胞運動及形態(tài)的改變，在腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移、浸潤過程中發(fā)揮重要的作用[16-17]。本研究未對cofilin 影響膠質(zhì)瘤細胞的遷移和浸潤的具體機制進行研究，期待在今后的研究中進一步分析。

綜上所述，cofilin 可促進膠質(zhì)瘤細胞的遷移與浸潤，可能與cofilin 參與膠紙瘤細胞運動、信息傳遞、細胞分裂、基因表達等有關(guān)，期待在今后的研究中能夠?qū)唧w機制進行進一步分析。