王 強，蔡文超，劉忠軍，單春會，郭 壯2，，郝光飛*

（1.河北工程大學(xué) 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056038；2.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽 441053；3.清香型白酒生物技術(shù)襄陽市重點實驗室，湖北 襄陽 441053；4.襄陽市釀酒生物技術(shù)與應(yīng)用企校聯(lián)合創(chuàng)新中心，湖北 襄陽 441053；5.石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832003）

曲乃酒之骨，沒有好曲就很難釀出好酒，酒曲中的微生物是白酒釀造的動力[1]。作為主產(chǎn)清香型白酒的山西，所使用的低溫大曲，是用小麥、大麥和豌豆等原料，在40～50 ℃之間的溫度制曲，其獨特而又豐富的微生物群落，能夠提供代謝和降解原料并產(chǎn)生風味物質(zhì)所需的微生物和酶促作用，是清香型白酒酒體風味品質(zhì)形成的關(guān)鍵因素[2]。而酒曲中的真菌微生物能夠分泌淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等多種酶，其群落結(jié)構(gòu)和功能對白酒品質(zhì)控制有重要的影響[3]，故探究山西清徐低溫大曲的真菌菌群多樣性就顯得尤為重要。

Illumina MiSeq高通測序技術(shù)因具有免培養(yǎng)、高通量、快速檢測、結(jié)果精確且能夠全面展現(xiàn)大曲樣品中復(fù)雜微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于酒曲微生物群落結(jié)構(gòu)分析[4]。如陳申習(xí)等[5]通過高通量測序技術(shù)對清香型和醬香型酒曲細菌群落特征進行研究，揭示了不同香型酒曲中細菌的主要類群，結(jié)果發(fā)現(xiàn)清香型大曲QDB中含有較高比例的放線菌屬（Actinobacteria）；周森等[6]基于高通量測序技術(shù)對濃香型白酒大曲的真菌菌群多樣性進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)15份大曲樣品門分類和綱分類較為一致，但真菌屬組成存在較大的差異；薛宇昂等[7]利用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對襄陽市石花酒大曲中微生物的多樣性進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細菌中的假單胞菌屬與真菌的曲霉屬有顯著的正相關(guān)性（P＜0.05）；羅愛國等[8]采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對清香型白酒酒糟中微生物多樣性進行研究發(fā)現(xiàn)，酒糟中的細菌豐富度和多樣性均高于真菌。同樣，現(xiàn)代仿生儀器檢測設(shè)備電子舌和電子鼻[9]也一直用于食品滋味和香氣的檢測，由于其客觀、快速、簡便、靈敏、出錯率低等優(yōu)點，近幾年在酒曲上的應(yīng)用也日益增多，如CAI W C等[10-12]均使用電子舌和電子鼻技術(shù)對大曲的滋味和風味進行了分析，但卻少有人將兩者結(jié)合，探究大曲中真菌多樣性并研究功能性關(guān)聯(lián)。

本研究使用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對清徐低溫大曲真菌菌群多樣性進行研究，采用電子鼻和電子舌分別對大曲的滋味和風味進行分析，并結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）[13]與相關(guān)性分析探究清徐大曲中真菌微生物的功能，對后續(xù)從清徐大曲中篩選這些相應(yīng)的真菌，提升酒曲質(zhì)量，并加以在清香白酒生產(chǎn)中運用提供思路，為進一步利用白酒釀造微生物資源優(yōu)化提供一些方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

清徐低溫大曲樣品：采于山西省太原市清徐縣陽順和曲業(yè)有限公司，通過機械進行制曲。從曲庫不同位置采集10塊大曲，編號為QXDQ 1～QXDQ 10。

1.1.2 試劑

引物ITS3F（5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'）和ITS4R（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）：武漢天一輝遠生物科技有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒：德國QIAGEN公司；5×FastPfu Buffer、2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）、FastPfu Polymerase、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）：北京全式金生物技術(shù)有限公司；酒石酸、無水乙醇（均為分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司；氯化鉀、氫氧化鉀（均為分析純）：西隴化工股份有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

使用800Y高速萬能粉碎機對曲塊進行粉碎并過20目篩，然后裝入500 mL樣品瓶中于-20 ℃冰箱冷藏備用。

1.3.2 Illumina MiSeq高通量測序

通過上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司對清徐大曲微生物多樣性進行測序。按照QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒說明書，從2 g大曲樣品中提取微生物宏基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）。以其為模板，采用引物ITS3F和ITS4R對真菌的ITS3F-ITS4R區(qū)基因序列進行PCR擴增。PCR擴增體系：5×FastPfu Buffer 4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、ITS3F（5 μmol/L）0.8 μL，ITS4R（5 μmol/L）0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，模板DNA 10 ng，使用雙蒸水（ddH2O）補充至20 μL。PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，并使用微量紫外可見分光光度法測量其數(shù)量和質(zhì)量，以獲得高品質(zhì)和高濃度的微生物宏基因組DNA，將檢測合格的PCR擴增產(chǎn)物委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司使用Illumina MiSeq測序儀測序。

1.3.3 生物信息學(xué)分析

參考沈馨等[14-15]的方法，對返回的序列進行質(zhì)量控制并根據(jù)核苷酸標簽（barcode）區(qū)分序列來源，然后利用微生物生態(tài)學(xué)定量分析（QIIME）包（1.9.1版）對測序結(jié)果進行生物信息學(xué)分析，使用UCLUST算法[16]以97%的相似度將高質(zhì)量序列進行序列劃分并建立操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）[17]，利用UNITE數(shù)據(jù)庫[18]對清徐低溫大曲中真菌菌群的OTU進行序列同源性比對，確定清徐低溫大曲樣品中真菌的分類地位，并在測序量均為43010條序列下計算清徐低溫大曲樣品中真菌的超1（Chaol）指數(shù)和香農(nóng)（Shannon）指數(shù)，同時對清徐低溫大曲中的優(yōu)勢真菌屬（平均相對含量＞1.00%）進行分析。

1.3.4 基于電子舌技術(shù)對清徐低溫大曲滋味的測定

準確稱量30 g曲粉，加入120 mL蒸餾水，混勻浸泡0.5 h，于4 ℃、12 000×g條件下離心10 min，取上清液，過濾得到濾液。參照楊小麗等[19-21]的方法，采用電子舌對大曲樣品的滋味進行測定，得到每個樣品的酸、苦、澀、咸和鮮5個基本味的相對強度值，以及樣品的后味A（澀的回味）、后味B（苦的回味）和豐度（鮮的回味）3個回味的相對強度值。

1.3.5 基于電子鼻技術(shù)對清徐低溫大曲香氣的測定

參照郭壯等[22-24]的方法使用PEN3電子鼻對清徐低溫大曲中的典型揮發(fā)性物質(zhì)進行分析。電子鼻的金屬氧化物傳感器列陣的性能描述分別為W1C：芳香成分，W5S：靈敏度大、對氮氧化合物很靈敏，W3C：氨氣、對芳香成分靈敏，W6S：主要對氫氣有選擇性，W5C：烷烴芳香成分，W1S：對甲烷靈敏，W1W：對有機硫化物敏感，W2S：對乙醇靈敏，W2W：芳香成分、對有機硫化物靈敏，W3S：對烷烴靈敏。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2021對清徐低溫大曲測得的數(shù)據(jù)進行整理，采用R（4.0.5 版本）、Origin 2021、SAS 9.0軟件繪制圖、表。通過腸型分析對10個清徐低溫大曲進行分組，并結(jié)合皮爾遜（Pearson）相關(guān)性分析揭示優(yōu)勢菌群與香氣及滋味之間的相關(guān)性，通過普氏分析（Procrustes）揭示清徐低溫大曲的真菌菌群與大曲品質(zhì)之間是否存在一致性關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 清徐低溫大曲樣品中真菌菌群高通量測序結(jié)果及α多樣性分析

10個清徐低溫大曲樣品真菌菌群的高通量測序結(jié)果及α多樣性分析結(jié)果見表1。

表1 清徐低溫大曲樣品中真菌菌群高通量測序及α多樣性分析結(jié)果Table 1 High-throughput sequencing and α diversity analysis results of fungal flora in Qingxu low temperature Daqu

由表1可知，經(jīng)過序列質(zhì)控，平均每個樣品產(chǎn)生了63 253.5條真菌序列，以97%的相似度進行序列劃分共得到703個OTU，平均每個樣品341個OTU，通過UNITE數(shù)據(jù)庫將這些序列注釋到了2個門、4個綱、5個目、13個科和17個屬。作為α多樣性指數(shù)，超1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)分別從豐度和多樣性兩個維度，對清徐大曲中真菌菌群多樣性進行評價，QXDQ 1樣品的超1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)最大，這說明QXDQ1樣品具有最高的真菌物種多樣性和物種豐度[25]。

本研究進一步采用稀疏性曲線和α多樣性指數(shù)分析，對清徐低溫大曲的取樣深度和物種組成進行綜合分析，在97%相似性水平下，劃分OTU并制作的稀疏性曲線和香農(nóng)指數(shù)曲線見圖1。

圖1 清徐低溫大曲樣品真菌菌群的稀釋曲線（A）和香農(nóng)指數(shù)曲線（B）Fig.1 Dilution curve (A) and Shannon index curve (B) of fungal flora in Qingxu low temperautre Daqu

由圖1可知，清徐低溫大曲中真菌菌群的物種多樣性都隨著測序深度的增加而在緩慢上升，而當測序深度≥10 000條之后，香農(nóng)指數(shù)均隨著測序深度的增加而保持不變，均已達到平臺期，說明隨著測序深度的繼續(xù)增加，清徐低溫大曲中仍有少量新的OTU在不斷的被檢出，但微生物多樣性已不再發(fā)生較大的變化，表明本研究的測序深度已經(jīng)足夠滿足后續(xù)的分析要求[26]。

2.2 清徐低溫大曲真菌菌群結(jié)構(gòu)分析

基于門水平，清徐低溫大曲中的優(yōu)勢真菌門（平均相對含量＞1.00%）只有子囊菌門（Ascomycota），平均相對含量高達（99.99±0.02）%?；趯偎?，清徐低溫大曲樣品中真菌菌群的相對含量見圖2。

由圖2可知，清徐低溫大曲樣品中共有4個優(yōu)勢真菌屬（平均相對含量＞1.00%），分別是復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、熱子囊菌屬（Thermoascus）、紅曲菌屬（Monascus）、曲霉屬（Aspergillus），其中復(fù)膜孢酵母屬的平均相對含量最高，為（80.71±8.83）%，其余3個優(yōu)勢真菌屬的平均相對含量分別為（8.96±5.03）%、（6.10±4.56）%、（1.54±1.18）%。此外，還有（2.44±1.58）%的序列無法鑒定到真菌屬水平。

圖2 基于屬水平清徐低溫大曲樣品中的真菌菌群結(jié)構(gòu)Fig.2 Fungal flora structure based on genus level in Qingxu low temperature Daqu

2.3 清徐低溫大曲樣品的腸型分組及其各組真菌屬的群落結(jié)構(gòu)

通過腸型分析對清徐低溫大曲進行分組，并基于優(yōu)勢真菌屬繪制各組菌屬的群落結(jié)構(gòu)圖，結(jié)果見圖3。

圖3 清徐低溫大曲樣品的腸型分析（A）及各組優(yōu)勢真菌屬群落結(jié)構(gòu)（B）Fig.3 Enterotype analysis (A) and community structure of dominant fungi in each group (B) of Qingxu low temperature Daqu

由圖3A可知，經(jīng)過腸型分析，清徐低溫大曲樣品被分為兩組，分別為Type 1（包含QXDQ2、QXDQ4、QXDQ5）和Type 2（包含QXDQ1、QXDQ3、QXDQ6、QXDQ7、QXDQ8、QXDQ9、QXDQ10）。由圖3B可知，Type 1組樣品復(fù)膜孢酵母屬的平均相對含量高于Type2組樣品，而熱子囊菌屬和曲霉屬的平均相對含量低于Type2組樣品。

2.4 清徐低溫大曲樣品香氣和滋味的解析

采用電子舌和電子鼻分別對清徐大曲的滋味和香氣進行解析，并通過PCA直觀展現(xiàn)不同樣品間香氣和滋味的相似性，結(jié)果見圖4。

圖4 基于滋味和風味指標清徐低溫大曲樣品主成分分析的因子載荷圖（A）及得分圖（B）Fig.4 Factors loading diagram (A) and score (B) of Qingxu low temperature Daqu based on taste and flavor indicators by principal component analysis

由圖4A可知，清徐低溫大曲的PC1主要包括WIC、W3C、W5C、W3S、W2W、W2S、W1W、W5S、W1S，方差貢獻率為35.39%，PC2主要包括W6S、酸、咸、豐度、苦、后味-A、后味-B，方差貢獻率為25.41%，前兩個主成分的累計方差貢獻率為60.80%，說明這兩個主成分的代表性強，可以用來代表清徐低溫大曲樣品的滋味和香氣品質(zhì)。由圖4B可知，清徐大曲Type 1都分布在y的正半軸，Type 2大都分布在y的負半軸，將Type 1和Type 2的得分范圍映射到圖4A因子載荷上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Type 1主要受W2W、W2S、W1W、W5S、W1S、苦、后味-A和后味-B的影響，Type 2主要受W3S、W6S、酸、咸和豐度的影響，而Type 1和Type 2是由復(fù)膜孢酵母屬、熱子囊菌屬和曲霉屬的平均相對含量不同確定的，由此可以推測復(fù)膜孢酵母屬、熱子囊菌屬和曲霉屬的平均相對含量對清徐低溫大曲樣品的W3S、W6S和豐度以及W2W、W2S、W1W、W5S、W1S、苦、后味-A和后味-B指標具有關(guān)聯(lián)性，是造成清徐大曲分組的主要原因，因此需進一步對清徐低溫大曲樣品的優(yōu)勢真菌屬與滋味和香氣的相關(guān)性進行分析，探究清徐低溫大曲樣品優(yōu)勢真菌屬的具體功能。

2.5 清徐低溫大曲樣品的優(yōu)勢真菌屬與滋味和香氣的相關(guān)性

為進一步探究優(yōu)勢真菌屬與功能性指標的關(guān)聯(lián)，基于清徐大曲優(yōu)勢真菌屬的平均相對含量與滋味和風味指標進行普氏（Procrustes）分析，并繪制相關(guān)性熱圖，結(jié)果見圖5。

圖5 基于清徐低溫大曲優(yōu)勢真菌屬與滋味、香氣的普氏分析（A）和相關(guān)性熱圖（B）Fig.5 Procrustes analysis (A) and correlation heat map (B) of Qingxu low temperature Daqu based on dominant fungal genera,and taste and aroma

由圖5A可知，優(yōu)勢真菌屬與清徐大曲功能性指標之間顯著相關(guān)（P＜0.05），說明Type 1和Type 2的功能性指標差異與菌群差異有密切的關(guān)系。由圖5B可知，復(fù)膜孢酵母屬與后味-A呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與苦味和后味-B呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與咸味呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），表明清徐大曲中復(fù)膜孢酵母屬含量越大，大曲的后味-A、苦味和后味-B越強烈，但咸味恰恰相反。同時不難發(fā)現(xiàn)，熱子囊菌屬與曲霉屬功能具有較高的一致性，如兩者都會抑制W2W、W2S、W1W、W5S、W1S、苦味、后味-A和后味-B這些功能性指標，促進豐度、酸味和咸味，但并不顯著（P＞0.05）。此外，紅曲菌屬能夠促進酸味、咸味、W5S、W2S、W2W、W6S和W1S，抑制后味-A、后味-B和苦味，但不顯著（P＞0.05）。以上結(jié)果明確了清徐低溫大曲樣品優(yōu)勢真菌屬的具體功能，為后續(xù)從清徐大曲中篩選這些相應(yīng)的真菌，并加以其在清香白酒生產(chǎn)中的運用提供了思路。

3 結(jié)論

通過Illumina MiSeq高通量測序分析發(fā)現(xiàn)，清徐低溫大曲中的優(yōu)勢真菌門（平均相對含量＞1.00%）為子囊菌門，平均相對含量為（99.99±0.02）%，優(yōu)勢真菌屬（平均相對含量＞1.00%）為復(fù)膜孢酵母屬、熱子囊菌屬、紅曲菌屬、曲霉屬，平均相對含量分別為（80.71±8.83）%、（8.96±5.03）%、（6.10±4.56）%、（1.54±1.18）%。其中復(fù)膜孢酵母屬與清徐低溫大曲功能性指標之間具有顯著相關(guān)性（P＜0.05），會促進清徐低溫大曲的后味-A、苦味和后味-B，是造成清徐低溫大曲的功能不同的主要原因。本研究能夠在一定程度上豐富人們對清徐清香型大曲真菌菌群的認識，為進一步清香型白酒大曲優(yōu)勢真菌微生物功能性研究及特色菌株應(yīng)用提供一定理論支撐。