王近近，袁海波, ，滑金杰，楊艷芹，沈 帥，龐丹丹，江用文, ，朱佳依，俞燎遠

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶葉質量安全控制重點實驗室，浙江杭州 310008；2.云南省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，云南西雙版納傣族自治州 666201；3.浙江省農(nóng)業(yè)技術推廣中心，浙江杭州 310020）

茶是世界上消費量僅次于水的第二大飲料，由于其獨特的風味和保健功效備受消費者喜愛[1]。茶葉的滋味是評價茶葉品質的重要因素，茶葉鮮葉原料及加工技術可通過影響多酚類、茶黃素、氨基酸、生物堿等茶葉主要滋味物質的含量而形成不同的茶葉風味[2]。茶由茶樹新梢制成，鮮葉原料的內含成分是形成茶葉品質的基礎，其與茶葉品質高低、茶葉適制性密切相關，進一步?jīng)Q定了茶樹品種資源的利用價值和茶葉的經(jīng)濟效益[3-4]。鮮葉原料生化成分的種類和含量因茶樹品種、鮮葉嫩度、種植環(huán)境的不同而不同。研究表明不同品種的中小葉種茶樹單芽至一芽二葉鮮葉中主要滋味物質的分布存在差異，其中可溶性糖、簡單兒茶素等隨嫩度的降低而增加，茶多酚、氨基酸等隨嫩度的降低而下降[5]。Chen等[6]研究結果顯示影響烏龍茶滋味品質的表沒食子兒茶素沒食子酸酯、兒茶素沒食子酸酯等在高海拔烏龍茶中的含量顯著高于低海拔烏龍茶。

中國云南處于熱帶向亞熱帶的過渡區(qū)域，天然的自然氣候孕育和保留了豐富的茶樹種質資源，是世界茶樹資源多樣性分布中心之一[7]。云南地方良種清水3號和香歸銀毫、國家級（審）認定品種云抗10號和云抗14號、云南省農(nóng)業(yè)主導品種云茶普蕊等均為云南代表性的無性系茶樹種質資源，其芽葉肥壯、育芽力強、內含成分豐富。目前關于云南大葉種鮮葉的研究多集中于不同品種間茶多酚、氨基酸、咖啡堿等常規(guī)成分多樣性的分析及基于常規(guī)成分的不同品種的茶類適制性研究[8-9]。堵源康等[10]對清水3號、香歸銀毫、云抗10號、云抗14號等云南茶樹良種進行了表型多樣性探究及適制性分析，但關于云南大葉種品種、嫩度間關于滋味成分的系統(tǒng)綜合研究較少，影響大葉種茶湯澀味和甜味的黃酮苷、可溶性糖組分的相關研究尚未有報道。鮮葉采摘后的分級是進行鮮葉分類加工的基礎，分級后不同等級或類別的鮮葉通過制定相應的標準化工藝可加工出優(yōu)質和不同特色的茶葉，但是生產(chǎn)中鮮葉分級主要依靠經(jīng)驗判斷，缺少多指標之間的關聯(lián)探討，對鮮葉的品質評價尚沒有形成系統(tǒng)、科學的評價體系，不利于茶葉的標準化加工，且隨著茶鮮葉采茶工短缺、勞動力成本上升，越來越多的企業(yè)選用機械化采摘代替人工采摘，機械采摘的鮮葉老嫩不一，無法有效實現(xiàn)鮮葉分類及分級加工。

基于此，本研究以清水3號、香歸銀毫、云抗10號、云抗14號、云茶普蕊的單芽、一芽一葉、一芽二葉、一芽三葉等共4個嫩度的鮮葉原料為研究對象，進行茶多酚、氨基酸、咖啡堿、兒茶素類、黃酮苷類、可溶性糖等化學指標的測定，旨在明確不同品種間滋味品質成分的差異性，探究不同嫩度云南大葉種的原料特性，并運用偏最小二乘法（Partial Least Squares Discrimination Analysis，PLS-DA）、層次聚類（Hierarchical cluster analysis，HCA）、Fisher判別分析等多元統(tǒng)計分析方法明確鮮葉嫩度差異的關鍵化合物、建立鮮葉類別判別模型，以期為優(yōu)質茶葉資源的篩選及茶葉標準化加工提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮葉原料 本研究選用了云南具有代表性的無性系品種清水3號、香歸銀毫、云抗10號、云抗14號（圖1）、云茶普蕊。實驗基地位于云南省西雙版納州勐?？h，處于東經(jīng)100°25'，北緯21°59'，海拔在1185 m，屬南亞熱帶季風氣候，降雨主要集中在6～9月，年平均溫度18.1 ℃，年均積溫6600 ℃，年平均降雨量1467 mm，年平均日照時數(shù)2030 h，年平均相對濕度82%，干、濕季節(jié)分明。該茶園土壤肥力均勻，灌溉良好。清水3號、香歸銀毫的樹齡為17年，云抗10號、云抗14號、云茶普蕊的樹齡是45年。在茶園中隨機選取生長良好的茶樹，采摘無蟲害、無病理學特征的生長良好的單芽、一芽一葉、一芽二葉、一芽三葉的新梢。采摘時間為2020年9月中旬。采摘后的鮮葉各取150 g置于液氮罐中進行冷凍固樣，然后經(jīng)過低溫冷凍干燥后放于-20 ℃的冰箱中待測滋味品質成分；采摘后的鮮葉取30 g放置于液氮罐中用于酶活性的測定；茚三酮、氯化亞錫、福林酚等 分析純，上海麥克林生化科技有限公司；咖啡堿（Caffeine，CAF）、兒茶素系列標準品 美國Sigma公司；黃酮苷系列標準品 上海源葉生物科技有限公司；糖組分標準品 上海金穗生物科技有限公司。

圖1 不同嫩度的云抗14號鮮葉Fig.1 Yunkang No.14 fresh leaves with different tenderness

UV-2800分光光度計 上海誠麗生物科技有限公司；XMTD-204電加熱恒溫水浴鍋 上海谷寧儀器有限公司；JGZX-9246MBE風熱鼓風干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；LGJ-50C型冷凍干燥機 北京四環(huán)科學儀器廠有限公司；Waters 1525型高效液相儀 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶多酚、氨基酸、咖啡堿、沒食子酸、兒茶素類的測定 茶多酚的測定參照茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法（GB/T 8313-2018）；氨基酸的測定參照茚三酮比色法（GB/T 8314-2013）；咖啡堿的測定參照高效液相色譜法（GB/T 8313-2018）；沒食子酸、兒茶素類的測定參照茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法（GB/T 8313-2018），并按照公式（1）～（4）計算兒茶素相關指標：

式中：TSC、TETC和TAC分別表示簡單兒茶素、酯型兒茶素和兒茶素總量；EGC、GC、EC、C、EGCG、CG、GCG、ECG分別代表表沒食子兒茶素、沒食子兒茶素、表兒茶素、兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素沒食子酸、表兒茶素沒食子酸酯，結果均基于質量分數(shù)，%。

1.2.2 多酚氧化酶和過氧化物酶的測定 多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）活性采用鄰苯二酚比色法[11]進行測定；過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性采用愈創(chuàng)木酚比色法[11]進行測定。

1.2.3 黃酮苷組分的測定 黃酮苷組分的測定參照劉陽等[12]的檢測方法。色譜柱：C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。檢測器：紫外吸收檢測器。流動相A相：0.15%甲酸水溶液，B相：乙腈。流動相洗脫梯度：0～2 min，6%～17% B；2～22 min，17%～19% B；

22～23 min，19%～30%；23～25 min，30% B；25～26 min，30%～6%；26～30 min，6%。流速為1 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量20 μL，檢測波長360 nm。

1.2.4 可溶性糖組分的測定 可溶性糖組分的檢測方法參照陳琦等[13]方法進行。色譜柱：Waters X bridge BEH Amide Column（4.6×250 mm，5 μm）。檢測器：蒸發(fā)光散射檢測器。流動相：0.02%氨水與乙腈按照25%和75%的體積比例混合。流速0.5 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量10 μL。霧化管加熱動力：60%（36 ℃），漂移管溫度：70 ℃，高純氮氣流速：25 psi，增益6。并按照式（5）計算可溶性糖總量，按照公式（6）計算甜度值[14]。

式中：SS為可溶性糖總量，%；SV為甜度值；FT為β-D-呋喃果糖質量分數(shù)，%；SR為蔗糖質量分數(shù)，%；GS為α-D-葡萄糖質量分數(shù)，%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有生化成分數(shù)據(jù)的檢測均重復3次，結果以平均值±標準偏差表示。數(shù)據(jù)圖片采用Origin 8.0軟件繪制。數(shù)據(jù)差異顯著性分析采用SPSS 22.0軟件分析（Tukey法，P＜0.05）。采用SIMCA-P 13.0軟件進行PLS-DA分析，以VIP值大于1.2，P＜0.05進行差異性指標的篩選。采用SPSS 22.0軟件進行HCA聚類分析，以平方歐式距離為度量標準，以Ward聯(lián)結為聚類方法進行聚類。采用SPSS 22.0軟件進行Fisher判別分析。

2 結果與分析

2.1 云南大葉種茶樹新梢的滋味品質特性

2.1.1 不同品種與嫩度鮮葉茶多酚、氨基酸、酚氨比、咖啡堿的變化規(guī)律 茶多酚是茶樹的主要次級代謝產(chǎn)物，是茶湯滋味濃度和強度的主體成分，也是茶湯呈澀味的主要物質之一。鮮葉中的茶多酚在茶葉加工過程中通過發(fā)生氧化、聚合、降解、異構等復雜的反應而影響茶葉滋味、湯色等品質。由圖2A可知，相同品種不同嫩度間，各品種的茶多酚含量隨著嫩度的降低先升后降，且各品種均為一芽三葉含量較低（質量分數(shù)范圍為19.39%～24.12%），一芽一葉、一芽二葉含量較高且均顯著高于一芽三葉（P＜0.05）（質量分數(shù)范圍分別為22.07%～23.81%、22.55%～24.53%）；相同嫩度不同品種間，以云抗14號、云茶普蕊的茶多酚含量相對較高。氨基酸是以鮮味為主的物質[15]；由圖2B可知，各品種的氨基酸含量隨著嫩度的降低而降低，這與Zhang等[16]研究結果一致；單芽的氨基酸質量分數(shù)范圍為3.26%～4.16%，相比一芽三葉（2.51%～3.43%）平均高出了26.12%；相同嫩度不同品種間，以云抗14號的氨基酸含量整體較高。酚氨比指茶葉中茶多酚含量與氨基酸含量的比值，反應了茶葉的醇厚感、鮮爽度與澀味之間的關系[17]；由圖2C可知，各品種的酚氨比隨著嫩度的降低而升高，一芽三葉的酚氨比值范圍為6.78～9.98，均顯著高于單芽的酚氨比（4.88～7.21）（P＜0.05），本研究的酚氨比范圍與陳春林等[8]研究結果一致；相同嫩度不同品種間，以香歸銀毫的酚氨比值相對較高，云抗14號的酚氨比值相對較低?？Х葔A是茶葉中含量最多的生物堿，為苦味物質[18]；由圖2D可知，香歸云毫、云抗14號的咖啡堿含量隨著嫩度的降低而降低，清水3號、云抗10號、云茶普蕊的咖啡堿含量隨著嫩度的降低先升后降；整體上各品種的咖啡堿均為一芽三葉嫩度含量最低，這與Zhang等[16]研究結果中咖啡堿在成熟葉的含量中較低的結果類似，這可能與咖啡堿主要在茶芽的生長旺盛部位合成和積累有關；相同嫩度不同品種間，以云茶普蕊的咖啡堿含量相對較高且各嫩度間差異較?。≒＞0.05），平均值為4.01%。

圖2 各品種鮮葉嫩度間茶多酚（A）、氨基酸（B）、酚氨比（C）、咖啡堿（D）的變化Fig.2 Changes of contents of tea polyphenols (A), amino acids(B), the ratio of tea polyphenols to amino acids (C) and caffeine(D) of fresh leaves with different tenderness of all cultivars

由以上可知，茶鮮葉在不同品種、嫩度間存在生化成分的差異性和規(guī)律性。Huang等[19]研究表明茶樹中的生化成分一般呈向上積累的趨勢，嫩葉中含量較高，成熟葉中含量較少，與本研究結果相似；這可能與嫩葉的呼吸速率比老葉快，而呼吸產(chǎn)物是茶多酚、咖啡堿等次生代謝物的合成前提物質有關[20]。

2.1.2 不同品種和嫩度鮮葉沒食子酸、兒茶素組分的變化規(guī)律 沒食子酸（Gallic acid，GA）是茶葉中酸澀味覺屬性的呈味成分[21]。兒茶素類成分是茶葉中的主要多酚類物質，根據(jù)分子結構分為簡單兒茶素和酯型兒茶素，影響茶葉的苦味、澀味[22]，相同濃度下兒茶素組分滋味強度大小順序為：ECG、EGCG、EC、EGC[23]。

由表1可知，相同品種不同嫩度間，嫩度越高，GA含量越高，這與Xu等[24]研究結果一致；其中云抗14號的單芽和一芽一葉間、一芽二葉和一芽三葉間的GA含量差異較?。≒＞0.05），但前者顯著高于后者（P＜0.05），其余品種單芽GA含量均顯著高于一芽一葉、一芽二葉、一芽三葉、一芽四葉（P＜0.05），各品種單芽的GA平均質量分數(shù)為0.08%，相比一芽三葉的0.03%，高出了1.24倍。不同品種相同嫩度間，單芽嫩度中的云抗10號及一芽一葉、一芽二葉和一芽三葉嫩度中的云茶普蕊具有相對較高的GA，質量分數(shù)范圍為0.06%～0.12%，各嫩度中清水3號的GA含量相對較低，質量分數(shù)范圍為0.03%～0.04%。由以上可知，各品種不同嫩度間的GA含量有差異但有相似的變化規(guī)律。研究顯示，簡單兒茶素和GA與綠茶的回甘程度正相關[25]；Li等[26]研究表明，GA對紅茶的甜味具有負面的影響，同時，GA在紅茶加工過程中會隨酯型兒茶素的降解而產(chǎn)生[27]。

表1 各品種鮮葉嫩度間沒食子酸、兒茶素類含量的變化（%）Table 1 Changes of gallic acid and catechin components contents of fresh leaves with different tenderness of all cultivars (%)

本文檢測到8種兒茶素單體，其含量大小順序依次為：EGCG、ECG、EGC、EC、GC、C、GCG、CG。相同品種不同嫩度間，嫩度越高，GC、EGC、C、EC、CG、TSC、TAC等 值 越低，同時GCG、TETC/TSC等值越高；其中EGC、EC、CG、TSC、GCG、TETC/TSC等在不同嫩度間均差異顯著（P＜0.05）。兒茶素單體中EGCG是影響茶湯澀味的主要物質[28]，云抗14號和香歸銀毫的EGCG為嫩度越高，其含量越高，其余品種的EGCG含量均隨著嫩度的降低先升后降，且在一芽一葉或一芽二葉含量較高；清水3號和香歸銀毫的ECG均為嫩度越高，其含量越高，云抗10號為嫩度越高，其含量越低，其余品種為隨著嫩度的降低先升后降，且在一芽二葉含量較高；各品種的TETC均隨著嫩度的降低先升后降，均在一芽二葉含量較高。本研究結果與Xu等[24]、Song等[29]研究結果中隨著茶葉新梢的成熟EGCG、ECG等含量顯著下降、EGC、C、EC等含量增加的結論一致。可見，TSC及其單體、TAC整體上隨著新梢的成熟而增加；TETC整體上隨著新梢的成熟而先升后降，其中一芽二葉的TETC、TAC均同時最高，平均質量分數(shù)分別為11.10%、16.18%，即中等成熟度的芽葉新梢的兒茶素總量較高；單芽的TSC、TAC均同時最低，平均質量分數(shù)分別為2.59%、12.92%，酯型兒茶素相對較低，質量分數(shù)為10.23%；鮮葉的成熟度越高，簡單兒茶素相對酯型兒茶素的含量越高。隨著茶鮮葉成熟度的增加，酯型兒茶素的下降及簡單兒茶素的增加可能是由于成熟葉中的酯型兒茶素被酯型兒茶素水解酶水解為簡單兒茶素所致[30]。

2.1.3 不同品種和嫩度鮮葉酶活性的變化規(guī)律 茶多酚的氧化產(chǎn)物茶黃素、茶紅素等茶色素是影響茶湯色澤、茶湯滋味強度和濃度的重要成分，而PPO和POD是茶葉中催化兒茶素類氧化轉化形成茶色素的關鍵酶類，PPO主要催化兒茶素類氧化聚合生成茶黃素，POD既影響茶黃素的酶促合成又影響茶黃素的酶促過氧化[31]，即PPO和POD均對茶葉滋味品質的形成有極其重要的作用，故本文將其作為滋味相關成分進行分析。

由圖3A可知，清水3號、香歸銀毫、云茶普蕊的PPO活性隨著嫩度的降低先降后升，均為單芽、一芽四葉的PPO活性較高；云抗10號PPO活性隨著嫩度的降低先升后降，一芽一葉的PPO酶活性較高，其次為單芽；云抗14號PPO酶活性為單芽較高，其余嫩度間差異較小。由以上可知，各品種的單芽嫩

度鮮葉均具有相對較高的PPO活性（平均值為1.32 U·g-1·min-1），較一芽二葉（0.99 U·g-1·min-1）增加了33.33%。相同嫩度不同品種間，單芽、一芽二葉和一芽三葉以清水3號、香歸銀毫的PPO活性相對較高，一芽一葉以云茶普蕊的酶活性較高。因此，鮮葉的酶活性因品種和成熟度的不同存在差異。由圖3B可知，相同品種不同嫩度間，各品種的POD活性隨著嫩度的降低而升高，且各品種的一芽二葉和一芽三葉間均存在顯著差異（P＜0.05），五個品種的一芽三 葉POD平 均 活 性（22.34 U·g-1·min-1）較 單 芽（2.13 U·g-1·min-1）增加了9.49倍；相同嫩度不同品種間，單芽、一芽二葉、一芽三葉以云抗14號的POD活性整體相對較高，一芽一葉以香歸銀毫的POD活性較高。由以上分析可知，酶活性在品種、嫩度間均存在差異，這種差異可能與酶相關基因在不同品種間、不同部位間的表達有關；不同嫩度間POD的差異大于PPO，這與Xu等[32]研究結果相似。Ramaswamy等[33]研究指出鮮葉與萎凋葉PPO區(qū)別較大，在萎凋過程中有新的PPO形成，并且紅茶成品的質量與萎凋葉PPO的活性有更密切的關系，即酶活性與茶葉品質的關系需結合成品茶進一步分析研究確定。

圖3 各品種鮮葉嫩度間PPO（A）和POD（B）活性的變化Fig.3 Changes of activities of PPO (A) and POD (B) of fresh leaves with different tenderness of all cultivars

2.1.4 不同品種和嫩度鮮葉黃酮苷組分的變化規(guī)律

茶葉中的黃酮苷類化合物是茶湯澀味的主要貢獻物質，黃酮苷不僅在口中產(chǎn)生干燥和光滑的澀味，還可通過強化咖啡堿的苦味增加茶湯的苦味[34-36]，對茶葉滋味產(chǎn)生不利的影響，但同時黃酮苷是綠茶茶湯中的主要成分，它們以水溶性黃色色素的形式存在于茶湯中構成綠茶的茶湯色澤[37]。茶樹品種、生長氣候、加工工藝、貯藏條件等對茶葉中黃酮苷類物質的分布和含量均有一定的影響[36,38]。研究表明楊梅素3-O-半乳糖苷和槲皮素3-O-蘆丁苷的濃度與綠茶澀味密切相關[39]，蘆丁對紅茶的甜醇口感有消極的影響[26]，但目前關于云南大葉種茶葉黃酮苷含量及嫩度間的變化情況未有報道。本研究共測定了8種黃酮苷組分，含量由大到小均依次為蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、楊梅素-3-O-半乳糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、牡荊素葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-龍膽雙糖苷。由表2可知，相同品種不同嫩度間，除槲皮素-3-O-β-D-龍膽雙糖苷外，各品種的黃酮苷組分及黃酮苷總量為一芽二葉或者一芽三葉含量較高，單芽含量較低，其中一芽三葉的蘆丁、總黃酮苷的平均質量分數(shù)分別為0.62%、1.65%，相比單芽的0.04%、0.23%分別增加了13.21、6.31倍。相同嫩度不同品種間，清水3號的楊梅素-3-O-半乳糖苷和牡荊素葡萄糖苷、香歸銀毫的山柰酚-3-O-蕓香糖苷、云抗10號的槲皮素-3-O-β-D-龍膽雙糖苷、云抗14號的牡荊素鼠李糖苷等整體含量相對較高；清水3號的蘆丁、牡荊素鼠李糖苷和山柰酚-3-O-蕓香糖苷、香歸銀毫的槲皮素-3-O-葡萄糖苷、云抗10號的楊梅素-3-O-半乳糖苷和槲皮素-3-O-葡萄糖苷、云抗14號的槲皮素-3-O-β-D-龍膽雙糖苷和牡荊素葡萄糖苷、云茶普蕊的山柰酚-3-O-葡萄糖苷等整體含量相對較低。相同嫩度不同品種間比較，單芽、一芽一葉、一芽二葉嫩度時，分別以云抗10號、清水3號、清水3號的黃酮苷總量最低，均以云抗14號黃酮苷總量顯著較高（P＜0.05）（且分別比最低值高出了82.50%、63.85%、145.36%）；一芽三葉嫩度時，以清水3號的黃酮苷總量最低，以香歸銀毫的黃酮苷總量顯著較高（P＜0.05）（且比最低值高出了98.09%）。由以上可知，不同茶樹品種的黃酮苷類物質的含量不同，且在不同嫩度鮮葉間的分布具有一定的規(guī)律性，整體上均為嫩度越高，黃酮苷含量越低。

2.1.5 不同品種和嫩度鮮葉可溶性糖組分的變化規(guī)律 可溶性糖是茶湯甜醇滋味形成的重要基礎物質[40]，目前關于云南大葉種糖組分的研究較少，本研究共檢測到3種可溶性糖組分，即β-D-呋喃果糖（以下簡稱果糖）、蔗糖、α-D-葡萄糖（以下簡稱葡萄糖）。由表3可知，檢測到的3種可溶性糖的單體以蔗糖的含量相對較高，單芽、一芽一葉、一芽二葉、一芽三葉蔗糖的平均質量分數(shù)分別為0.47%、0.30%、0.34%、0.83%，這與潘科等[41]研究結果顯示古樹茶鮮葉的糖組分以蔗糖含量最高的結果相似。相同品種不同嫩度間，各品種可溶性糖組分隨著嫩度的降低先降后增，或均隨著嫩度的降低而增加，整體上為一芽三葉時含量相對較高。即鮮葉的成熟度較高時，其可溶性糖含量相對較高，這與陳義等[5]研究結果相似。五個品種一芽三葉的果糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性糖、總甜度值的平均值相比單芽分別增加了194.74%、78.11%、62.96%、84.48%、97.75%。這可能是由于隨著鮮葉成熟度的增加，葉片中的葉綠素接受光能進行“碳素同化”積累碳水化合物，淀粉、蔗糖的含量逐漸增加[42]，而可溶性糖主要來自于淀粉分解，從而導致了相對成熟的鮮葉中可溶糖含量較高。相同嫩度不同品種間，單芽的云抗14號同時具有相對較高的蔗糖、葡萄糖、可溶性糖總量、總甜度值；一芽一葉、一芽二葉的清水3號同時具有相對較高的果糖、蔗糖、可溶性糖總量、總甜度值；一芽三葉的云茶普蕊同時具有相對較高的可溶性糖組分、可溶性糖總量及總甜度值。可見不同品種的鮮葉在相同的嫩度下對滋味甜醇度的影響不同，體現(xiàn)了不同品種的茶樹在呼吸作用、光合作用等的差異。茶葉加工過程中的逆境脅迫和熱處理等會通過引起多糖的水解及可溶性糖的美拉德反應而導致可溶性糖含量的變化，因此在明確鮮葉嫩度間可溶性糖的變化規(guī)律的同時，通過加工技術調控其含量可有效提升茶葉品質。

表3 各品種鮮葉嫩度間可溶性糖組分含量的變化（%）Table 3 Changes of soluble sugar component contents of fresh leaves with different tenderness of all cultivars (%)

對于綠茶加工，茶多酚含量低的鮮葉所制綠茶茶湯的澀味感會相對減弱；相對高含量的氨基酸及低的酚氨比值（小于8）可增加茶湯的鮮爽度[43]；鮮葉咖啡堿質量分數(shù)低于3.8%時有利于綠茶品質的形成[44]；綠茶茶湯中的苦味與EGCG和ECG濃度高度相關，澀味與ECG密切相關[39]。對于紅茶加工，相對高含量的茶多酚、總兒茶素有利于氧化聚合成與紅茶品質正相關的茶黃素、茶紅素等物質；相對較高含量的簡單兒茶素和相對較低含量的GA，有利于降低茶湯的苦澀味；咖啡堿可提高大葉種紅茶品質[45]，且紅茶茶湯中的咖啡堿可與茶湯中的綠原酸形成復合物，減弱茶湯的粗澀味，提高茶湯的鮮爽度[46]。故結合2.1.1～2.1.2的結果可知，大葉種茶樹單芽、一芽二葉嫩度的鮮葉分別具備了加工綠茶和紅茶的較佳物質基礎。進一步綜合2.1.3～2.1.5的研究結果可知，單芽嫩度中的云抗14號同時具有相對高含量的氨基酸、可溶性糖，較低的酚氨比、總酯型兒茶素、總兒茶素、黃酮苷等值，相對適制綠茶；一芽二葉嫩度中的清水3號同時具有較高的總兒茶素、總簡單兒茶素、PPO、POD、可溶性糖等值，較低含量的GA、黃酮苷，相對更適制紅茶。茶葉品質及適制性不是單一物質的表現(xiàn)結果，是各成分通過復雜的化學反應綜合作用的呈現(xiàn)，除了本研究中涉及到物質外，其他有機酸、氨基酸組分等滋味品質成分在云南大葉種新梢中的分布規(guī)律仍需進一步研究。

2.2 不同嫩度大葉種茶樹新梢滋味相關物質的聚類與判別模型分析

2.2.1 不同嫩度大葉種茶樹新梢滋味相關物質的PLS-DA和HCA分析 為進一步分析不同嫩度間鮮葉滋味品質的差異性，運用偏最小二乘判別分析（PLS-DA）分析上述33個成分指標，結果見圖4。PLS-DA模型可將4個嫩度分為2類，單芽和一芽一葉差異較小，可視為一類，一芽二葉和一芽三葉間的差異較小，可視為一類。采用交叉驗證法對該模型進行驗證，共篩選出了4個主成分，4個主成分解釋了79.8%的自變量，4個主成分解釋了90.4%因變量，對不同嫩度鮮葉品質的預測能力為72.3%，表明該模型較穩(wěn)定。

圖4 各品種不同嫩度茶樹新梢滋味相關物質的PLS-DA模型散點圖（A）、200次置換檢驗圖（B）、因子載荷圖（C）和VIP條形圖（D）Fig.4 PLS-DA model score scatter plot (A), 200 crossvalidation test plot (B), factor loading plot (C) and VIP bar chart(D) of flavoring substances in new shoots of tea trees with different tenderness of various varieties

通過PS-DA模型的載荷圖和VIP圖可進一步解釋兩個等級的貢獻變量指標，GA、AA、GCG、TETC/TSC與單芽和一芽一葉具有較高的相關性；TSC、TAC、TPA、POD、FlVs與一芽二葉、一芽三葉具有較高的相關性。

為了獲得PLS-DA模型下不同嫩度下的鮮葉的滋味品質的關鍵差異指標，通過PLS-DA模型的VIP值進一步篩選得到了9個差異性指標，即TETC/TSC、TSC、GCG、TAC、TPA、POD、FLVs、GA、AA等為2類嫩度區(qū)分貢獻度較大的指標，可見特征差異性指標值的不同導致不同等級下茶鮮葉的品質差別。由圖5可見，這9個指標在不同類別的鮮葉中均差異顯著。在云南大葉種茶葉的制作過程中，這可用于指導茶鮮葉的分級采摘及分級加工。

圖5 兩類別鮮葉的特征差異化合物的散點圖Fig.5 Scatter plot of differential compounds between two groups of fresh leaves with different tenderness

HCA為一種無監(jiān)督模式識別方法，可將樣本數(shù)據(jù)按照相似度進行自然聚集。為進一步驗證和分析不同嫩度鮮葉的分類結果，基于33個品質成分采用HCA系統(tǒng)聚類分析方法，對茶鮮葉滋味指標進行了分類。由圖6可知，在20的距離水平上，樣品被聚類為兩類，其中單芽和一芽一葉聚為一類，一芽二葉和一芽三葉聚為一類。可見HCA結果與PLS-DA結果一致。

圖6 各品種不同嫩度茶葉的樹狀分布圖Fig.6 Cluster dendrogram of tea samples from different tenderness

2.2.2 基于Fisher判別的云南大葉種鮮葉原料嫩度的多指標分級 采用Fisher判別分析方法，對已知的鮮葉樣本進行訓練分析，根據(jù)不同分類的指標分布情況，建立起相應的判別函數(shù)。

根據(jù)PLS-DA和HCA的結果，將鮮葉分為2類，作為初始分類結果供Fisher判別模型進行訓練，并將PLS-DA識別到的9個指標作為評價鮮葉分類的初始影響指標。按照Fisher判別分析，建立了鮮葉分類的判別模型：

式中，F(xiàn)為判別值，X1～X9分別代表GA、GCG、TETC/TSC、TSC、TAC、FLVs、AA、TPA、POD。其特征值為5.494，方差貢獻率為100%，說明該方程可以解釋原始樣本100%的信息。在該判別函數(shù)下，單芽～一芽一葉的平均判別值即中心值為10.89，一芽二葉～一芽三葉的中心值為35.11，判別函數(shù)的臨界值為23.00。根據(jù)公式（7）對20組樣本的分類情況利用回代估計法計算分類誤判率，回判結果見表4。同時采用留一交叉驗證法[47]進行Fisher交叉分類的驗證。由表4可知，原始樣本的回判正確率為90%，只有2個樣本判斷錯誤；判別模型Fisher交叉分類對鮮葉的分類結果與實際結果的一致性達到85%，只有3個樣本的分類結果不同，說明本模型的判別函數(shù)準確度較高；同時外部驗證模型的正確率為81.25%?？梢姡⒌呐袆e函數(shù)能夠實現(xiàn)鮮葉嫩度品質的區(qū)分，且區(qū)分效果明顯。

表4 鮮葉類別的Fisher判別結果Table 4 Fisher discriminant results of categories of fresh leaves

3 結論

本研究系統(tǒng)闡明了不同品種和嫩度大葉種茶樹新梢主要滋味相關物質的分布差異性。對于云南大葉種，茶樹新梢的成熟度越高，TPA、TSC、TAC、蘆丁、FLVs、POD、SS等值相對越高，但GA、AA等值相對越低；TPS、TETC、CAF等值均隨著嫩度的降低而先升后降，一芽二葉時相對較高，平均質量分數(shù)分別為23.81%、11.10%、3.79%，比相對較低含量的一芽三葉的分別增加了7.67%、13.77%、10.22%。單芽為適制綠茶的較佳原料，以云抗14號略優(yōu)，一芽二葉為適制紅茶的較佳原料，以清水3號略優(yōu)。大葉種鮮葉黃酮苷組分中含量較高的為蘆丁，單芽～一芽三葉蘆丁的平均質量分數(shù)分別為0.04%、0.16%、0.45%、0.62%。可溶性糖組分中含量較高的為蔗糖，單芽～一芽三葉蔗糖的平均質量分數(shù)分別為

0.47%、0.30%、0.34%、0.83%。

另外，本研究揭示了不同嫩度大葉種茶樹新稍的品質分類。通過多元統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)大葉種鮮葉嫩度可分為單芽和一芽一葉、一芽二葉和一芽三葉2類，TETC/TSC、TSC、GCG、TAC、TPA、POD、FLVs、GA、AA為2類鮮葉中的差異物質，其中GA、AA、GCG、TETC/TSC等在單芽和一芽一葉顯著較高（P＜0.05）；TSC、TAC、TPA、POD、FlVs等在一芽二葉、一芽三葉中顯著較高（P＜0.05），在此基礎上構建立了不同類別鮮葉的判別函數(shù)模型，判別函數(shù)的臨界值為23.00，回判的正確率為90%，交叉驗證的正確率為85%，外部驗證的正確率為81.25%，該模型可以用于不同類別鮮葉品質的定性判別。

本研究將有助于進一步了解云南大葉種茶樹新梢滋味物質的分布規(guī)律及茶芽成熟過程中茶葉品質的形成機制，對云南大葉種的生產(chǎn)及品質調控具有指導意義，同時為其原料的采摘分級及標準化加工提供了理論基礎和科學依據(jù)，為茶鮮葉品質評價提供了技術支撐。有關大葉種鮮葉不同葉、梗等部位中滋味和香氣相關成分的分布，以及季節(jié)、海拔對大葉種品質成分的影響有待進一步深入研究。