尹賢敏，范潤勇，徐 偉，蒲立立，張 明，鐘佰明，周 茜

（南充市中醫(yī)醫(yī)院 藥學(xué)部，四川 南充 637000）

高血壓（hypertension）病屬中醫(yī)學(xué)“眩暈”“頭痛”等范疇[1]，是以體循環(huán)動脈壓增高為主要臨床表現(xiàn)的綜合性疾病，是由復(fù)雜和關(guān)聯(lián)病因引起的一種進(jìn)展性心血管綜合征，也是心腦血管病的第一危險因素[2]。高血壓發(fā)病率高、危害大，是心肌梗死、腦卒中、心力衰竭及慢性腎臟病等慢性非傳染性疾病的重要危險因素，已成為全球重大公共衛(wèi)生問題[3]。同時，高血壓易合并其他疾病，現(xiàn)已成為影響人類健康的第一大疾病[4]，具有較高的致殘率和致死率，給社會帶來沉重負(fù)擔(dān)[5]。肝陽上亢證是高血壓病最常見的中醫(yī)證型[6]，與其他中醫(yī)證型相比，其發(fā)生靶器官損害的程度可能會顯著增加[7]。

“天鉤平肝湯”為我院省名中醫(yī)徐仕宏主任中醫(yī)師的經(jīng)驗方，該方來自天麻鉤藤飲加減并結(jié)合了澤瀉湯而成，由天麻、鉤藤、石決明、羅布麻葉、酒黃芩、梔子、葛根、酸棗仁、首烏藤、川芎、白術(shù)、澤瀉等藥味組成。該方以天麻鉤藤飲加減配合澤瀉湯，以平抑肝陽結(jié)合滲濕利尿，即平肝降壓結(jié)合利尿降壓，用于治療肝陽上亢型高血壓等引起的眼花、震顫、失眠、頭痛、眩暈、耳鳴。由于該方未進(jìn)行系統(tǒng)性研究，本研究按照“三小、五方便”的原則，擬將其研發(fā)為顆粒劑，并采用高效液相色譜（HPLC）法，以天麻素、梔子苷、黃芩苷、葛根素及固體總量為評價指標(biāo)，考察提取次數(shù)、提取時間、加水倍數(shù)，采用熵權(quán)法（信息熵法）分析各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，結(jié)合Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法結(jié)果優(yōu)化天鉤平肝復(fù)方的最佳提取工藝參數(shù)，為臨床提供安全、有效、便捷的中藥制劑品種。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Ultimate 3000型高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；AUW220D分析天平（日本島津公司）；FA2004分析天平（上海力辰科技儀器有限公司）；G-100S型超聲波清洗器（深圳市哥能清洗設(shè)備有限公司）；SHZ-D（III）型循環(huán)水真空泵（上海力辰科技儀器有限公司）；RE-1102型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海嘉鵬科技有限公司）；SYG-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州朗越儀器廠）；WGL-45B型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；LCK2000煎藥機(jī)（天津三延精密機(jī)械有限公司）。

1.2 試藥

梔子苷（批號：110749-201919，純度：97.1 %），葛根素（批號：110752-201816，純度：95.4 %），天麻素（批號：110807-201306，純度：96.8 %），黃芩苷（批號：110715-202122，純度：94.2 %，中國食品藥品檢定研究院）；天麻（批號：200501），鉤藤（批號：210601），酒黃芩（批號：200501），石決明（批號：201201），梔子（批號：200401），酸棗仁（批號：201201），首烏藤（批號：210401），毛冬青（批號：191201），澤瀉（批號：200501），葛根（批號：201201，成都吉安康藥業(yè)有限公司）；羅布麻葉（批號：C364210701），紅花（批號：201201，成都欣福源中藥飲片有限公司）；川芎（批號：210617），合歡皮（批號：210519，四川和順康藥業(yè)有限公司）；白術(shù)（批號：D202109002A，四川香雪制藥有限公司）。本研究所用中藥飲片經(jīng)南充市中醫(yī)醫(yī)院張德明中藥師鑒定。乙腈為色譜純，水為怡寶純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 天鉤平肝復(fù)方提取

取天麻約10 g，酒黃芩約15 g，梔子約15 g，葛根約30 g等全部處方藥味，加水適量，煎煮提取數(shù)次，每次提取1.5 h，提取液濃縮至500 ml。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液制備 取2.1項下濃縮后提取液，搖勻，精密量取1 ml，置25 ml量瓶中，加純水至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.2 陰性對照樣品溶液制備 分別稱取缺天麻、梔子、酒黃芩、葛根的天鉤平肝復(fù)方處方，按2.2.1項下方法分別制備缺天麻、梔子、酒黃芩、葛根的陰性樣品溶液。

2.2.3 對照品溶液制備 分別取梔子苷、葛根素、黃芩苷、天麻素適量，置50 ml量瓶中，加50 %甲醇溶液至刻度，配制成濃度分別為86.4，591.48，500.1，101.4 μg/ml的對照品溶液，即得。分別精密量取上述梔子苷對照品溶液4.34 ml，葛根素對照品溶液1.50 ml，黃芩苷對照品溶液5.0 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇，配制成含梔子苷15 μg/ml、葛根素35.5 μg/ml、黃芩苷100 μg/ml的混合對照品溶液。

2.3 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；色譜柱Agilent Zorbax SB-Phenyl（4.6 mm×250 mm，5 μm）；溫度 25 ℃；流速1 ml/min。天麻素：以乙腈-0.1 %磷酸（5:95）為流動相；檢測波長為220 nm；進(jìn)樣量為10 μl；理論板數(shù)按照天麻素峰計算應(yīng)不低于5000。梔子苷、葛根素、黃芩苷：以乙腈-0.1 %磷酸為流動相，梯度洗脫：0～18 min，13 %乙腈；18～30 min，13 %～27 %乙腈；30～45 min，27 %乙腈；檢測波長238 nm，進(jìn)樣量2 μl；理論塔板數(shù)按梔子苷計算應(yīng)不低于1500。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取不同濃度的天麻素、梔子苷、葛根素、黃芩苷對照品溶液，按2.3項下色譜條件進(jìn)行檢測，以峰面積積分值（Y）對進(jìn)樣濃度（X，μg/ml）進(jìn)行線性回歸分析，各對照品的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍分別為：天麻素：Y=0.0326X+0.0388（R2=1.0000），線性范圍為25.35～304.9 μg/ml；梔子苷：Y=0.0453X+0.0024（R2=1.0000），線性范圍為3.75～45.00 μg/ml；葛根素：Y=0.0684X+0.0012（R2=1.0000），線性范圍為5.91～106.50 μg/ml；黃芩苷：Y=0.0221X+0.0748（R2=0.9999），線性范圍為5.01～30.00 μg/ml。結(jié)果顯示，天麻素、梔子苷、葛根素、黃芩苷在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.4.2 系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，理論板數(shù)按天麻素和梔子苷峰計算應(yīng)分別不低于5000和1500，分離度應(yīng)不小于1.5，拖尾因子應(yīng)在0.95～1.05之間。

2.4.3 專屬性考察 分別取供試品溶液、混合對照品溶液、天麻素對照品溶液，缺天麻、梔子、葛根、酒黃芩陰性對照溶液各2 μl，按2.3項下色譜條件進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖1、圖2。結(jié)果顯示，供試品溶液HPLC圖譜中與對照品溶液色譜在相同保留時間有對應(yīng)峰，證明其專屬性強(qiáng)。

圖1 天鉤平肝復(fù)方混合對照品HPLC圖譜

圖2 天鉤平肝復(fù)方天麻素對照品HPLC圖譜

2.4.4 精密度考察 取混合對照品和天麻素對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣或檢測6次，結(jié)果梔子苷、葛根素、黃芩苷和天麻素對照品色譜峰峰面積的RSD分別為0.2 %，0.17 %，0.66 %，0.25 %，均小于1 %，表明儀器精密度較高。

2.4.5 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，分別在0，2，4，8，12，24 h 6個時間點進(jìn)行檢測，結(jié)果梔子苷、葛根素、黃芩苷色譜峰峰面積的RSD分別為0.78 %，0.44 %，1.40 %，均小于2 %，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 重復(fù)性考察 按2.2.1項下方法，平行制備6份供試品溶液，按2.3項下色譜條件檢測。結(jié)果梔子苷、葛根素和黃芩苷峰面積的RSD值分別為2.78 %，1.08 %，1.57 %，均小于3 %，表明此方法重復(fù)性好。

2.4.7 加樣回收試驗 取已知含量的樣品溶液6份，按2.2.1項下方法制成供試品溶液，精密加入對照品溶液適量，按2.3項下色譜條件進(jìn)樣檢測，計算加樣回收率。梔子苷、葛根素、黃芩苷、天麻素的加樣回收率平均值分別為99.79 %，101.06 %，99.17 %，99.92 %，RSD分別為1.21 %，1.53 %，1.64 %，2.95 %，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.5 固體總量測定

按固體總量測定法[《中國藥典》（2020年版）通則3101[8]]測定天鉤平肝復(fù)方的固體總量。

2.6 天鉤平肝復(fù)方提取工藝優(yōu)化

2.6.1 Box-Behnken設(shè)計試驗方案 在前期單因素試驗的基礎(chǔ)上，以提取次數(shù)（A）、提取時間（B）、加水倍數(shù)（C）為考察因素，各因素選取低、中、高3個水平，分別以-1、0、1編碼表示，以梔子苷、葛根素、黃芩苷、天麻素及固體總量為評價指標(biāo)，按Box-Behnken設(shè)計試驗方案（表1）進(jìn)行提取。

表1 Box-Behnken設(shè)計因素與水平表

2.6.2 熵權(quán)法對數(shù)據(jù)的分析 信息熵是系統(tǒng)不確定性和無序程度的度量，除了度量數(shù)據(jù)包含的信息量，還可用于在多指標(biāo)評價系統(tǒng)中確定各指標(biāo)權(quán)重。該法是將每個評價指標(biāo)作為 1 個隨機(jī)變量，計算該指標(biāo)的熵權(quán)系數(shù)，其取值變異程度越大，越無序，提供的信息量越多，該指標(biāo)重要性越高。根據(jù)熵權(quán)法確定權(quán)重的計算步驟[9-10]，計算出梔子苷、葛根素、黃芩苷、天麻素、固體總量信息熵（Hi）值分別為0.9843，0.9863，0.9868，0.9776，0.9962，Hi值越大不確定性越大，包含的信息越多，熵權(quán)系數(shù)（Wj）分別為0.2282，0.1999，0.1914，0.3255，0.0550，Wj值越大其權(quán)重越大，其值總和為1，因此天麻素的權(quán)重最大。

2.6.3 Box-Behnken設(shè)計試驗結(jié)果 按2.3項下色譜條件測定梔子苷、葛根素、黃芩苷和天麻素，按2.5項下方法測定固體總量，采用熵權(quán)法進(jìn)行權(quán)重評分，計算公式為：綜合評分=（梔子苷含量/梔子苷含量最大值×0.2282+葛根素含量/葛根素含量最大值×0.1999+黃芩苷含量/黃芩苷含量最大值×0.1914+天麻素含量/天麻素含量最大值×0.3255+固體總量/固體總量最大值×0.0550）×100 %，結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken設(shè)計試驗結(jié)果

2.6.4 Box-Behnken設(shè)計模型擬和及方差分析 運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件，擬合梔子苷、葛根素、黃芩苷、天麻素和固體總量的綜合評分（Y）對A、B、C 3個因素的多元二次回歸模型，結(jié)果證明模型具有極顯著性差異（P＜0.01），回歸模型較優(yōu)。最終得到多元二次回歸方程為：Y=-553.3038+88.3788A+123.7525B+85.4588C+0.4150AB-2.1275AC+1.7050BC-13.3688A2-45.1750B2-4.0791C2，擬合方程調(diào)整后的R2為0.9062，表示此模型擬合程度良好，可用此模型對提取工藝進(jìn)行預(yù)測、分析。方差分析結(jié)果表明，A、A2、C2對綜合評分（Y）的線性效應(yīng)有極顯著影響（P＜0.01），B2對綜合評分（Y）的線性效應(yīng)有顯著影響（P＜0.05）。由試驗結(jié)果可知，此模型擬合有極顯著性（P＜0.01），且失擬項P＞0.05，說明實測值和預(yù)測值之間無失擬存在，誤差較小，說明此模型具有較好的預(yù)測性[11]。各因素對天鉤平肝復(fù)方提取工藝影響的主次順序為提取次數(shù)＞加水倍數(shù)＞提取時間，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面二次模型的方差分析

2.6.5 最佳提取工藝的優(yōu)化預(yù)測 根據(jù)擬合方程，采用Design-Expert軟件，優(yōu)化預(yù)測天鉤平肝復(fù)方提取工藝的最佳條件，繪制二次回歸方程等高線及3D響應(yīng)曲面圖，用于評價3個因素之間的交互強(qiáng)度[10]，確定天鉤平肝復(fù)方最佳的提取工藝，見圖3。預(yù)測得天鉤平肝復(fù)方最佳提取工藝為提取次數(shù)2.32次、提取時間1.57 h、加水倍數(shù)10.15倍，根據(jù)實際生產(chǎn)，最終優(yōu)化的天鉤平肝復(fù)方提取工藝為提取次數(shù)2次、提取時間1.5 h、加水倍數(shù)10倍。

圖3 響應(yīng)面圖及等高線圖

2.7 驗證試驗

按預(yù)測的最佳提取工藝，即提取次數(shù)2次、提取時間1.5 h、加水倍數(shù)10倍，平行3次試驗，按2.2.1項方法制備供試品溶液，按2.3項下色譜條件進(jìn)樣檢測，最終3次驗證試驗的綜合評分為88.92，89.34，89.78，平均評分為89.35，RSD值為0.4813 %。由此可知，優(yōu)化后的工藝穩(wěn)定性較好、重復(fù)性較高，表明所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測性。

3 討論

天鉤平肝復(fù)方治療由肝陽上亢、風(fēng)陽上擾、水飲內(nèi)停所致，證屬本虛標(biāo)實，而以標(biāo)實為主，治以平肝熄風(fēng)為主，佐以清熱安神、利水除飲之法，臨床療效確切，患者依從性較好，具有開發(fā)利用價值。

本文采用熵權(quán)法結(jié)合Box-Behnken設(shè)計[12-13]優(yōu)化了天鉤平肝復(fù)方提取工藝，其中熵權(quán)法可用于多指標(biāo)評價，具有科學(xué)合理性，星點設(shè)計-效應(yīng)面法也常用于中藥復(fù)方的提取工藝研究。通過預(yù)試驗、Box-Behnken設(shè)計結(jié)合響應(yīng)面法試驗和驗證試驗，確定了天鉤平肝復(fù)方最佳提取工藝為提取次數(shù)2次，提取時間1.5 h，加10倍量水。優(yōu)化后的天鉤平肝復(fù)方提取工藝穩(wěn)定性高、重復(fù)性好、利于批量生產(chǎn)，可為天鉤平肝顆粒成型工藝研究奠定基礎(chǔ)。