冷佳蔚，石 峰，杭寶建，薛維麗，張乃斌，鞏麗萍

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院 國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省仿制藥一致性評價(jià)工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250101）

鹽酸法舒地爾是一種蛋白激酶抑制劑即細(xì)胞內(nèi)鈣離子拮抗劑，分子結(jié)構(gòu)為5-異喹啉磺酰胺衍生物，能改善腦組織微循環(huán)，促進(jìn)神經(jīng)再生[1]。該藥由日本旭化成公司首先研發(fā)，1995年6月首次在日本上市。我國于2001年批準(zhǔn)日本旭化成公司進(jìn)口鹽酸法舒地爾注射液，商品名為“依立盧”[2-4]。

鹽酸法舒地爾是以5-異喹啉磺酸為原料、N, N-二甲基甲酰胺為催化劑，與二氯亞砜反應(yīng)，經(jīng)過堿化與高哌嗪取代反應(yīng)及減壓濃縮，再通過精制制得[5-7]。在反應(yīng)過程中生成的5-異喹啉磺酰氯鹽酸鹽會有殘存部分不能與高哌嗪充分反應(yīng)，殘留在反應(yīng)混合物中，重結(jié)晶精制過程中殘留的5-異喹啉磺酰

氯鹽酸鹽可能與重結(jié)晶溶劑中的甲醇或乙醇反應(yīng)，生成5-異喹啉磺酸甲酯或5-異喹啉磺酸乙酯。這兩個(gè)化合物均為基因毒性雜質(zhì)，超過一定含量時(shí)會誘導(dǎo)DNA損失，發(fā)生基因突變，對人體產(chǎn)生極大的危害[8]，因此有必要控制此類雜質(zhì)的含量。

目前報(bào)道的鹽酸法舒地爾雜質(zhì)的測定方法有液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用法等[9-12]?；蚨拘噪s質(zhì)一般為痕量殘留，靈敏度高的質(zhì)譜檢測法更能滿足檢測要求。本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了鹽酸法舒地爾中5-異喹啉磺酸甲酯和5-異喹啉磺酸乙酯的檢測方法，相比于高分辨質(zhì)譜檢測方法適用范圍廣，洗脫方式為等度洗脫，操作簡單，方法簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏，可用于鹽酸法舒地爾的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AB SCIEX Triple Quad 6500+超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國AB公司）；XSE205電子天平（瑞士Metter Toledo公司）；KQ-300GDV型恒溫?cái)?shù)控超聲器（昆山市超聲儀器有限公司）；Vortex-6渦旋振蕩器 （海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

5-異喹啉磺酸甲酯對照品（廣州佳途科技股份有限公司，批號：A2-12-12，純度：98.9 %），5-異喹啉磺酸乙酯對照品（廣州佳途科技股份有限公司，批號：C4X-13656-1808，純度：99.5 %）。甲醇（色譜純），甲酸（質(zhì)譜級），水為超純水。

樣品：鹽酸法舒地爾原料藥共7批（批號：1706001，1706002，1706003，1807001，1807002，1807003，Y1807001）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

液相色譜條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為0.1 %甲酸水溶液-0.1 %甲酸甲醇溶液（60:40），流速0.3 ml/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量1 μl。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）正離子掃描模式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子源溫度：550 ℃。定性、定量離子對、錐孔電壓、碰撞能量見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

2.2 溶液的制備

對照品溶液：取5-異喹啉磺酸甲酯、5-異喹啉磺酸乙酯各約10 mg，精密稱定，加甲醇定量稀釋制成含5-異喹啉磺酸甲酯、5-異喹啉磺酸乙酯均為5 ng/ml的溶液。

供試品溶液：取鹽酸法舒地爾樣品約12.5 mg，精密稱定，置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.3 專屬性

精密量取空白溶劑（甲醇）、對照品溶液、供試品溶液各1 μl，分別注入液質(zhì)聯(lián)用儀，記錄色譜圖?？瞻兹軇┡c供試品溶液中其他雜質(zhì)峰均不干擾5-異喹啉磺酸甲酯、5-異喹啉磺酸乙酯的檢測，表明該方法的專屬性良好，見圖1。

圖1 空白溶劑（A）、供試品溶液（B）和對照品溶液（C）的MRM色譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和范圍

精密稱取5-異喹啉磺酸甲酯、5-異喹啉磺酸乙酯各約10 mg，置于同一量瓶中，加甲醇定量稀釋成濃度分別為2，5，10，20，50，100，200 ng/ml的系列溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，分別注入液質(zhì)聯(lián)用儀測定。以溶液濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。5-異喹啉磺酸甲酯在2.05～205.32 ng/ml范圍內(nèi)，回歸方程為Y=61 714X+58 160，相關(guān)系數(shù)（r）為0.9997，5-異喹啉磺酸乙酯在1.90～190.24 ng/ml范圍內(nèi)，回歸方程為Y=86 787X+74 012，r為0.9998，均表明線性關(guān)系良好。

2.5 檢出限與定量限

取對照品溶液逐級稀釋，注入液質(zhì)聯(lián)用儀，記錄色譜圖，以信噪比3:1計(jì)算檢出限，2種雜質(zhì)的檢出限分別為0.51，0.48 ng/ml，以信噪比10:1計(jì)算定量限，2種雜質(zhì)的定量限分別為2.05，1.90 ng/ml。

2.6 精密度

取對照品溶液注入液質(zhì)聯(lián)用儀，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖，2種雜質(zhì)的保留時(shí)間的RSD值分別為0.66 %，0.48 %，峰面積的RSD值分別為2.05 %，1.59 %。另精密量取定量限溶液注入液質(zhì)聯(lián)用儀，連續(xù)進(jìn)樣6針，2種雜質(zhì)峰面積的RSD值分別為1.30 %，3.00 %，表明該方法精密度良好。

2.7 重復(fù)性

由于樣品中未檢出5-異喹啉磺酸甲酯、5-異喹啉磺酸乙酯，通過向供試品中加入5 ng/ml的5-異喹啉磺酸甲酯、5-異喹啉磺酸乙酯，得到的加標(biāo)供試品溶液作為重復(fù)性試驗(yàn)供試品溶液，同法制備6份，分別注入液質(zhì)聯(lián)用儀，計(jì)算2種雜質(zhì)測定結(jié)果的RSD值分別為1.69 %，1.62 %，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性考察

取對照品溶液，分別在0，2，4，6，20 h注入液質(zhì)聯(lián)用儀，記錄色譜圖，計(jì)算2種雜質(zhì)峰面積的RSD值分別為4.32 %，2.73 %，表明2種雜質(zhì)的穩(wěn)定性好。

2.9 回收率

本方法通過向陰性樣品中分別添加100 %濃度水平的硫酸二甲酯對照品溶液，平行進(jìn)行6次試驗(yàn)，按外標(biāo)法計(jì)算5-異喹啉磺酸甲酯、5-異喹啉磺酸乙酯的含量，以測得量與加入量的比值計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。5-異喹啉磺酸甲酯的回收率為102.84 %～105.68 %，RSD值為1.24 %；5-異喹啉磺酸乙酯的回收率為103.27 %～107.11 %，RSD值為1.57 %，表明該方法的回收率和精密度良好，滿足實(shí)際樣品的檢測需求。

表2 5-異喹啉磺酸甲酯與5-異喹啉磺酸乙酯的加標(biāo)回收率（n=6）

2.10 雜質(zhì)限度規(guī)定

5-異喹啉磺酸甲酯、5-異喹啉磺酸乙酯是鹽酸法舒地爾在重結(jié)晶精制過程中產(chǎn)生的磺酸酯類化合物，具有遺傳毒性，對人體危害較大。根據(jù)ICHM7基因毒性雜質(zhì)評估和控制的相關(guān)指導(dǎo)原則[13]及歐盟（EMA）對基因毒性雜質(zhì)限度指南規(guī)定[8]，人在長期服藥時(shí)基因毒性雜質(zhì)每天攝入量不能超過1.5 μg，鹽酸法舒地爾用法用量中規(guī)定每天最大服用量為90 mg，因此，可將5-異喹啉磺酸甲酯和5-異喹啉磺酸乙酯的限度規(guī)定設(shè)為不得過0.0017 %。

2.11 樣品測定

將7批鹽酸法舒地爾原料藥按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，注入液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行測定，記錄色譜圖和峰面積。按外標(biāo)法分別以224.1→129.0（m/z）離子峰面積計(jì)算5-異喹啉磺酸甲酯的含量，以238.0→210.0（m/z）離子峰面積計(jì)算5-異喹啉磺酸乙酯的含量，7批樣品中均未檢出上述2種雜質(zhì)，表明鹽酸法舒地爾原料生產(chǎn)工藝中2種磺酸酯類基因毒雜質(zhì)控制良好。

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定鹽酸法舒地爾中2種磺酸酯類基因毒雜質(zhì)含量的檢測方法，進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證并將方法用于實(shí)際樣品的測定。本方法采用常規(guī)三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀測定，通用性好，洗脫方式為等度洗脫，專屬性強(qiáng)、線性范圍寬、回收率高，操作簡便，樣品前處理簡單，結(jié)果可靠，重現(xiàn)性好，可用于鹽酸法舒地爾中2種磺酸酯類基因毒雜質(zhì)的測定。本研究有助于藥品生產(chǎn)企業(yè)對生產(chǎn)工藝中基因毒雜質(zhì)的控制，同時(shí)為藥品監(jiān)管提供技術(shù)支撐。