張迅杰，咸瑞卿，由鵬飛，鞏麗萍，李春煥，趙艷霞，彭 麗，石 峰*

（1.山東省食品藥品檢驗研究院 國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室 山東省仿制藥一致性評價工程技術(shù)研究中心，山東 濟南 250101；2. 華潤雙鶴利民藥業(yè)（濟南）有限公司 質(zhì)量部，山東 濟南 250200）

布洛芬（又名異丁苯丙酸）是芳基丙酸類衍生物中第一個用于臨床的非甾體類解熱鎮(zhèn)痛藥（NSAID）[1-2]，具有較強的抗炎、抗風(fēng)濕及解熱鎮(zhèn)痛作用，用于緩解輕至中度疼痛如頭痛、關(guān)節(jié)痛、偏頭疼、痛經(jīng)等，也可減輕普通感冒或流行性感冒引起的發(fā)熱[3]。布洛芬作為有效的環(huán)氧化酶（COX）抑制劑，尤其對COX-2有特異性的抑制作用，從而抑制炎癥部位原發(fā)性前列腺素合成酶（PGS）合成，降低 PGS引起的組織充血、腫脹及對周圍神經(jīng)痛覺的敏感性，達到抗炎鎮(zhèn)痛作用[4]；同時，由于其對前列腺素（PG）合成的抑制，使體溫調(diào)節(jié)定點恢復(fù)至正常水平，皮膚血管擴張而發(fā)揮解熱作用[5-7]。本研究建立一種測定血漿中布洛芬濃度的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）方法，進行布洛芬顆粒在中國健康受試者空腹及餐后狀態(tài)下體內(nèi)藥動學(xué)及人體生物等效性研究，為布洛芬一致性評價提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AB SCIEX Triple Quad 5500液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（美國AB SCIEX公司）；3K15臺式高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；Allegra X-15R臺式高速冷凍離心機（96孔板，美國貝克曼庫爾特公司）；MDF-U5412N醫(yī)用低溫箱（日本松下公司）；Milli-Q Advantage A10超純水器（美國Millipore公司）；DG-2500R多管漩渦混合儀（上海巴玖實業(yè)有限公司）。

1.2 試藥

布洛芬對照品（純度：97.9 %，中國食品藥品檢定研究院）；布洛芬-d3對照品（化學(xué)純度：98 %，同位素內(nèi)標(biāo)純度：99.9 %，加拿大TRC公司）；甲醇，乙腈（色譜純，德國Merk公司）；甲酸（色譜純，美國ACS恩科化學(xué)公司）；N, N-二甲基甲酰胺[DMF，色譜純，賽默飛世爾科技（中國）科技有限公司]；受試制劑：布洛芬顆粒（規(guī)格：0.2 g，批號：200603N）；參比制劑：布洛芬顆粒（規(guī)格：20 %，1 g，批號：J94880，Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.）。

1.3 數(shù)據(jù)處理軟件

Analyst 1.6.3（美國AB SCIEX公司）；Watson LIMS 7.5 SPS1（美國賽默飛世爾公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的配制

2.1.1 布洛芬對照品溶液的配制 取適量布洛芬對照品，精密稱定，加DMF制成濃度為 2.0 mg/ml的布洛芬對照品溶液，-20 ℃避光保存。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)（布洛芬-d3）溶液的配制 精密稱取布洛芬-d3對照品適量，加DMF制成濃度為 2.0 mg/ml的內(nèi)標(biāo)儲備液；精密移取內(nèi)標(biāo)儲備液適量，用DMF溶液稀釋得濃度為100 μg/ml的內(nèi)標(biāo)工作溶液I；精密移取100 μg/ml內(nèi)標(biāo)工作溶液I適量，用0.1 %甲酸乙腈溶液稀釋，得濃度為0.5 μg/ml的內(nèi)標(biāo)工作溶液，-20 ℃避光保存。

2.2 樣品預(yù)處理

取2 ml深孔96孔板，每孔加100 μl血漿樣品，向其中加0.5 μg/ml內(nèi)標(biāo)工作溶液400 μl，渦旋混勻5 min，置4 ℃臺式高速冷凍離心機（96孔板）中離心10 min（4750 r/min） ，取上清100 μl，轉(zhuǎn)移至另一2 ml深孔96孔板，向新的96孔板中加入10 %乙腈水溶液300 μl稀釋，渦旋混勻5 min，待測。

2.3 分析條件

2.3.1 UPLC條件 色 譜 柱：Infinity Lab EC-C18（2.1 mm×50 mm，2.7 μm）；柱溫：40 ℃ ；流動相為 0.001 %甲酸水（A相）和乙腈（B相）；梯度洗脫程序見表1。流速：0.5 ml/min；進樣量：3 μl。

表1 梯度洗脫程序

2.3.2 質(zhì)譜條件 電離方式：電噴霧離子源（ESI），負離子模式；離子源溫度：550 ℃ ；檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；離子化電壓：-4500 V ；入口電壓（EP）：-10 V；碰撞室出口電壓（CXP）：-29 V；噴霧氣壓力（Gas1）：50 psi；輔助加熱氣壓力（Gas2）：55 psi；氣簾氣壓力：35 psi。布洛芬監(jiān)測離子對為m/z 205.1/161.1，碰撞能量（CE）：-10 V，去簇電壓（DP）：-50 V；布洛芬-d3監(jiān)測離子對為m/z 208.1/164.2，CE：-10 V，DP：-50 V。

2.4 試驗設(shè)計

本項目篩選48例受試對象，身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為18.0～28.0 kg/m2；受試者均進行健康體格檢查，心電圖、實驗室項目（血生化、血常規(guī)、傳染性疾病篩查等）、胸片及試驗相關(guān)各項檢查、檢測均正?；驘o臨床意義的異常；女性受試對象為非哺乳期，無妊娠狀態(tài)；所有受試對象均自愿參加本次臨床試驗，且均已簽署書面知情同意書并理解研究程序，能按試驗方案要求完成本研究項目。

本次臨床研究采用單中心、隨機、開放、單劑量、兩周期、兩序列、交叉、單次給藥試驗設(shè)計，進行空腹及高脂餐后兩種狀態(tài)下的制劑間生物等效性研究?？崭菇M24例受試者，餐后組24例受試者，空腹組和餐后組均隨機分為兩組，每組12人，按照給藥順序表分別給予受試制劑和參比制劑。所有受試者給藥方法：空腹或高脂餐后30 min口服，240 ml溫水服用 。給藥劑量為0.2 g。第I周期12例受試者口服受試制劑0.2 g，另12例受試者餐后口服參比制劑0.2 g，2 d后交叉給藥進行第II周期研究?？崭乖囼灒航o藥 0 h （給藥前 1 h內(nèi)）和 5 min，15 min，0.5 h，0.75 h，1 h，1.25 h，1.5 h，2 h，3 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h，共 15個時間點，分別采集靜脈血4 ml；餐后試驗：給藥0 h （給藥前1 h內(nèi)）和給藥后5 min，15 min，0.5 h，0.75 h，1 h ，1.25 h，1.5 h，2 h，3 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h，14 h，共 16個時間點，分別采集靜脈血4 ml，空腹或餐后采集的靜脈血均置EDTA-K2抗凝真空采血管中， 室溫放置，1 h內(nèi)離心（2000 g、4 ℃）10 min。室溫分離血漿，置超低溫冰箱（≤-60 ℃）中冷凍保存，用于血藥濃度測定。

3 結(jié)果與分析

3.1 方法學(xué)考察[8]

3.1.1 線性范圍 用移液器取適量空白血漿，用移液器加入不同濃度的布洛芬對照品溶液，配制濃度分別為0.200，0.400，1.00，3.00，9.00，18.0，24.0，30.0 μg/ml的布洛芬血漿樣品。分別按2.2項下方法處理樣品，按2.3項下分析條件測定。每個分析批的標(biāo)準(zhǔn)曲線采用雙校正樣品擬合，以布洛芬與布洛芬-d3的色譜響應(yīng)比值為縱坐標(biāo)（y），以血漿中布洛芬的濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/ml），采取加權(quán)（W=1/X2）最小二乘法進行線性回歸，求得回歸方程為y=0.299040x+0.00232731（n=11），擬合度r2為0.9988，校正樣品回算濃度均在要求范圍之內(nèi)，說明布洛芬在0.200～30.0 μg/ml范圍內(nèi)線性良好，由此計算的藥物濃度準(zhǔn)確可靠。本方法的定量下限為0.200 μg/ml，并滿足信噪比S/N＞10。

3.1.2 殘留 通過在注射高濃度樣品后注射空白基質(zhì)樣品（空白血漿）來評價殘留，結(jié)果見圖1。圖A為定量上限（30.0 μg/ml）樣品離子色譜圖，布洛芬和布洛芬-d3經(jīng)色譜分離后，均能得到較好的響應(yīng)值與峰形。圖 B為注射定量上限（30.0 μg/ml）樣品后的空白血漿樣品色譜圖。將圖 A 與圖 B進行比較，發(fā)現(xiàn)空白血漿樣品的色譜圖在布洛芬和布洛芬-d3的色譜峰附近沒有干擾峰出現(xiàn)，說明該方法的殘留小，對布洛芬和布洛芬-d3的定量均無影響。圖C為受試者服用布洛芬4 h后的血漿樣品離子色譜圖，結(jié)果表明該方法在用于實際血漿樣品測定時在相應(yīng)保留時間處無飄移。

圖1 各樣品的離子色譜圖

3.1.3 精密度與準(zhǔn)確度 配制含布洛芬定量下限（0.200 μg/ml）和低、中、高（0.600，4.00，20.0 μg/ml）4個濃度水平的質(zhì)控樣品，按 2.2項下方法處理樣品，在至少2 d內(nèi)測定3個不同分析批，評價本方法的批內(nèi)、批間準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果見表2。結(jié)果表明該方法精密度、準(zhǔn)確度均良好，符合中國藥典2020年版四部《通則9012生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則》。

表2 準(zhǔn)確度與精密度

3.1.4 選擇性、基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

3.1.4.1 選擇性 取6個受試者的空白血漿制備空白基質(zhì)樣品與定量下限樣品，空白基質(zhì)樣品除用400 μl 0.1 %甲酸乙腈溶液代替內(nèi)標(biāo)工作溶液外，其余步驟按2.2 項下方法進行預(yù)處理，定量下限樣品按2.2項下方法進行前處理，進樣分析。本研究6個受試者的空白基質(zhì)干擾組分在布洛芬和布洛芬-d3保留時間處的響應(yīng)均為0，表明該方法具有良好的選擇性，能區(qū)分布洛芬和布洛芬-d3與基質(zhì)中的內(nèi)源性組分。

3.1.4.2 基質(zhì)效應(yīng) 取6個受試者的空白基質(zhì)、1個高血脂空白基質(zhì)及1個溶血空白基質(zhì)制備不添加待測物和內(nèi)標(biāo)的空白基質(zhì)樣品，按2.2項下方法處理，向處理后的空白基質(zhì)樣品中分別加入低質(zhì)控濃度（LQC，0.600 μg/ml）和高質(zhì)控濃度（HQC，20.0 μg/ml）布洛芬和布洛芬-d3的混合溶液，配制基質(zhì)效應(yīng)評價樣品，進樣分析，所得布洛芬和布洛芬-d3響應(yīng)與相同理論濃度的純?nèi)芤簶悠返牟悸宸液筒悸宸?d3響應(yīng)比較，用內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子的變異系數(shù)（CV）評價基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表3。結(jié)果6個受試者、高脂及溶血空白基質(zhì)樣品的內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子的CV均不超過15 %，表明該方法的基質(zhì)效應(yīng)符合要求。

表3 基質(zhì)效應(yīng)評價結(jié)果

3.1.4.3 提取回收率 取空白基質(zhì)，按2.2項下方法處理，加入布洛芬和布洛芬-d3，進樣測定，比較二者的峰面積均值，考察布洛芬（低、中、高 3個質(zhì)量濃度）和布洛芬-d3的提取回收率。3種濃度布洛芬的提取回收率分別為115.3 %，113.3 %，116.5 %，布洛芬-d3的提取回收率為114.5 %。結(jié)果表明該方法提取回收率較高，在處理過程中不會對定量結(jié)果造成影響。

3.1.5 穩(wěn)定性 用新鮮制備的校準(zhǔn)標(biāo)樣及質(zhì)控樣品，考察放置不同儲存條件下的樣品中布洛芬的穩(wěn)定性。分別考察了血漿樣品反復(fù)凍融循環(huán)5次（冷凍條件：-80 ℃，融化條件：室溫）、室溫條件下放置27 h、蛋白沉淀后血漿樣品在自動進樣器溫度（8 ℃）條件下放置98 h及血漿樣品在冷凍條件下（-80 ℃，-20 ℃）放置61 d的穩(wěn)定性，結(jié)果見表4。由表4可見，布洛芬血漿樣品在考察條件下穩(wěn)定。

表4 不同條件下的穩(wěn)定性考察結(jié)果（±s，n=3）

表4 不同條件下的穩(wěn)定性考察結(jié)果（±s，n=3）

濃度水平/μg·ml-1放置后布洛芬濃度與放置前濃度比值/%室溫放置27 h自動進樣器溫度下放置98 h -20 ℃ -80 ℃0.600 102.8±0.1 101.2±0.1 96.3±0.1 94.5±0.1 98.7±0.1長期放置（61 d） 凍融20.0 103.5±0.2 102.5±0.2 93.5±0.5 93.5±0.5 99.5±0.2

3.2 布洛芬顆粒藥動學(xué)性質(zhì)及生物等效性

使用本研究建立的UPLC-MS/MS方法對血漿中布洛芬濃度進行測定，評價空腹和餐后條件下兩制劑之間是否具有生物等效性。以時間為橫坐標(biāo)、測定的布洛芬血藥濃度為縱坐標(biāo)，分別繪制空腹和餐后條件下受試制劑及參比制劑的布洛芬平均血藥濃度-時間曲線，見圖 2。

圖2 健康受試者在空腹（A，n=24）和餐后（B，n=24）條件下單劑量口服布洛芬顆粒受試制劑（T）或參比制劑（R）的平均血藥濃度-時間曲線圖

采用Phoenix WinNonlin 8.2軟件計算兩種布洛芬顆粒劑的藥動學(xué)參數(shù)（AUC0-t、AUC0-∞、Cmax、λz、t1/2、AUC_%Extrap），結(jié)果見表5。主要藥動學(xué)參數(shù)（AUC0-t、 AUC0-∞、Cmax）經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行多因素方程分析，同時采用（1-2α）計算兩種制劑的主要藥動學(xué)參數(shù)幾何均值比的90 %置信區(qū)間（CI），評價兩種制劑的生物等效性。24例受試者空腹口服布洛芬顆粒受試制劑和參比制劑的Cmax、AUC0-t、AUC0-∞幾何均值比的90 % CI分別落在86.03 %～102.50 %、100.50 %～108.15 %和100.53 %～108.09 %范圍內(nèi)，24例受試者餐后口服布洛芬顆粒受試制劑和參比制劑的Cmax、AUC0-t、AUC0-∞幾何均值比的90 % CI分別落在94.05 %～109.26 %、96.71 %～102.74 %和96.59 %～102.48 %范圍內(nèi)，均在80.00 %～125.00 %等效區(qū)間內(nèi)（包括邊界值），符合生物等效性評價標(biāo)準(zhǔn)。此外，本試驗中空腹給藥后布洛芬Cmax、AUC0-t、AUC0-∞的個體內(nèi)變異CV分別為17.80 %，7.41 %，7.33 %；餐后給藥組的個體內(nèi)變異CV分別為14.83 %，5.96 %、5.83 %，均小于30 %，不屬于高變異藥物。經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后的AUC0-t、AUC0-∞和Cmax多因素方差分析結(jié)果顯示給藥周期、給藥序列、個體、制劑間的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明本研究中兩種制劑在空腹和餐后條件下口服給藥均生物等效。

表5 空腹和餐后口服受試制劑和參比制劑后血漿中布洛芬藥動學(xué)參數(shù)（±s，n=24）

表5 空腹和餐后口服受試制劑和參比制劑后血漿中布洛芬藥動學(xué)參數(shù)（±s，n=24）

注：*tmax用中位數(shù)（最小值，最大值）表示

參數(shù) 空腹（CV/%） 餐后（CV/%）受試制劑 參比制劑 受試制劑 參比制劑*tmax/h 1.00（0.25，3.00） 0.25（0.25，1.50） 4.00（2.00，8.00） 4.00（0.25，8.00）Cmax/μg·L-1 21.8±4.21（19.3） 23.3±4.74（20.3） 10.7±2.25（21.1） 10.6±2.57（24.3）AUC0-t/μg·L-1·h-1 71.83±16.08（22.38） 69.02±16.34（23.68） 65.27±13.79（21.13） 65.76±16.37（24.90）AUC0-∞/μg·L-1·h-1 72.89±16.27（22.32） 70.04±16.53（23.60） 66.45±14.13（21.26） 67.12±16.93（25.23）λz/h-1 0.36±0.06（17.97） 0.35±0.05（15.34） 0.32±0.06（19.45） 0.32±0.06（20.37）t1/2/h 1.99±0.37（18.74） 2.00±0.30（15.22） 2.25±0.50（22.24） 2.31±0.60（25.89）AUC_%Extrap/% 1.47±0.54（36.50） 1.48±0.46（31.14） 1.76±0.96（54.83） 1.94±1.29（66.32）

4 討論

本研究建立的測定人血漿中布洛芬含量的方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確可靠、選擇性好、基質(zhì)效應(yīng)小、快速簡便等優(yōu)點。該方法使用0.1 %甲酸乙腈對血漿樣品進行蛋白質(zhì)沉淀，并將內(nèi)標(biāo)直接溶解于沉淀劑中，使操作步驟更簡化，減少了有機試劑的消耗。為獲得更高靈敏度和更好峰形，選用0.001 %甲酸水和乙腈為流動相。此外為了減小該分析方法的基質(zhì)效應(yīng)，將蛋白沉淀離心后的上清進行3:1稀釋（稀釋液：10 %乙腈水）。本試驗為布洛芬顆粒及布洛芬緩釋膠囊等制劑的生物等效性研究提供了數(shù)據(jù)參考，適用于布洛芬的血藥濃度檢測及藥動學(xué)研究，可為布洛芬顆粒及布洛芬相關(guān)制劑一致性評價提供依據(jù)。

受試者高脂高熱餐后口服布洛芬顆粒后，布洛芬的平均最大血漿濃度Cmax明顯降低， tmax較空腹服藥明顯延遲，這可能是由于胃排空速率受食物的影響，使藥物在胃中停留時間延長，從而降低了藥物的吸收速度和程度，這與國外研究的布洛芬片劑高脂飲食后的tmax與Cmax的變化趨勢一致[9]。此外，高脂高熱飲食后服藥較空腹條件下服藥AUC0-t減少，餐后服藥的tmax明顯延遲。因此食物對布洛芬顆粒的吸收速度和程度均有影響。