楊 紅，韓玲玲，雒 昱，張亞中，，吳德玲，劉軍玲，

(1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230051；3.國家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量研究與評價重點實驗室，安徽 合肥 230051；4.島津企業(yè)管理(中國)有限公司，上海 201108)

丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)為唇形科植物丹參的干燥根和根莖[1]，廣泛分布于安徽、陜西、山東、河南及四川等地[2]，是臨床常用的大宗藥材之一。目前，丹參多為人工種植，在種植過程中不可避免地會使用農(nóng)藥防治病蟲草害，從而產(chǎn)生農(nóng)藥殘留的質(zhì)量安全問題。近年來，中藥農(nóng)藥殘留問題日趨嚴重，已成為監(jiān)管部門和社會群體密切關注的問題[3]。盡管2020版《中華人民共和國藥典》四部對植物類中藥材和飲片中33種禁用農(nóng)藥(包括其代謝物、異構體共54個單體)給出了通用性的檢測方法，但中藥材基質(zhì)復雜，在提取殘留農(nóng)藥的同時，其自身所含的相關成分如油脂、色素、有機酸也會被一同提取出來，干擾檢測結果[4]，因此對其進行禁用農(nóng)藥殘留檢測依舊是實踐中值得探究的課題。

樣品前處理技術是農(nóng)藥殘留分析過程中繁瑣且易直接影響檢測結果的重要環(huán)節(jié)[5]。丹參中主要含有酚酸類、黃酮類以及含氮類化合物等化學成分[6]，基質(zhì)較為復雜。因此，筆者以丹參為研究對象，結合2020年版《中華人民共和國藥典》四部中33種禁用農(nóng)藥殘留前處理方法，從基質(zhì)效應和回收率方面篩選出較為合適的前處理方法并進行優(yōu)化，以期為丹參33種禁用農(nóng)藥殘留檢測提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器 TQ8040NX氣相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometer/mass spectrometer，GC-MS/MS)、LCMS-8050液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometer，LC-MS/MS)：SHIMADZU公司；真空平行濃縮儀、AH-50全自動均質(zhì)器：?？萍瘓F；飛鴿牌離心機：上海安亭科學儀器廠；XW-80AO渦旋混合器：上海滬西儀器分析廠；XP205 型十萬分之一電子分析天平：Mettler；Millipore Simplicity-185型超純水儀：Millipore公司。

1.2 主要試劑與材料 33種禁用農(nóng)藥混合標準品(批號 610020-202001)：中國食品藥品檢定研究院；磷酸三苯酯對照品(批號 S060565，濃度100 μg/mL)：SHIMESEM；質(zhì)譜純乙腈：Fisher Chemical公司；色譜純甲苯：TDEIA公司；甲酸銨、甲酸為色譜純；冰乙酸、氯化鈉為分析純；快速樣品處理法提取鹽包(6 g無水MgSO4，1.5 g無水乙酸鈉)；分散固相萃取凈化管(無水硫酸鎂900 mg，N-丙基乙二胺300 mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg，硅膠300 mg，石墨化碳黑90 mg)；HLB固相萃取柱(200 mg，6 mL)；石墨化碳黑氨基復合固相萃取小柱(500 mg/500 mg，6 mL)。

1.3 樣品 實驗用丹參樣品來源于安徽省食品藥品檢驗研究院所承擔的2021年國家評價性抽驗中的199批飲片和60批藥材。

2 方法

2.1 檢測條件

2.1.1 LC-MS/MS分析條件 色譜條件：色譜柱為Shim-pack Velox C18(2.7 μm，2.1 mm×100 mm)，柱溫40 ℃；流動相：以0.1%甲酸溶液(含5 mmol/L甲酸銨)為流動相A，以乙腈-0.1%甲酸溶液(含5 mmol/L甲酸銨)(95∶5)為流動相B；流速：0.3 mL/min；進樣量：2 μL；梯度洗脫程序：0～1 min(30%B)，1～12 min(30%～100%B)，12～14 min(100%B)。質(zhì)譜條件：電噴霧電離(electron spray ionization，ESI)離子源，正離子掃描，多反應監(jiān)測(multi reaction monitoring，MRM)，33種禁用農(nóng)藥監(jiān)測離子對及具體質(zhì)譜參數(shù)除水胺硫磷(兩對監(jiān)測離子對分別為291.00>231.00和291.00>121.10，碰撞電壓分別為15 V和40 V)外，其余質(zhì)譜參數(shù)參考2020年版《中華人民共和國藥典》通則“2341”第五法表7[7]。按照上述LC-MS/MS條件所得33種禁用農(nóng)藥混合標準溶液總離子流圖見圖1。

圖1 LC-MS/MS法檢測丹參中33種禁用農(nóng)藥殘留物混合標準品溶液總離子流圖

2.1.2 GC-MS /MS分析條件 色譜條件：色譜柱為SH-Rxi-17 MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；進樣口溫度：250 ℃，不分流進樣。載氣：高純氦氣；程序升溫：參考2020年版《中華人民共和國藥典》四部“2341”第五法[7]；進樣量：1 μL。質(zhì)譜條件：電子轟擊源，離子源溫度：250 ℃；碰撞氣：氬氣；質(zhì)譜傳輸接口溫度：250 ℃；MRM，33種禁用農(nóng)藥及內(nèi)標化合物監(jiān)測離子對及具體質(zhì)譜參數(shù)參考2020年版《中華人民共和國藥典》通則“2341”第五法表6[7]。按照上述GC-MS/MS條件所得33種丹參中禁用農(nóng)藥混合標準溶液及內(nèi)標化合物總離子流圖見圖2。

圖2 GC-MS/MS法檢測丹參中33種禁用農(nóng)藥殘留物混合標準品溶液及內(nèi)標總離子流圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密量取禁用農(nóng)藥混合對照品溶液(具體濃度見中國食品藥品檢定研究院官網(wǎng)：http://aoc.nifdc.org.cn/sell/home/search.html)1 mL，置20 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。低溫避光保存。

2.2.2 GC-MS/MS法分析用內(nèi)標溶液的制備 取磷酸三苯酯對照品溶液0.1 mL，加乙腈稀釋至100 mL，搖勻，得100 ng/mL磷酸三苯酯的內(nèi)標溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取樣品，按“2.3”項制備方法處理制成供試品溶液。

2.2.4 基質(zhì)匹配標準曲線溶液的制備 取空白基質(zhì)樣品，按“2.2.3”節(jié)的制備方法處理制成空白基質(zhì)溶液。分別精密量取空白基質(zhì)溶液1.0 mL(6份)，置真空平行濃縮儀上，40 ℃水浴濃縮至0.6 mL，分別加入混合對照品溶液10、20、50、100、150、200 μL，加乙腈稀釋至1 mL，渦旋混勻，即得。

2.3 樣品前處理方法

2.3.1 2020年版《中華人民共和國藥典》方法 包括3大類前處理方法：①直接提取法；②快速樣品處理法(quick，easy，cheap，effective，rugged and safe，QuEChERS)；③固相萃取法(固相萃取方式一；固相萃取方式二；固相萃取方式三)。

2.3.2 優(yōu)化QuEChERS法 將樣品粉碎，過三號篩。精密稱取3 g置于50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，加入10 mL水，再加入15 mL 1 %冰醋酸溶液，渦旋使藥粉充分浸潤，放置30 min，精密加入乙腈15 mL，渦旋混勻，置振蕩器上以每分鐘500次的頻率劇烈振蕩5 min，加入無水硫酸鎂與無水乙酸鈉的混合粉末(4∶1)7.5 g，立即搖散，再置振蕩器上每分鐘500次的頻率劇烈振蕩3 min，冰水浴10 min，離心(4 000 r/min)5 min，取上清液9 mL，置預先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管[無水硫酸鎂900 mg，N-丙基乙二胺300 mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg，硅膠300 mg，石墨化碳黑90 mg]中，渦旋，置振蕩器上每分鐘500次的頻率劇烈振蕩5 min，離心(4 000 r/min)5 min，精密吸取上清液5 mL，置平行濃縮儀上于40 ℃水浴濃縮至約0.4 mL，加乙腈稀釋至1.0 mL，渦旋混勻，濾過，取續(xù)濾液，得即。

2.4 測定法 參考2020年版《中華人民共和國藥典》通則“2341”第五法中測定法進樣[7]。

3 結果

3.1 2020年版《中華人民共和國藥典》方法添加回收試驗 取空白樣品精密加入混合對照品溶液(添加水平為定量限濃度水平，定量限采用2020年版《中華人民共和國藥典》通則“0212”定量限濃度)，按“2.3.1”項下方法制備供試溶液，按“2.1”項檢測條件和“2.4”項測定條件進樣，進行回收試驗，重復實驗6次，計算回收率。結果發(fā)現(xiàn)，采用《中華人民共和國藥典》3大類前處理方法時，受丹參基質(zhì)嚴重干擾，部分農(nóng)藥化合物回收率較低，說明藥典中的33種禁用農(nóng)殘方法不適用于丹參，因此需進一步優(yōu)化前處理方法。

3.2 優(yōu)化QuEChERS法與2020年版《中華人民共和國藥典》中QuEChERS法回收率結果比較 取空白樣品精密加入混合對照品溶液(添加水平為定量限濃度水平，定量限采用2020年版《中華人民共和國藥典》通則“0212”定量限濃度)，按“2.3.1”和“2.3.2”項下方法分別制備供試品溶液，按“2.1”項檢測條件和“2.4”項測定條件進樣，進行回收試驗，計算回收率。結果發(fā)現(xiàn)，采用優(yōu)化后QuEChERS法處理樣品時，丹參33種禁用農(nóng)藥殘留物的回收率明顯優(yōu)于藥典中QuEChERS法。見圖3。

圖3 兩種方法檢測的丹參中33種禁用農(nóng)藥殘留物回收率比較

3.3 優(yōu)化QuEChERS法的方法學考察

3.3.1 空白實驗 除不加樣品外，按“2.3.2”項供試品溶液制備方法制得1 mL空白溶液，按“2.1”項檢測條件和“2.4”項測定條件進樣分析。結果表明，實驗過程和方法對33種禁用農(nóng)藥的分析檢測均無干擾。

3.3.2 線性關系考察 將“2.2.4”項中的基質(zhì)匹配標準溶液，按“2.3.2”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項檢測條件和“2.4”項測定條件進樣。結果表明，在線性范圍內(nèi)，33種禁用農(nóng)藥及其相關代謝物、異構體線性良好。見表1。

3.3.3 回收率和精密度 取空白樣品精密加入混合對照品溶液(添加水平為定量限濃度水平，定量限采用2020年版《中華人民共和國藥典》“0212”定量限濃度)，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項檢測條件和“2.4”項測定條件進樣，進行回收試驗，重復實驗6次，計算回收率和RSD，結果見表1。

表1 線性關系考察及回收率試驗結果(n=6)

3.3.4 穩(wěn)定性 取空白樣品，精密加入混合對照品溶液(添加水平為定量限濃度水平，定量限采用2020年版《中華人民共和國藥典》通則“0212”定量限濃度)，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項檢測條件分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，按“2.4”項測定條件計算各個目標農(nóng)藥的回收率，計算RSD值。結果顯示，各個目標農(nóng)藥回收率的RSD值為2.14%～14.58%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4 樣品檢測 以優(yōu)化后的QuEChERS法對2021年國家評價性抽驗的丹參樣品中199批飲片和60批藥材進行檢測。結果發(fā)現(xiàn)，樣品中共檢出2種農(nóng)藥，甲拌磷檢出率為3.86%，克百威檢出率為1.93%，但殘留量均未超過2020年版《中華人民共和國藥典》限度規(guī)定。

4 討論

4.1 《中華人民共和國藥典》前處理方法的比較

4.1.1 基質(zhì)效應的比較 基質(zhì)效應是指樣品基質(zhì)中的某些共流出組分會影響待測物測定結果的準確性和重復性[8]。在GC-MS/MS分析中，農(nóng)藥多表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應，通常認為是待分析農(nóng)藥與硅醇基及其與玻璃襯管表面金屬離子間的相互作用所致。在LC-MS/MS分析中，農(nóng)藥多表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應，通常認為是由基質(zhì)干擾成分與目標化合物在ESI進行離子化時相互競爭造成[9-10]。

本研究以農(nóng)藥在空白基質(zhì)中的信號峰面積與在溶劑標準溶液中的信號峰面積比值計算基質(zhì)效應，若比值<80%，則認為存在弱基質(zhì)抑制效應；若比值為80%～120%時則認為沒有基質(zhì)效應；若比值>120%，則認為存在強基質(zhì)增強效應[11-12]。本研究比較了2020年版《中華人民共和國藥典》中禁用農(nóng)藥殘留檢測3類前處理方法(即直接提取法、QuEChERS法和固相萃取法)的基質(zhì)效應，發(fā)現(xiàn)采用QuEChER法時，在LC-MS/MS和GC-MS/MS分析中，分別有26.7%和40%的農(nóng)藥沒有基質(zhì)效應。與其余兩類前處理方法相比，QuEChERS法的基質(zhì)效應較小。

4.1.2 《中華人民共和國藥典》前處理方法對回收率結果的比較 本實驗考察了2020年版《中華人民共和國藥典》中禁用農(nóng)藥殘留檢測3類前處理方法對回收率結果的影響。結果發(fā)現(xiàn)，當采取固相萃取方式一和固相萃取方式三為樣品前處理方法時，由于磺隆類農(nóng)藥為酸性農(nóng)藥，上述兩種方法中凈化填料N-丙基乙二胺和氨基會對其產(chǎn)生嚴重吸附，導致其回收率極低；除此之外，發(fā)現(xiàn)部分有機磷類農(nóng)藥(苯線磷、甲拌磷、特丁硫磷、內(nèi)吸磷及其相關代謝物或異構體)受丹參基質(zhì)影響，《中華人民共和國藥典》3類前處理方法回收率均未能滿足《中華人民共和國藥典》規(guī)定。同時，研究發(fā)現(xiàn)采用QuEChERS時，33種禁用農(nóng)藥化合物的回收率為60%～130%時分布的個數(shù)最多，占總數(shù)的94.44%。

在實際樣品分析中，丹參中存在大量色素，會污染檢測儀器，干擾檢測結果，增加儀器維護成本。綜合考慮基質(zhì)效應、儀器維護成本和回收率結果，QuEChERS法較為適于作為丹參33種禁用農(nóng)藥殘留的前處理方法。但其中部分農(nóng)藥回收率無法達到檢測要求，故該方法需進一步優(yōu)化。

4.2 前處理方法的優(yōu)化

4.2.1 樣品中水的加入量的考察 QuEChERS法可測定高含水量(80%～95%)樣品中的農(nóng)藥，如蔬菜、水果類[13-15]。而中藥材含水量低，樣品與農(nóng)藥結合緊密，必須添加一定量的水，使樣品充分溶脹，以提高提取效率[16-17]。因此，本實驗在藥典QuEChERS法的基礎上，考察加水量分別為5、10、15 mL時禁用農(nóng)藥回收率的變化。結果發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，增加水的用量，會顯著提高高極性農(nóng)藥的回收率，但當水的容積為15 mL時，其對目標農(nóng)藥的提取效率增加不明顯，故試驗組選擇加水量為10 mL。

4.2.2 浸泡時間的考察 本實驗將樣品加入10 mL水，渦旋混勻后，分別靜置5、15、30 min后，考察浸泡時間對農(nóng)藥回收率的影響。結果發(fā)現(xiàn)，加水后不同浸泡時間下的回收率沒有顯著差異，說明樣品加入水直接加入1%冰醋酸浸泡30 min可使樣品充分溶脹，故最終確定加入10 mL水后無需浸泡，再按照QuEChERS法進行樣品前處理。

農(nóng)藥不僅影響中藥材及其產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性，也影響其在國際市場的競爭力。本研究從基質(zhì)效應和回收率方面比較《中華人民共和國藥典》3類前處理方法，最終對QuEChERS法進行優(yōu)化。優(yōu)化后的QuEChERS法快速簡便，回收率良好，有針對性地對丹參中33種禁用農(nóng)藥殘留進行了準確檢測。