林千愉 張 慧 梁 棟 張曉敏

氧是細(xì)胞代謝和生物產(chǎn)能的必需物質(zhì)，當(dāng)需氧量大于供氧量時(shí)，細(xì)胞需要迅速調(diào)整新陳代謝才能使組織存活。生物體對氧的感知影響一系列過程，包括生長發(fā)育、新陳代謝、pH動態(tài)平衡和血管生成等。缺氧是多種疾病的發(fā)病機(jī)制之一，如癌癥、心血管疾病和卒中等。處于缺氧狀態(tài)時(shí)，機(jī)體會啟動以缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)為主介導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)。Notch信號作為傳遞缺氧反應(yīng)的關(guān)鍵中間體，其與缺氧應(yīng)激在多個生理與病理過程中存在串?dāng)_。以下對HIF-1α/Notch1通路在缺氧致病機(jī)制中的作用的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 HIF-1α/Notch1通路概述

HIF是由不穩(wěn)定α亞基和穩(wěn)定β亞基組成的異二聚體。哺乳動物有3種HIFα亞型，其中HIF-1α在所有細(xì)胞中廣泛表達(dá)，而HIF-2α和HIF-3α在某些組織中選擇性表達(dá)。HIF-1α與HIF-2α的結(jié)構(gòu)相似，而HIF-3α以多重剪接變體的形式存在，部分參與抑制HIF-1α和HIF-2α的活性。當(dāng)持續(xù)性缺氧時(shí)，HIF-1α高表達(dá)并與HIF-β二聚化，通過其啟動子中的低氧反應(yīng)元件(hypoxic response element，HRE)激活下游基因表達(dá)參與典型缺氧反應(yīng)來對抗缺氧，如激活葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(glucose transporter 1,GLUT1) 的表達(dá)增加葡萄糖攝取，激活促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)的表達(dá)促進(jìn)紅細(xì)胞生成，激活血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)促進(jìn)血管生成等。缺氧誘導(dǎo)因子1抑制因子(factor inhibiting hypoxia inducible factor 1，F(xiàn)IH1)是調(diào)控HIF-1α的關(guān)鍵酶之一，該因子是一種天冬酰胺羥化酶，能夠感受細(xì)胞內(nèi)氧張力的變化，可通過使HIF-1α基因Asn803位點(diǎn)羥基化抑制HIF的反式激活活性。

Notch信號是一種進(jìn)化保守的細(xì)胞-細(xì)胞通訊機(jī)制，在多種細(xì)胞類型和不同發(fā)育階段起作用，是決定細(xì)胞命運(yùn)的重要通路之一。Notch信號的激活需要Notch受體(Notch1～Notch4)和Notch配體(Jagged1、Jagged2、Dll1、Dll3、Dll4)相互作用。在哺乳動物中，4種不同的Notch跨膜受體都可被膜系配體激活，其中Notch1作為最容易被監(jiān)測的Notch家族的受體，具有細(xì)胞表面受體和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的雙重功能，在腫瘤轉(zhuǎn)移及調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)方面有重要作用。解整合素金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase，ADAM )特別是ADAM10和某些情況下的ADAM17可介導(dǎo) Notch1 的 S2 位點(diǎn)切割，之后由γ-分泌酶在其 S3 位點(diǎn)切割，釋放出Notch胞內(nèi)段(Notch intracellular domain，NICD)，而NICD又轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并調(diào)節(jié)特定環(huán)境下的基因表達(dá)模式。同時(shí)，Notch信號的核心途徑的各個步驟均可調(diào)控，從而導(dǎo)致信號多樣性。

P?hlman和Poellinger的研究小組最早發(fā)現(xiàn)Notch靶基因在缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄組分析中被上調(diào)，提示Notch信號可能以某種方式與細(xì)胞的缺氧反應(yīng)相關(guān)[1]。HIF-1α可作為Notch信號的上游因子，通過與NICD相互作用及促進(jìn)配體表達(dá)等多個途徑激活Notch信號，提示了缺氧微環(huán)境中HIF-1α/Notch1通路的存在。

2 HIF-1α/Notch1通路的調(diào)控機(jī)制

Notch信號與缺氧之間的聯(lián)系代表了缺氧反應(yīng)的一個新方向。在典型的缺氧反應(yīng)中，缺氧通過改變HIF-1α的穩(wěn)定性和活性，導(dǎo)致HIF-1α與特定靶基因中含有HRE的調(diào)控元件結(jié)合，激活某些基因轉(zhuǎn)錄。作為傳遞缺氧反應(yīng)的關(guān)鍵中間體，Notch信號在典型的缺氧反應(yīng)介入后導(dǎo)致其信號的激活和下游基因的轉(zhuǎn)錄。在低氧條件下，HIF-1α與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)協(xié)同上調(diào)Vasorin蛋白的表達(dá)，Vasorin結(jié)合Notch1，調(diào)節(jié)其在細(xì)胞膜上的表達(dá)，從而校準(zhǔn)Notch通路的激活[2]；HIF-1α促進(jìn)NICD的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)NICD及其下游基因發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子1(hairy and enhancer of split 1，HES1)的表達(dá)[3]。此外，HIF-1α也可促進(jìn)Notch1配體Jagged1[4]和Jagged2[5]的表達(dá)，通過與Notch1受體結(jié)合導(dǎo)致Notch信號的激活。缺氧還可以通過增加γ-分泌酶的活性和釋放更多的NICD來促進(jìn)Notch1的活性[6]。HIF-1α作為Notch1-HES1負(fù)反饋環(huán)的阻滯劑，通過抑制HES1基因的轉(zhuǎn)錄激活，增強(qiáng)Notch信號的表達(dá)[7]。

但也有研究[8]發(fā)現(xiàn)，缺氧在增加特定細(xì)胞系中HIF-1α和HIF-2α表達(dá)的同時(shí)抑制了Notch1的激活，表明HIF的上調(diào)并不總是導(dǎo)致Notch信號的激活。缺氧與Notch信號之間的相互作用發(fā)生在多個水平上，Notch1抑制劑DAPT可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)控HIF-1α的表達(dá)[9]，Notch1 小干擾RNA(siRNA)處理可消除低氧誘導(dǎo)的滑膜內(nèi)皮細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)[10]，均提示在HIF-1α/Notch1信號通路中存在反饋環(huán)。HIF-1α及其下游靶基因的表達(dá)需要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和STAT3的磷酸化，Notch信號通路可促進(jìn)STAT3磷酸化來激活缺氧途徑，通過依賴于HES1的SRC/STAT3通路刺激HIF-1α靶基因的表達(dá)[11]。HIF-1α水平的增高通常被認(rèn)為是泛素化介導(dǎo)的降解受到抑制。最近有研究[12]結(jié)果表明其還受微RNA(microRNA，miRNA)控制,如miRNA-34a基因敲除可通過激活HIF-1α/Notch1信號通路減少腦缺血再灌注大鼠腦組織損傷和神經(jīng)細(xì)胞凋亡。HIF-1α蛋白水平和活性受PI3K/Akt介導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成和MEK/MAPK介導(dǎo)的翻譯后修飾的調(diào)節(jié)[13]，同時(shí)NICD的抗凋亡、促增殖和分化作用依賴于PI3K/Akt信號。Notch信號通過PI3K/Akt信號調(diào)控HIF-1α蛋白表達(dá)。

3 HIF-1α/Notch1通路在缺氧中的作用

3.1 生長發(fā)育 在哺乳動物心臟發(fā)育中，缺氧和HIF-1α通過調(diào)節(jié)發(fā)育中心臟的結(jié)構(gòu)生成和心肌發(fā)育而發(fā)揮重要作用。然而，缺氧和HIF-1α在干細(xì)胞心臟分化中的作用一直存在爭議，缺氧可以通過HIF-1α/Jagged1/Notch1信號通路促進(jìn)心肌干細(xì)胞早期心臟分化[14]，也可以抑制干細(xì)胞的心臟分化[15]。Notch信號通路參與了心肌細(xì)胞分化和心臟發(fā)育的多項(xiàng)調(diào)控，但其在干細(xì)胞心臟分化中可能發(fā)揮階段特異性的雙相作用[16-17]。有研究[18]結(jié)果表明，在心肌分化早期，缺氧可促進(jìn)HIF-1α過表達(dá)所誘導(dǎo)的NICD1-HIF-1α復(fù)合體的形成，在缺氧誘導(dǎo)的去分化脂肪(dedifferentiated fat, DFAT)細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化中起潛在作用。Notch信號通路可與缺氧相互作用，以保持肌源性細(xì)胞系C2C12、衛(wèi)星細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)[19]。

Notch信號在腎單位的形成中起關(guān)鍵作用，在成熟腎臟中不活躍，其在成熟腎臟中的重新激活與糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease,DKD)的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),包括足細(xì)胞損傷、腎小管間質(zhì)纖維化，以及可能的血管生成和免疫系統(tǒng)的激活。本課題組前期的研究[20]證明，高糖環(huán)境導(dǎo)致腎組織處于缺氧狀態(tài)，HIF-1α在足細(xì)胞細(xì)胞核中高表達(dá)。最新的研究[21]結(jié)果表明，Notch信號抑制劑DAPT可能通過提高抗氧化活性和增加HIF-1α的表達(dá)，從而減少糖尿病腎損傷。HIF-1α與Notch信號的串?dāng)_現(xiàn)象為進(jìn)一步研究DAPT對糖尿病腎功能的保護(hù)作用提供了新的思路。雖然現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，DAPT在糖尿病大鼠腎損傷修復(fù)中有很好的應(yīng)用前景，但因?yàn)檫@種細(xì)胞間信號在脊椎動物的發(fā)育和生理過程中發(fā)揮著多種作用，應(yīng)警惕Notch抑制的潛在不良反應(yīng)。

HIF-1α/Notch1通路不僅參與維持細(xì)胞活性及功能，同時(shí)作用于多種機(jī)體的生理過程。Notch-HES1信號通過失活p53和激活NF-κB信號來增強(qiáng)糖酵解，而敲除HIF-1α可顯著減弱活化Notch1誘導(dǎo)的糖酵解，表明糖酵解途徑受Notch信號和HIF的協(xié)同調(diào)節(jié)[11]。在低氧條件下，人脂肪源性基質(zhì)細(xì)胞(human adipose-derived stromal cell，hASC)為了維持未分化狀態(tài)，通過Notch信號顯著提高糖酵解速率和增殖效率，防止衰老[22]。髓核是椎間盤退變最早發(fā)生的部位，HIF-1α通過Notch1途徑調(diào)節(jié)人髓核細(xì)胞中Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的表達(dá)，維持細(xì)胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡[23]。脊索細(xì)胞是成熟椎間盤髓核內(nèi)所有細(xì)胞的胚胎前體，存在于髓核發(fā)育的早期，并保留在成年髓核中，其大量丟失被認(rèn)為是椎間盤退變的發(fā)病機(jī)制之一，而HIF-1α/Notch1通路的激活對于脊索細(xì)胞的維持是必不可少的[24]。

3.2 血管生成 血管生成是指在原有血管的基礎(chǔ)上分支形成新的微血管，包括內(nèi)皮細(xì)胞的新生、增殖和遷移，管狀血管的形成、分支和吻合等多個步驟的生物學(xué)過程。在缺氧條件下，血管生成這一過程起始于促血管生成因子與抗血管生成因子之間的不平衡，主要涉及VEGF/VEGF受體通路、血管生成素(angiopoietin, Ang)/Tie2軸和Notch通路3條信號通路。

血管生成對于腦卒中和其他神經(jīng)退行性疾病影響區(qū)域的神經(jīng)血管基質(zhì)重塑至關(guān)重要，有助于功能性神經(jīng)和突觸的生成。同時(shí)，血管生成可以改善缺血腦組織的灌注，較高的血管密度會適當(dāng)延長缺血性卒中后患者的存活時(shí)間。溶栓治療是腦梗死的一種有效治療措施，但由于治療時(shí)間窗短，未能及時(shí)治療的腦梗死患者預(yù)后較差。此外，即使溶栓成功，缺血后的持續(xù)再灌注通暢也會對腦組織造成繼發(fā)性損傷，即腦缺血再灌注損傷。HIF-1α作為缺氧或缺血過程中的主要調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)其靶基因血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1，HO-1)的表達(dá)，在缺血性卒中的腦血管生成中發(fā)揮重要作用，不僅介導(dǎo)VEGF/Notch1信號通路參與側(cè)支循環(huán)的形成，還可上調(diào)抗凋亡蛋白bcl-2、下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)[25]，顯示出神經(jīng)保護(hù)作用[26]。研究[27]發(fā)現(xiàn)，錦雞兒總黃酮通過激活HIF-1α/VEGF/Notch1信號通路促進(jìn)血管生成，保護(hù)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞免受缺氧復(fù)氧損傷。

血管生成還能有效改善缺血心肌的血供。促血管生成因子，如VEGF和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，可以顯著促進(jìn)缺血區(qū)側(cè)支血管的增殖，從而縮小梗死面積[28]。HIF-1α可激活多種基因的轉(zhuǎn)錄，包括VEGF、VEGF受體flt-1和bFGF[29]。

雖然，血管生成有利于缺血性疾病的治療，但血管生成同樣參與了多種疾病的發(fā)病過程。HIF-1α可通過Notch1/STAT3/內(nèi)皮素B型受體(endothelin receptor type B，ETBR)途徑調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞血管生成，參與子癇前期的發(fā)生[30]。同時(shí)，過度的血管生成容易引起動靜脈畸形，進(jìn)而增加出血的風(fēng)險(xiǎn)，一定程度上會導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜病變復(fù)雜化，增加糖尿病的冠狀動脈及外周并發(fā)癥發(fā)生[31]。HIF-1α和HIF-2α調(diào)控Notch1、Ang2和Dll4的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管形成，誘導(dǎo)胃腸道畸形血管生成，沙利度胺可逆轉(zhuǎn)這一作用[32]。上述研究結(jié)果提示，調(diào)節(jié)促血管生成和抗血管生成作用的平衡尤為關(guān)鍵。

血管生成已成為腫瘤治療的重要靶點(diǎn)之一。Notch1是腫瘤血管生成的調(diào)節(jié)因子，Notch-1過表達(dá)促進(jìn)了骨髓瘤的細(xì)胞生長和腫瘤血管生成。茶黃素雙沒食子酸酯(theaflavin 3,3’-digallate，TF3)在人卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞中通過抑制Notch1/c-Myc通路部分下調(diào)HIF-1α和VEGF，提示Notch 1/c-Myc途徑可能在TF3的抗血管生成作用中起輔助作用[33]。HIF-1α在調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞的分化和侵襲，以及螺旋動脈重建中起重要作用，可通過調(diào)控Notch1/ETBR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和血管生成[30]。HIF-1α/Notch1反饋環(huán)路在血管生成中發(fā)揮重要作用，因此，針對環(huán)路中的關(guān)鍵因子HIF-1α及Notch1的靶向治療可能為抗腫瘤血管生成提供一種新的治療策略。

3.3 上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT) EMT和腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為與腫瘤的惡性進(jìn)展有關(guān)。EMT的特征是細(xì)胞-細(xì)胞連接的溶解，以及頂端-基底極性的喪失，導(dǎo)致形成具有侵襲性的遷移性間充質(zhì)細(xì)胞。微環(huán)境氧水平的變化和HIF激活低氧信號通路被認(rèn)為是EMT的重要觸發(fā)和調(diào)節(jié)因子[34]。HIF-1α通過誘導(dǎo)EMT促進(jìn)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移。Notch信號是缺氧與EMT偶聯(lián)所必需的。HIF-1α的過表達(dá)通過調(diào)控依賴Notch信號通路的EMT促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Notch信號通路通過改變Snail的表達(dá)，調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin和系膜細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin的含量，從而導(dǎo)致EMT。癌癥干細(xì)胞(cancer stem cell, CSC)是具有自我更新和分化能力的一小部分癌細(xì)胞，在多種癌癥中推動腫瘤的起始、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。此外， CSC的富集還與化學(xué)治療耐藥有關(guān)。因此，CSC的靶向治療具有重要臨床意義。誘導(dǎo)EMT發(fā)生的一系列轉(zhuǎn)錄因子，包括HIF-1α、STAT3、Notch1、β-catenin、NF-κB和c-Jun，都在調(diào)節(jié)CSC中起著關(guān)鍵作用[35]。HES1基因是參與CSC自我更新的關(guān)鍵Notch通路靶點(diǎn)，HIF1α通過拮抗HES1基因的自動調(diào)節(jié)來增強(qiáng)Notch誘導(dǎo)的HES1表達(dá)，HIF-1α/Notch1通路對于維持常氧下血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的CSC必不可少，為靶向CSC治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤提供了有效的方法[36]。Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子2(Krüppel-like factor 2,KLF2)是一種腫瘤抑制因子，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、凋亡和血管生成等生物學(xué)過程。HIF-1α可介導(dǎo)包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種癌基因的進(jìn)展，抑制HIF-1α可抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的多藥耐藥。HIF-1α可以與Notch靶基因結(jié)合來調(diào)節(jié)其在癌癥干細(xì)胞中的信號傳遞。Notch-1信號還促進(jìn)結(jié)直腸癌的腫瘤形成，保護(hù)細(xì)胞免于凋亡。KLF2可通過抑制HIF-1α的表達(dá)來抑制Notch1的表達(dá)，并且HIF1α/Notch1信號參與了KLF2對結(jié)直腸癌細(xì)胞的作用[37]。

HIF-1α在低氧應(yīng)激下驅(qū)動腫瘤細(xì)胞的一系列細(xì)胞過程，包括糖酵解轉(zhuǎn)換、細(xì)胞周期進(jìn)展、血管生成和其他侵襲性行為，在許多類型的癌癥中其過度表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)的過表達(dá)促進(jìn)了MCF-7和MADMB-231細(xì)胞中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)和HIF-1α的表達(dá)。依賴于Nrf2的G6PD/HIF-1α的激活通過上調(diào)Jagged1和HES1的表達(dá)來激活Notch1的表達(dá)。Notch信號通路通過影響其下游基因HES-1來影響乳腺癌的增殖，并通過影響EMT通路的表達(dá)來調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的遷移[38]。二氯化鈷(CoCl2)誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)，刺激Notch1信號分子的激活，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上上調(diào)Snail的表達(dá)，從而增加人胰腺癌細(xì)胞MiaPaCa2細(xì)胞的侵襲力[9]。靶向HIF-1α/Notch1通路是一種潛在的抑制缺氧誘導(dǎo)的EMT增加和侵襲的治療策略。

4 結(jié) 語

缺氧是一系列疾病的重要生理特征，包括癌癥、心血管疾病和卒中等。缺氧通過影響基因表達(dá)在這些疾病的病理過程中起著積極的作用，從而使缺氧信號通路成為發(fā)展新的分子治療方法的關(guān)鍵目標(biāo)。其中HIF-1α與Notch1信號的串?dāng)_發(fā)生在多種生理及病理過程中，包括生長發(fā)育、EMT、血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生等，然而HIF-1α與Notch1相互作用的具體機(jī)制仍未被完全闡明。另外，應(yīng)對缺氧微環(huán)境的信號因子也不僅僅是HIF-1α與Notch1，對缺氧的具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍然比已知的更廣泛和更復(fù)雜，同時(shí)也不確定慢性缺氧下哪種機(jī)制起主導(dǎo)作用。然而，考慮到HIF-1α與Notch1兩信號之間相互作用參與缺氧的發(fā)生過程中，以多條信號通路為靶點(diǎn)可能是更有效的改善缺氧的潛在性可行策略，多種HIF-1α與Notch1的抑制劑在動物模型中起作用，然而將來最困難的挑戰(zhàn)是將這些有希望的策略轉(zhuǎn)化為臨床試驗(yàn)并進(jìn)一步應(yīng)用于臨床。缺氧可能是多種慢性疾病的關(guān)鍵致病機(jī)制，靶向缺氧介導(dǎo)的過程可能在設(shè)計(jì)新的干預(yù)策略以緩解或延緩疾病的進(jìn)展和改善臨床預(yù)后方面具有一定前景。