馮偉林 金群力 葉曉菊 呂明亮 蔡為明*

（1. 浙江省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所，浙江 杭州 310021；2. 龍泉市食藥用菌產(chǎn)業(yè)辦公室，浙江 龍泉 323700；3. 麗水市農(nóng)林科學院，浙江 麗水 323050）

菌種是食用菌生產(chǎn)的基礎(chǔ)，而液體菌種較傳統(tǒng)菌種生產(chǎn)效率、接種效率高，是代料食用菌生產(chǎn)實現(xiàn)從傳統(tǒng)生產(chǎn)向?qū)I(yè)化、集約化生產(chǎn)升級發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)之一[1]。液體菌種目前僅限于工廠化瓶栽金針菇、杏鮑菇、海鮮菇等少數(shù)幾種食用菌生產(chǎn)應用。袋栽食用菌尤其是黑木耳的高效液體菌種生產(chǎn)與應用工藝技術(shù)的研究報道較少。

通過對黑木耳液體菌種制備的適宜菌株[2]、配方、發(fā)酵條件等開展技術(shù)集成試驗，提出安全高效的黑木耳液體菌種制備工藝及質(zhì)量評價標準[3,4]。

1 液體專用母種的制作

采用PDA綜合培養(yǎng)基制作母種培養(yǎng)基，配方：土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、KH2PO41.5～2 g、MgSO40.5～1 g、水1 000 mL?？筛鶕?jù)需要采用營養(yǎng)加富培養(yǎng)基，即在上述配方基礎(chǔ)上，加入20 g麩皮或0.5 g蛋白胨。配制好的培養(yǎng)基用漏斗分裝至試管，試管口壁不粘培養(yǎng)基，塞棉塞，包牛皮紙。每7支或10支捆成一捆，管口用牛皮紙包好，直立于滅菌鍋內(nèi)，121～126 ℃、0.11～0.15 MPa下滅菌30 min，待培養(yǎng)基冷卻至60～70 ℃，將其擺成斜面，冷卻備用。

當培養(yǎng)基溫度降至30 ℃以下時，于無菌室內(nèi)接種，品種選用‘黑山’，將菌種用接種鉤接入空白培養(yǎng)基，動作迅速、準確。切取菌種時選遠離原老菌種的部位，一般培養(yǎng)基兩端的活力最強，菌種塊大小為1～2 mm，塊越小菌齡越一致。（26±1）℃避光培養(yǎng)，10天左右菌絲即可長好，菌絲生長健壯、潔白、均勻一致、無雜菌污染的，為優(yōu)良菌種。

2 搖瓶種制作

選用經(jīng)試驗優(yōu)化的配方：葡萄糖3%、蛋白胨0.3%、KH2PO40.05%、MgSO4·7H2O 0.05%、維生素B10.05%，制備培養(yǎng)基。培養(yǎng)液裝入三角瓶后塞棉塞，外包一層大小合適的紗布，再加蓋一層牛皮紙，用線繩綁好，放入滅菌鍋內(nèi)。0.10～0.12 MPa，恒壓滅菌35～40 min。待培養(yǎng)基冷卻后，于消毒過的超凈工作臺內(nèi)，每瓶接種2～3 mm見方的母種塊7～8塊，迅速轉(zhuǎn)接并封口。于25～27 ℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)1天后，置于磁力攪拌器或恒溫搖床上培養(yǎng)6～8天，控制溫度在25～27 ℃，轉(zhuǎn)速140～160 r/min。

3 發(fā)酵罐液體菌種生產(chǎn)

液體菌種生產(chǎn)對環(huán)境要求嚴格，生產(chǎn)地點應遠離粉塵污染嚴重的加工廠、公路、鬧市等區(qū)域，遠離產(chǎn)生有害氣體的化工廠和養(yǎng)殖場。發(fā)酵罐初次使用、長期放置、更換品種或出現(xiàn)雜菌等情況時，應采取煮罐和空消。蒸氣壓力0.15 MPa、溫度126 ℃，維持40 min。

3.1 培養(yǎng)基配制

選用經(jīng)試驗優(yōu)化的配方：玉米粉8.4 kg、黃豆粉8 kg、紅糖5 kg、蛋白胨1.2 kg、硫酸鎂270 g、磷酸二氫鉀540 g、水600 L；按照需要加入一定量的消泡劑。

原料加水攪拌均勻，不能有結(jié)塊，用吸管或漏斗通過上料口將原料加入罐體，裝液量為罐體容量的70%～80%，通入空氣攪拌1～2 min，混合均勻，擰緊上料口蓋。

3.2 滅菌

發(fā)酵罐加熱層通入冷水，水位低于排水口20 cm，關(guān)閉進、排水閥門加熱。待加熱層壓力達到0.05 MPa 時緩慢打開排氣閥降壓至0 MPa，關(guān)閉排氣閥，再次升壓至0.11 MPa；待發(fā)酵罐培養(yǎng)層壓力達到0.05 MPa時緩慢打開排氣閥降壓至0 MPa，關(guān)閉排氣閥，再次升壓至0.11 MPa，同時打開空氣過濾器滅菌，微開排氣閥，維持40～50 min。

3.3 冷卻

滅菌結(jié)束，關(guān)閉空氣過濾器滅菌閥與排氣閥，緩慢打開空氣過濾器排水閥，降壓至0 MPa，加熱層通入冷水降溫；同時緩慢打開發(fā)酵罐培養(yǎng)層排氣閥降壓，待壓力接近0 MPa時向培養(yǎng)層內(nèi)通入無菌空氣，調(diào)整排氣閥，維持罐壓0.04～0.05 MPa，培養(yǎng)液溫度降至25 ℃以下時，關(guān)閉加熱層進水閥。

3.4 接種

將發(fā)酵罐接種口用75%酒精消毒，輕微打開呼吸器閥門，使發(fā)酵罐壓力為0.01 MPa。點燃火焰圈，在火焰保護下用鑷子去掉接種管上的牛皮紙和棉塞，打開接種口閥門，將接種管插入接種口，將搖瓶菌種注入發(fā)酵罐。拔出接種管，關(guān)閉接種閥門，去掉火焰圈，打開空氣壓縮機。

3.5 發(fā)酵罐菌種培養(yǎng)

根據(jù)菌絲生長情況，適時調(diào)節(jié)進氣閥，通入適量無菌空氣，同時調(diào)節(jié)排氣閥，維持罐壓0.04～0.05 MPa，溫度控制在（26±1）℃，培養(yǎng)6～8天。

3.6 接種量

栽培袋折徑為15.8×37.8（cm）的料包，每包接菌種25～30 mL，800 L發(fā)酵罐，每罐可供接2萬包以上。

4 黑木耳菌種質(zhì)量檢測與分析評價

4.1 液體菌種質(zhì)量標準

色澤方面，菌絲球或菌絲片段呈白色，菌液呈淺黃色至淺棕色、透明。形態(tài)方面，菌液稍粘稠，有大量菌絲球或菌絲片段懸浮，分布均勻，不迅速分層，菌液不渾濁。排氣口氣味正常，有黑木耳液體培養(yǎng)時特有的香氣，無酸、臭等異味。顯微鏡下可見黑木耳菌種液體培養(yǎng)中特有的菌絲形態(tài)，球狀和叢狀菌絲體大量分布，菌絲粗壯，無雜菌。pH 4.5～5.5，菌絲濕重0.1～0.2 g/mL。

4.2 菌株活性保持檢測

取待用菌液、pH 8.4的Tris-HCl緩沖液和TTC溶液各400 μL至離心管中，于37 ℃反應3 h。反應完成后立即將樣品置于冰上，4 ℃離心再水洗2次，在離心后的細胞沉淀中加入1 mL無水乙醇萃取劑，室溫下從細胞中提取TF。12 000 r/min離心5 min后，取上清液0.7 mL在紫外分光光度計上測定485 nm處的吸光度，每處理3次重復?？捎米魍嘶昱c正常菌株的鑒別指標。

5 優(yōu)勢與存在問題

由于生產(chǎn)設(shè)備投資大，對技術(shù)要求高，液體菌種更適合于工廠化大規(guī)模生產(chǎn)，不僅縮短生產(chǎn)周期，而且可降低成本。生產(chǎn)中使用液體菌種相比使用固體菌種，具有以下優(yōu)勢：一是菌絲滿袋快，由于固體菌種接種只在培養(yǎng)料的表面萌發(fā)，而液體菌種則從上到下一起萌發(fā)，菌絲滿袋速度明顯更快；從接種到菌絲長滿，液體菌種需25～30天，而固體菌種則需要45～55天。二是菌種生產(chǎn)成本低。三是菌種生產(chǎn)周期短。四是栽培袋內(nèi)菌絲菌齡更為一致，耳更整齊，解決了固體菌種規(guī)?；a(chǎn)中菌種生長同步性差的問題。

雖然生產(chǎn)中應用液體菌種有諸多優(yōu)勢，但浙江地區(qū)以秋耳及春耳為主，液體菌種接種的菌包，培養(yǎng)期往往處于高溫高濕的環(huán)境中，菌包極易受到污染而報廢。又由于菌包生產(chǎn)時間集中，液體菌種發(fā)酵、接種設(shè)備投資大而利用率較低，導致制包公司對其投資不積極，制約了產(chǎn)業(yè)發(fā)展升級。