昌 震，李大同，楊小彬，孔令擘，孫 楊

(1.西安交通大學(xué)附屬紅會醫(yī)院脊柱外科，陜西 西安 710054；2.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院骨顯微外科，陜西 漢中 723000)

現(xiàn)代研究表明，許多中草藥具有放松關(guān)節(jié)、強化骨骼和肌肉的功能，并可用于治療骨損傷的相關(guān)疾病，如骨質(zhì)疏松癥。天然植物或藥物可以通過調(diào)節(jié)骨特異性基質(zhì)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、細胞因子、信號通路、骨保護素(Osteoprotegerin，OPG)與核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)受體活化因子受體配體(Receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)系統(tǒng)(即OPG-RANKL系統(tǒng))和激素類生物活性物質(zhì)的表達來促進成骨細胞的增殖與分化。奇壬醇(Kirenol，Kir)是一種天然單體，在一些實驗中顯示其對破骨細胞的分化有著抑制作用，為骨質(zhì)疏松癥的治療提供了新的前瞻性思路?，F(xiàn)就奇壬醇對骨質(zhì)疏松癥的治療作用及機制進行綜述。

1 骨質(zhì)疏松癥概述

骨質(zhì)疏松癥是常見的骨科疾病，其特點是骨量減少與骨組織微結(jié)構(gòu)的退化，極大地增加了骨折的風(fēng)險。脊柱骨折不僅顯著影響患者的生活質(zhì)量，增加社會醫(yī)療負擔(dān)，并且護理不當(dāng)也會導(dǎo)致病死率的增加。事實上，由于壽命延長和人口老齡化加劇，骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)病率在男性與女性人群中明顯增高[1]。骨質(zhì)疏松癥主要分為原發(fā)性和繼發(fā)性，包括絕經(jīng)后由于雌激素水平下降導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松(即絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥)。其次是繼發(fā)性疾病引起的骨質(zhì)疏松癥，這些疾病包括內(nèi)分泌疾病(如皮質(zhì)醇過多、甲狀腺功能亢進)、腎臟疾病(如尿鈣重吸收減少)、血液病(如多發(fā)性骨髓瘤和浸潤骨的惡性腫瘤等)、自身免疫或風(fēng)濕病(如炎癥性腸病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、營養(yǎng)不良、吸收不良(乳糜瀉等)等[2]。

骨質(zhì)流失是一個緩慢的、無癥狀的過程，一般很難發(fā)現(xiàn)。因此，骨質(zhì)疏松癥通常在骨折后才被發(fā)現(xiàn)，在早期可以通過改變生活方式、加強營養(yǎng)、戒煙和戒酒來預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[3]。目前，骨質(zhì)疏松癥的一線治療是通過藥物搭配鈣劑來補充日常骨骼代謝所需的成分，減輕或延緩骨質(zhì)疏松的發(fā)生[4]?？构琴|(zhì)疏松藥物包括減少骨吸收藥物(如雙膦酸鹽和地諾單抗)和加速骨形成藥物或兩者兼?zhèn)涞乃幬?如特立帕肽或阿帕羅品)，也有研究提出使用雌激素替代療法來治療骨質(zhì)疏松癥。這些藥物與治療方法可有效控制骨質(zhì)疏松癥，減少骨折的風(fēng)險，但長時間使用帶來的經(jīng)濟壓力與不良反應(yīng)是人們難以忽略的。盡管雌激素替代療法在改善骨密度和減少絕經(jīng)早期骨折發(fā)生率方面取得了積極的效果，但雌激素替代療法的長期使用受到潛在并發(fā)癥的限制，如乳腺癌、子宮出血和心血管等。雙磷酸鹽類藥物的長期服用會帶來頜骨壞死的風(fēng)險。在口服雙磷酸鹽類藥物治療骨質(zhì)疏松癥的患者中，頜骨壞死的發(fā)生率似乎相對較低，而在接受大劑量靜脈注射雙磷酸鹽的惡性腫瘤患者中則相對較高[5]。因此，最理想的治療效果是通過強化骨形成來加速新骨的形成，糾正骨質(zhì)疏松癥所特有的小梁微結(jié)構(gòu)不平衡，這種骨形成強化劑將為骨質(zhì)疏松癥的治療提供一個新的選擇[6]。

2 奇壬醇對骨質(zhì)疏松癥的治療作用及機制

骨骼的形成和吸收平衡受多種細胞信號、激素和生長因子的調(diào)控，這些信號和因子主要受RANKL與OPG的調(diào)節(jié)[7]。RANKL在骨髓基質(zhì)細胞(BMSC)和前骨細胞中，并在T細胞表面高度表達。當(dāng)RANKL與NF-κB受體活化因子受體(RANK)結(jié)合時，破骨細胞的分化和功能就會增強[8]。除上述途徑外，一些合成代謝信號途徑也積極參與骨的形成，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、細胞外因子(Wnt)和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)等[9]。Baron等[10]研究表明，Wnt途徑的激活會增加骨強度和骨密度，而其失活會增加骨的脆性。Runx2/Cbfa1和成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(OSX)對產(chǎn)生骨特異性基質(zhì)蛋白[包括堿性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型膠原蛋白(Col Ⅰ)、骨唾液酸蛋白(BSP)、骨橋蛋白(OPN)等]的基因調(diào)節(jié)至關(guān)重要，并最終刺激骨結(jié)核的礦化[11]。

Kir是一種具有生物活性的二萜類中草藥，具有抗風(fēng)濕的特性。據(jù)報道，Kir具有抗炎、促進傷口愈合、免疫調(diào)節(jié)、抗關(guān)節(jié)炎和抗光老化的活性[12]。此外，它還能促進成骨細胞的分化[13]。一項骨折愈合實驗研究顯示，Kir的使用可以促進骨折愈合，并隨著劑量的增加，促骨愈合的效果越好，這是由于Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)途徑的早期激活與Runx2途徑的持續(xù)活躍加速了骨形成。研究表明，Kir組大鼠在第10天的Wnt3a、β-catenin、T細胞因子(TCF)、脂蛋白相關(guān)蛋白5(LRP5)和 Runx2的表達增加量高于對照組，而在第10～21天對照組Wnt3a、β-catenin、Runx2和LRP5的表達增加量高于Kir組，這表明Wnt/β-catenin途徑在骨折愈合的早期階段更加活躍，Kir早期激活Wnt，隨后在鈣化過程中Wnt活性下降。除了對Wnt信號通路的影響外，Kir還增加了Runx2的水平。Kir可能通過促進成骨細胞的分化和增殖來促進骨愈合。此外，β-catenin水平的升高和Wnt途徑的激活可能有助于Runx2水平的增加。并且，Kir也可以通過增加Wnt3a和β-catenin的水平來激活Wnt途徑，加速成骨細胞的生成，這種作用隨著劑量的增加而增強。因此，Kir通過對Runx2和Wnt信號通路的激活促進了骨質(zhì)合成與骨愈合，減少了骨流失，這使得其可能可以控制以骨量流失為特征的疾病的進展[14]。

破骨細胞是一種大型的多核巨噬細胞，通過分泌抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和蛋白酶來發(fā)揮骨骼的吸收功能[15]。破骨細胞的調(diào)控主要依靠RANKL-RANK通路、絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)/激活蛋白(AP-1)和 Ca2+-活化T細胞核因子1蛋白(NFATc1)信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[16]。研究[17]表明，分別加入 50 μmol/L RANKL和 30 μmol/L 巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)可刺激破骨細胞分化，再加入1.25 μmol/L Kir處理2 h后發(fā)現(xiàn)其對破骨細胞的形成具有抑制作用，且無細胞毒性；此外，1.25～10 μmol/L的 Kir以劑量依賴的方式明顯減少了破骨細胞的骨吸收陷凹深度。單核早幼破骨細胞通過細胞融合的方式形成成熟破骨細胞，并具有骨吸收功能[18]。融合的多核細胞形成一個大的肌動蛋白環(huán)(即F-catin)，使其能夠吸收骨質(zhì)[19]。破骨細胞特異性基因[TRAP、破骨細胞相關(guān)受體(OSCAR)、組織蛋白酶K(CTSK)、破骨細胞多次跨膜蛋白(OC-STAMP)、人基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和 β3-整合素)]表達能夠誘導(dǎo)破骨細胞的形成和骨吸收。而研究[20]表明1.25 μmol/L和 5 μmol/L Kir能夠抑制破骨細胞特異性基因的表達，包括 TRAP、OSCAR、OC-STAMP、CTSK和MMP-9。

RANK-RANKL信號通路激活了F-actin的形成，在5 μmol/L Kir的實驗中減少了F-actin的大小和質(zhì)量，干預(yù)和抑制破骨細胞的形成并削弱了骨吸收的過程。NF-κB信號通路在破骨細胞形成的早期階段起著關(guān)鍵作用，NF-κB抑制因子α(I-κBα)、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)和NF-κB p65作為信號通路成分更容易被檢測到。1.25 μmol/L和 5 μmol/L Kir被證明可抑制I-κBα的降解和p65的磷酸化。5 μmol/L Kir對RANKL誘導(dǎo)的p65細胞質(zhì)水平的抑制增加了p65的核轉(zhuǎn)位?？傊?，Kir抑制了RANKL誘導(dǎo)的NF-κB信號通路激活。

除NF-κB外，在破骨細胞分化過程中，MAPK途徑誘導(dǎo)破骨細胞的生成。RANKL刺激MAPK中的p38、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERPK)的磷酸化[21]。研究發(fā)現(xiàn)，5 μmol/L Kir能明顯抑制p38和ERPK的磷酸化，但不抑制JNK的激活。激活蛋白-1(Ap-1)是破骨細胞分化過程中MAPKs下游的一個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，而c-Fos是 AP-1復(fù)合物的一個重要亞單位。研究表明，用RANKL刺激骨髓基質(zhì)細胞30 min 后，加入Kir可降低 c-Fos基因和蛋白質(zhì)水平。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，在 RANKL刺激 24 h后，c-Fos 核蛋白的表達也被 Kir抑制。

在破骨細胞中，NF-κB和MAPK/AP-1的激活會增強NFATc1的核位移，并觸發(fā)破骨細胞相關(guān)基因的表達，包括 TRAP、OSCAR、CTSK和β3-整合素，最終誘導(dǎo)破骨細胞的分化成熟和骨吸收。NFATc1是破骨細胞核內(nèi)細胞分化的主要轉(zhuǎn)錄因子，可被 Ca2+振蕩上調(diào)。據(jù)報道，NFATc1基因敲除的小鼠會表現(xiàn)出嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松與骨量降低[22]。RANKL的刺激則可顯著上調(diào)NFATc1基因和蛋白質(zhì)的表達。此外，NFATc1還受鈣離子內(nèi)流的調(diào)節(jié)[23]。然而，窖蛋白(Cav-1)的缺乏會使得破骨細胞在分化過程中下調(diào)NFATc1和c-Fos的表達[24]，減少破骨細胞的生成。Cav-1還增加了Ca2+振蕩的發(fā)生[25]。加入 1.25 μmol/L Kir處理后，NFATc1蛋白在細胞核中的表達明顯減少。5 μmol/L Kir則可明顯抑制RANKL刺激下的細胞Ca2+振蕩，這與它對NFATc1核轉(zhuǎn)位的抑制作用一致。有研究表明，Cav-1 mRNA和蛋白質(zhì)表達都可以被5 μmol/L Kir所抑制。因此，Kir在破骨細胞分化中對 NFATc1的抑制可能是通過抑制Cav-1表達、限制Ca2+振蕩來實現(xiàn)。

事實上，腫瘤壞死因子(TNF)在去卵巢(OVX)小鼠中骨流失作用的機制已經(jīng)得到驗證。TNF可以增強RANKL活性，誘導(dǎo)生成Th17細胞[26]。Th17細胞可以通過分泌白細胞介素(IL)-17A、RANKL、TNF、IL-1、IL-6以及低水平的γ干擾素(IFN-γ)來有效地誘導(dǎo)破骨細胞的生成，從而刺激骨吸收。IL-17A刺激包括成骨細胞在內(nèi)的炎癥細胞釋放RANKL并通過上調(diào)RANKL活性來增加破骨細胞的活性[27]。在患有骨質(zhì)疏松癥的絕經(jīng)后婦女的血清中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，IL-17A水平明顯升高。研究發(fā)現(xiàn)，雌激素通過雌激素受體α(ERα)的介導(dǎo)可以抑制CD4+T細胞分化為Th17細胞[28]，減少IL-17A的生成。此外，抑制IL-17A受體或使用抗IL-17A抗體都可能有限地減少OVX大鼠骨質(zhì)疏松的發(fā)生率[29]。這些研究表明了IL-17A在介導(dǎo)骨質(zhì)流失中的重要性。

在實驗性自身免疫性腦脊髓炎(eEAE)的研究中發(fā)現(xiàn)，Kir可以有效地減少小鼠體內(nèi)IFN-γ的產(chǎn)生，抑制產(chǎn)生IL-17A的CD4+T細胞的分化，在第25天收集的血清樣本中，與鹽水處理的對照小鼠相比，使用Kir的EAE小鼠血清中IFN-γ和IL-17A水平明顯降低，這說明使用Kir的EAE小鼠體內(nèi)的Th1/Th17等細胞明顯減少。也有進一步研究[30]顯示，Kir以濃度依賴的方式誘導(dǎo)CD4+T細胞發(fā)生凋亡。在膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)實驗中，可以觀察到CD4+、CD25+、Foxp3+、 IL-4+、CD4+T細胞數(shù)量的增加和IFN-γ+、CD4+T細胞數(shù)量的減少。因此，Kir對TNF-α和IL-17A的產(chǎn)生均有抑制作用。在CIA的實驗中也發(fā)現(xiàn)，對照組滑液中TNF-α、IL-17A和IL-6的水平增加，而在Kir或潑尼松龍組中的含量明顯降低。也有研究發(fā)現(xiàn)，在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠中，Kir預(yù)處理能明顯改善癥狀，減少結(jié)腸病變，使用Kir明顯降低了小鼠淋巴細胞對IFN-γ、IL-17A、IL-6和TNF-α的分泌，增加了淋巴細胞的凋亡率，尤其是 CD4+T細胞。這些研究表明，Kir的作用范圍很廣，對多種疾病的相似信號通路都有穩(wěn)定相似的作用。

Kir不僅對體外抑制破骨細胞生成和破骨細胞功能有積極作用，而且對OVX引起的骨質(zhì)疏松癥也有積極作用。研究發(fā)現(xiàn)，以2 mg/kg Kir與10 mg/kg Kir喂養(yǎng)OVX小鼠后，將股骨組織切片用HE和TRAP染色定量分析發(fā)現(xiàn)，小鼠BMD、骨小梁數(shù)目與骨小梁體積分?jǐn)?shù)明顯增加，而破骨細胞覆蓋面面積與骨面比和侵蝕面面積/骨面比都明顯減少，小鼠無不良反應(yīng)；在使用實驗小鼠的左股骨和脛骨骨髓基質(zhì)細胞進行的進一步培養(yǎng)實驗中，使用 2 mg/kg Kir和10 mg/kg Kir處理能顯著降低破骨細胞的分化和骨吸收能力。該實驗進一步證實了Kir既可抑制破骨細胞的形成，也可減輕因雌激素減低而引起的骨質(zhì)疏松癥[31]。

Cav-1是一種位于細胞膜上的重要結(jié)構(gòu)蛋白，具有膜運輸、膽固醇調(diào)節(jié)、內(nèi)吞作用、細胞生長中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和鈣平衡的功能，被認(rèn)為是控制破骨細胞分化的一個功能因子[32]。在OVX小鼠模型組中發(fā)現(xiàn)，Cav-1和 NFATc1 mRNA的表達升高，但經(jīng)2 mg/kg Kir與10 mg/kg Kir處理后，其水平在體內(nèi)明顯降低，而且破骨細胞中的特異性基因(如 TRAP、ATP6v0d2和CTSK)明顯減少，這表明Kir在體外和體內(nèi)都能夠抑制破骨細胞發(fā)生過程中Cav-1和NFATc1的表達。

3 結(jié) 語

骨質(zhì)疏松癥是一種多因素導(dǎo)致的骨質(zhì)流失疾病，大大增加了骨折的風(fēng)險。Kir作為具有生物活性的二萜類化合物，能夠通過抑制多種信號傳導(dǎo)途徑抑制破骨細胞的活性，以減少骨破壞和吸收，同時通過積極的途徑激活破骨細胞的生成以保持健康的骨量。Kir能抑制和屏蔽與各種骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的細胞，進一步降低骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險，預(yù)防OVX誘發(fā)的骨質(zhì)疏松癥。Kir為骨質(zhì)疏松癥等破骨細胞相關(guān)骨骼疾病的潛在治療方法提供了有利的選擇。