張曉放，陳士玲，蘆小單

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，長春 130117； 2.吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)診治實(shí)驗(yàn)中心，長春 130021；3.長春師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長春 130032)

線粒體功能障礙是神經(jīng)退行性疾病、肥胖、糖尿病以及腫瘤等重大慢性病的發(fā)病基礎(chǔ)。Parkin作為E3泛素連接酶在細(xì)胞質(zhì)中處于自抑制狀態(tài)，但在環(huán)境變化引起線粒體自噬的情況下，細(xì)胞質(zhì)中的Parkin被激活并被招募到線粒體上，通過人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因誘導(dǎo)的激酶1(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten gene-induced putative kinase 1,PINK1)/Parkin途徑介導(dǎo)細(xì)胞線粒體自噬，促進(jìn)線粒體質(zhì)量控制[1-3]。Parkin蛋白是一個(gè)多功能的蛋白，除了泛素連接酶的作用外，還具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的功能，且在不同的疾病中功能不同。目前，神經(jīng)退行性疾病帕金森病(Parkinson′s disease，PD)的病因及發(fā)病機(jī)制一直是科學(xué)研究的熱點(diǎn)，以往認(rèn)為，PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬途徑損傷是其主要原因[4]。近年在PD患者大腦病變相關(guān)的路易小體中發(fā)現(xiàn)，Parkin活性受損，從而導(dǎo)致其底物蛋白[氨酰基轉(zhuǎn)運(yùn)RNA合成酶復(fù)合物相互作用多功能蛋白2(aminoacyl transfer RNA synthase complex-interacting multifunctional protein 2，AIMP2)]蓄積，提示AIMP2作為Parkin的作用底物與路易小體包涵體的形成相關(guān)，故開發(fā)靶向AIMP2聚集的化合物可能具有治療PD的潛力[5-6]。此外，Parkin參與線粒體的選擇性降解，在青光眼的研究中發(fā)現(xiàn)Parkin對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞起到保護(hù)作用[7]。在肥胖與糖尿病中，過量的葡萄糖會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)線粒體DNA病變，線粒體自噬減少。研究發(fā)現(xiàn)，中藥黃芪甲苷、線粒體抗氧化劑可調(diào)節(jié)PINK1/Parkin的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)高血糖誘導(dǎo)的線粒體異常狀態(tài)[8]。在腫瘤的研究中，Parkin除了抑制絲氨酸合成及糖酵解途徑外，對(duì)腫瘤的生長也具有抑制作用[9-10]。在PARK2基因突變或缺失導(dǎo)致的疾病中，因Parkin缺乏導(dǎo)致其相應(yīng)的作用底物異常積累?，F(xiàn)就Parkin及其底物在線粒體功能障礙相關(guān)疾病中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 Parkin概述

1.1Parkin的結(jié)構(gòu) 1998年在研究常染色體隱性遺傳的PD時(shí)，研究者發(fā)現(xiàn)了Parkin基因，并將其命名為PARK2[11]。PARK2位于第6號(hào)染色體長臂第2區(qū)第5條帶的第2個(gè)亞帶到第7條帶，包含12個(gè)外顯子，長度約為1.5 Mb[1]。Parkin蛋白由465個(gè)氨基酸組成，分子量為52 000，廣泛表達(dá)于各種組織，最初有關(guān)其在大腦與肌肉組織中的研究較多，近年學(xué)者們開始關(guān)注其在脂肪組織與心臟組織中的功能[2]。在未激活狀態(tài)下，Parkin由六部分組成：N端類泛素Ubl結(jié)構(gòu)域、獨(dú)特的RING0結(jié)構(gòu)域、典型的RING1結(jié)構(gòu)域(通常與E2酶結(jié)合)、催化結(jié)構(gòu)域RING2、RING1結(jié)構(gòu)域和RING2結(jié)構(gòu)域之間的IBR結(jié)構(gòu)域以及分離IBR結(jié)構(gòu)域和RING2結(jié)構(gòu)域間的阻遏子REP區(qū)域[12]。

1.2Parkin的底物 近年來，關(guān)于細(xì)胞自噬和線粒體自噬的研究廣泛開展。研究發(fā)現(xiàn)，通過線粒體外膜蛋白泛素化降解誘發(fā)線粒體自噬作用的底物主要有線粒體外膜孔蛋白[13-14]、線粒體前體蛋白導(dǎo)入受體TOMM70A、線粒體融合蛋白1/2、線粒體裂變蛋白FIS1、動(dòng)力蛋白相關(guān)蛋白1、線粒體外膜蛋白mitoNEET、己糖激酶1和2、線粒體Rho GTP酶1、Bcl-2相關(guān)X蛋白等[15]。Hattori和Mizuno[15]對(duì)Parkin功能進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其中被Parkin多泛素化降解的底物有電壓依賴性陰離子通道蛋白1、線粒體Rho GTP酶1、線粒體融合蛋白1/2、己糖激酶1等。這些Parkin作用底物主要為線粒體外膜蛋白，但目前關(guān)于Parkin與線粒體內(nèi)膜蛋白作用的研究較少，還有待進(jìn)一步探索。

1.3Parkin的作用機(jī)制 正常生理情況下，Parkin的Ubl結(jié)構(gòu)域和REP連接體在空間上阻礙了RING1結(jié)構(gòu)域上的E2泛素連接酶的結(jié)合位點(diǎn)，且催化位點(diǎn)RING2被RING0封閉，使整個(gè)Parkin蛋白處于非激活狀態(tài)[16]。在環(huán)境變化引起線粒體自噬的情況下，RING2和E2的活性位點(diǎn)結(jié)合，Parkin被激活[17-18]。錨定在線粒體上的PINK1通過磷酸化作用，將激活狀態(tài)下的Parkin招募到線粒體上，啟動(dòng)線粒體自噬的過程。另外，由于Parkin的結(jié)構(gòu)中含有RING1結(jié)構(gòu)域，故除了與蛋白底物作用外，Parkin還具有DNA結(jié)合能力，可以同時(shí)表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄因子和泛素連接酶功能[19]。與此類似，RBCK1(RANBP2-type and C3HC4-type zinc finger containing 1)、E3泛素連接酶RAD18和MDM2(murine double minute 2)三種蛋白也具有直接結(jié)合DNA的能力和泛素連接酶的特性[20]。Parkin在缺氧的環(huán)境下會(huì)被招募至細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子雌激素相關(guān)受體α相互作用以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性，以直接或間接的方式調(diào)控機(jī)體能量和代謝過程。同時(shí)，Parkin表達(dá)增加能夠保護(hù)細(xì)胞線粒體毒物、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和蛋白毒性應(yīng)激等誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[19]。在調(diào)節(jié)線粒體自噬的基礎(chǔ)上，Parkin可能具有更加復(fù)雜多樣的功能。在氧化應(yīng)激、缺氧、線粒體DNA損傷等不同條件下，Parkin可能通過不同方式介導(dǎo)細(xì)胞器維持或降解的過程[12]，因此未來的研究需更加關(guān)注細(xì)胞和體內(nèi)的生理應(yīng)激源。

2 Parkin與線粒體功能障礙相關(guān)疾病

2.1Parkin與PD PD是一種慢性神經(jīng)退行性疾病，由大腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性變性缺失引起，以形成細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)包涵體為病理特征[21]。有學(xué)者對(duì)PARK2基因突變患者的神經(jīng)元模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，PARK2基因突變與線粒體DNA穩(wěn)態(tài)的受損相關(guān)[4]。目前，研究正在探索靶向特定PARK2基因突變誘導(dǎo)的功能障礙的治療方法。一種線粒體的小分子激活劑正在臨床前開發(fā)中，它能夠直接激活Parkin/PINK1或抑制泛素特異性蛋白酶30[22]。有研究認(rèn)為，由于PARK2基因突變的PD患者中以青少年較為多見，且合并癥的發(fā)生率較低，在治療上更適合選用多巴胺能細(xì)胞替代療法[23-24]。在PD患者大腦中還發(fā)現(xiàn)，形成路易小體的α-突觸核蛋白聚集與AIMP2相關(guān)，AIMP2作為Parkin的賴氨酸48泛素底物，被多聚泛素化[5]。因此，在關(guān)于路易小體形成的研究中，將AIMP2與PD的病理聯(lián)系確定為該蛋白作為Parkin的毒性底物在PD患者大腦中積累。且Parkin活性受損，導(dǎo)致其底物蛋白AIMP2蓄積，而液泡分揀蛋白35調(diào)節(jié)AIMP2的溶酶體降解，因而液泡分揀蛋白35的活性可能是防止AIMP2異常蓄積及其與α-突觸核蛋白共聚集的關(guān)鍵[5]。Lee等[25]通過實(shí)驗(yàn)證明，成年小鼠Parkin的缺失可能會(huì)觸發(fā)γ-突觸核蛋白的聚集并伴隨AIMP2的積累，隨后被重新分配到不溶性隔室中，但是在發(fā)育過程中的某些綜合機(jī)制可能掩蓋了PD的病理表現(xiàn)，因?yàn)樵诔赡晷∈笾蠵arkin缺失會(huì)導(dǎo)致進(jìn)行性多巴胺能神經(jīng)元丟失。這些體內(nèi)研究表明，衰老或其他疾病過程可能通過影響蛋白質(zhì)質(zhì)量控制或其他調(diào)節(jié)γ-突觸核蛋白穩(wěn)定性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同促進(jìn)γ-突觸核蛋白的聚集。而抑制AIMP2聚集的化合物可能在調(diào)節(jié)PD中AIMP2-α-突觸核蛋白的聚集方面作為治療安全有效的靶點(diǎn)[6]。同時(shí)，AIMP2在臨床疾病診斷方面也發(fā)揮重要作用，Kim等[7]首次提出，Parkin和AIMP2的信使RNA表達(dá)水平可作為診斷PD的潛在生物標(biāo)志物。

因此，線粒體自噬功能障礙在PD發(fā)病機(jī)制中起重要作用，而Parkin作為線粒體自噬途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，以PINK1/Parkin泛素化降解途徑為中心對(duì)Parkin及其底物進(jìn)行研究對(duì)于了解PD的病理機(jī)制、早期診斷以及治療靶點(diǎn)的選擇具有重要意義。

2.2Parkin與肥胖及糖尿病 2型糖尿病是一種慢性多系統(tǒng)疾病，表現(xiàn)為胰島素抵抗和(或)胰島素分泌不足。盡管線粒體功能障礙在糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生中至關(guān)重要，但與癌癥和神經(jīng)退行性疾病相比，其在糖尿病腎病中的機(jī)制研究更深入[4，10，26]。與其他腎臟結(jié)構(gòu)相比，腎臟的近曲小管中存在的線粒體數(shù)量較多，近曲小管對(duì)ATP的依賴性較大，由于腎臟對(duì)線粒體的依賴性更高，成為功能最活躍、能量依賴的器官之一[27]。除了線粒體的功能和形態(tài)變化外，糖尿病腎臟顯示出功能失調(diào)線粒體的積累，這表明負(fù)責(zé)線粒體質(zhì)量控制的機(jī)制失調(diào)，導(dǎo)致線粒體清除受損或異常線粒體的產(chǎn)生，因此控制線粒體平衡的機(jī)制在糖尿病腎病的管理中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用[28]。在高血糖情況下，過量葡萄糖發(fā)生氧化還原反應(yīng)，導(dǎo)致線粒體復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ的電子泄漏，線粒體復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ被認(rèn)為是線粒體中活性氧類的主要來源，而活性氧類的累積效應(yīng)破壞了線粒體的抗氧化功能，導(dǎo)致氧化應(yīng)激[29]。同時(shí)，活性氧類進(jìn)一步導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2活化并易位至細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，引起編碼線粒體超氧化物歧化酶2、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶等的基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，影響氧化還原狀態(tài)，因此核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2降解導(dǎo)致高血糖腎近曲小管細(xì)胞線粒體去極化和葡萄糖攝取受損[30]。研究發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性線粒體功能障礙和葡萄糖誘導(dǎo)的線粒體DNA改變導(dǎo)致糖尿病腎病[29]。所以，線粒體分裂受損、線粒體生物合成受阻和能量缺乏是糖尿病腎病期間線粒體自噬減少的指標(biāo)。傳統(tǒng)中藥黃芪甲苷可以改善線粒體質(zhì)量控制，對(duì)2型糖尿病繼發(fā)的糖尿病腎病具有腎臟保護(hù)作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，對(duì)db/db糖尿病模型小鼠給予黃芪甲苷可抑制線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白1、線粒體裂變1和線粒體融合素基因2的表達(dá)，并下調(diào)PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬，防止糖尿病腎病進(jìn)展[8]。另外，通過腹膜內(nèi)注射線粒體抗氧化劑可提高核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2活性和PINK/Parkin的表達(dá)水平，逆轉(zhuǎn)高血糖誘導(dǎo)的線粒體異常狀態(tài)，恢復(fù)db/db小鼠腎小管細(xì)胞的缺陷性線粒體自噬[31]。

Parkin突變或缺乏與PD的遺傳性和散發(fā)性形式有關(guān)，在PD人群中2型糖尿病的發(fā)病率更高。有遺傳數(shù)據(jù)表明，PD與2型糖尿病之間存在關(guān)聯(lián)[32-33]。Parkin是維持線粒體穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因素之一，Parkin功能缺失會(huì)導(dǎo)致胰島β細(xì)胞中胰島素產(chǎn)生和分泌受損，以及對(duì)鏈脲佐菌素誘發(fā)的糖尿病敏感性增加[33]。在脂肪組織研究中發(fā)現(xiàn)，Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在體內(nèi)米色脂肪細(xì)胞的維持中起重要作用，在PARK2基因敲除小鼠的白色脂肪組織中，CL316,243刺激能夠生成富含線粒體的米色脂肪，但由于在此狀態(tài)下線粒體降解途徑受到抑制，米色脂肪不能向白色脂肪轉(zhuǎn)變[34-35]。在誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞中，激活蛋白激酶A信號(hào)能夠顯著降低羰基氰化物間氯苯腙誘導(dǎo)線粒體招募Parkin的效率，這一過程是通過對(duì)Parkin的磷酸化作用進(jìn)行調(diào)控，且不依賴于線粒體解偶聯(lián)蛋白1的表達(dá)[34]。在糖尿病環(huán)境中，線粒體動(dòng)力學(xué)的微調(diào)平衡受到干擾，在糖尿病腎臟中，功能失調(diào)的線粒體異常積累加重。這種功能失調(diào)線粒體的積累表明，線粒體自噬受損或該過程不能滿足受損線粒體的清除。因此，需對(duì)影響線粒體自噬促進(jìn)質(zhì)量控制的因素和在糖尿病環(huán)境中改變引起線粒體功能受損的通路進(jìn)行研究。關(guān)于Parkin機(jī)制的研究，對(duì)于肥胖和2型糖尿病治療靶點(diǎn)的選擇具有重要意義。

2.3Parkin與腫瘤 細(xì)胞需要產(chǎn)生能量來維持生命，癌細(xì)胞的快速增長和增殖對(duì)能量的需求較大。以往研究表明，Parkin蛋白對(duì)多種腫瘤具有抑制作用[36]，但目前文獻(xiàn)報(bào)道許多癌癥與Parkin基因突變相關(guān)[26]。來自cBioportal(http://www.cbioportal.org)的數(shù)據(jù)庫分析表明，Parkin基因突變率在宮頸癌中約為5%，在肺鱗癌中約為5%，在結(jié)直腸癌中為2%～6%[26]。PARK2基因的缺失或突變常發(fā)生在肺癌中，PARK2的失活導(dǎo)致肺癌的發(fā)病率增加。通過分析癌癥基因組圖譜發(fā)現(xiàn)，約1/4的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣品具有Parkin基因的雜合或純合缺失和點(diǎn)突變[26]。在乳腺癌中，同樣觀察到Parkin的雜合性缺失和拷貝數(shù)缺失[10]。近年研究表明，代謝關(guān)鍵酶——磷酸甘油酸脫氫酶(phosphoglycerate dehydrogenase，PHGDH)在某些類型的癌癥中常過表達(dá)，其過表達(dá)可以激活絲氨酸合成以促進(jìn)癌癥進(jìn)展[37-38]。Liu等[37]發(fā)現(xiàn)，Parkin是PHGDH的E3泛素連接酶。Parkin在賴氨酸330處泛素化PHGDH，導(dǎo)致PHGDH降解以抑制絲氨酸合成和腫瘤發(fā)生[35]。大量研究表明，Parkin作為腫瘤抑制因子，其在許多癌癥(包括40%～70%的乳腺癌和超過30%的肺癌)中的表達(dá)被下調(diào)，而這種下調(diào)可能是由不同的機(jī)制引起，包括雜合性喪失、拷貝數(shù)丟失和啟動(dòng)子高甲基化PARK2[36，39-40]。除了抑制絲氨酸合成外，研究還顯示，Parkin可抑制糖酵解[9-10]。但Parkin在抑制糖酵解中的功能機(jī)制尚不清楚，這可能與其在缺氧誘導(dǎo)因子-1α泛素化中的活性以及對(duì)磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)的抑制有關(guān)[10，39]。以上研究表明，Parkin在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝中的作用有助于抑制腫瘤發(fā)展。未來，PHGDH抑制劑的開發(fā)對(duì)Parkin缺乏相關(guān)的癌癥具有潛在的治療意義。

3 小結(jié)與展望

Parkin作為HECT結(jié)構(gòu)域E3泛素連接酶，正常生理情況下處于自抑制狀態(tài)。隨著代謝生物學(xué)的迅速發(fā)展，Parkin作為調(diào)控線粒體自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子在肥胖、糖尿病、腫瘤等代謝性疾病中也受到越來越多的關(guān)注。在Parkin的結(jié)構(gòu)域中，對(duì)RING1和Ubl結(jié)構(gòu)域的研究較為深入，當(dāng)Ubl結(jié)構(gòu)域受到磷酸化激活時(shí)，Parkin才具有泛素連接酶的催化作用和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用。在未來的研究中，揭示Parkin其他4個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能及作用機(jī)制將會(huì)對(duì)重大慢性病治療起到重要的推動(dòng)作用。此外，研究轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控Parkin表達(dá)、線粒體蛋白介導(dǎo)的PINK1/Parkin參與線粒體自噬以及Parkin參與線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)互作的機(jī)制，能夠揭示生命能量代謝的時(shí)空網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過程，并在神經(jīng)和代謝性疾病的診斷與治療中發(fā)揮重要作用。