鐘靜詩，王共明，張 健，劉 芳，井月欣，王藝欣

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東 煙臺 264006）

仿刺參（Apostichopus japonicus）隸屬于棘皮動物門，海參綱，楯手目，刺參科[1]，是我國北方重要的經(jīng)濟產(chǎn)物，含有多種生物活性成分，包括類胡蘿卜素、多糖、多肽、脂肪酸、皂苷等[2]。其中仿刺參皂苷具有抗腫瘤[3]、抗菌[4]等生物活性，而關(guān)于免疫增強活性的研究相對缺乏。生殖腺是海參加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，其來源豐富但相關(guān)開發(fā)利用主要集中于多肽和多糖的制備、分離及相關(guān)活性[5-6]，而關(guān)于生殖腺皂苷的報道研究非常少。

免疫低下由參與機體免疫的免疫器官、免疫細(xì)胞、免疫因子等受到損傷，導(dǎo)致其識別和排除異物、抵御病原體的能力下降所致[7]?；钚晕镔|(zhì)作為免疫調(diào)節(jié)劑參與機體免疫，是增強機體抗病能力的有效途徑[8]。人參皂苷、竹節(jié)參皂苷、革皮氏海參皂苷等都已被證實具有調(diào)節(jié)免疫的作用[9-10]，免疫調(diào)節(jié)主要通過調(diào)節(jié)免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子等方面發(fā)揮作用[11]。而仿刺參生殖腺皂苷在免疫調(diào)節(jié)方面的作用和機制還鮮有報道。

本論文通過測定仿刺參雌性生殖腺皂苷（gonad saponins from female ofApostichopus japonicus，AGS）對巨噬細(xì)胞吞噬活性、巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IFN-γ分泌的影響，探究體外免疫增強活性；通過建立小鼠免疫低下模型，研究其對免疫低下小鼠胸腺、脾臟指數(shù)，碳廓清指數(shù)與吞噬指數(shù)，腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力和增殖活性，脾細(xì)胞增殖活性，自然殺傷細(xì)胞活力，T 淋巴細(xì)胞亞群水平，小鼠血清細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IFN-γ等指標(biāo)的影響，探究其對免疫低下小鼠免疫能力的作用。通過體內(nèi)和體外免疫增強活性的研究，以期為其免疫調(diào)節(jié)相關(guān)活性研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巨噬細(xì)胞RAW264.7、人白血病細(xì)胞K562、NK 細(xì)胞 上海雅吉生物科技有限公司；18～20 g SPF 級雌性昆明小鼠 濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[許可證號：SCXK（魯）20190003]；注射用環(huán)磷酰胺 德國Baxter Oncology 公司；FITC anti-mouse CD3 Antibody、PE anti-mouse CD4 Antibody、APC anti-mouse CD8a Antibody 美國Biolegend 公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒 美國Glpbio公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基 美國Sigma-Aldrich 公司；磷酸鹽緩沖溶液 武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清 北京全式金生物技術(shù)有限公司；印度墨汁 生工生物工程（上海）股份有限公司；紅細(xì)胞裂解液、脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、青鏈霉素混合液、小鼠腫瘤壞死因子αELASA 試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素6 ELISA 試劑盒、小鼠干擾素γELISA試劑盒 北京索萊寶科技有限公司。

ME204E 型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；1510 型酶標(biāo)儀、HERACELL 150i 型二氧化碳培養(yǎng)箱 賽默飛世爾（中國）有限公司；FC500 型流式細(xì)胞儀 美國貝克曼庫爾特公司；5430R 型離心機 德國Eppendorf 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 AGS 的制備 本實驗用AGS 由實驗室前期制備：60%乙醇冷浸提取仿刺參雌性生殖腺凍干粉→旋蒸至浸膏狀→分散于水中→水飽和正丁醇萃取→凍干正丁醇層→制得AGS，為淡黃色粉末，Molish 反應(yīng)出現(xiàn)紫色環(huán)。

1.2.2 巨噬細(xì)胞RAW264.7 體外中性紅吞噬實驗參考翟星辰[12]的方法，利用RPMI-1640 完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個/mL 并接種于96 孔板中，于37 ℃、5% CO2條件下貼壁培養(yǎng)12 h。設(shè)置含有不同終濃度樣品組（200、500、1000 μg/mL）、正常組（培養(yǎng)基）和LPS（1 μg/mL）陽性對照組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，吸去上清液，并于每孔中加入0.1%中性紅溶液。在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h 后，吸去上清并用PBS 清洗細(xì)胞2 次。向每孔中加入細(xì)胞裂解液1 mL，細(xì)胞裂解液為乙酸:乙醇=1:1（v/v）。將96 孔板置于4 ℃冰箱內(nèi)，12 h 后于540 nm 處測定吸光度值。

1.2.3 巨噬細(xì)胞RAW264.7 體外TNF-α，IL-6，IFN-γ測定 設(shè)置含有不同終濃度（200、500、1000 μg/mL）AGS、正常組（培養(yǎng)基）和LPS（1 μg/mL）陽性對照組，根據(jù)小鼠腫瘤壞死因子αELASA 試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素6 ELISA 試劑盒、小鼠干擾素γELISA試劑盒分別測定體外繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后RAW 264.7細(xì)胞的TNF-α，IL-6，IFN-γ的分泌。

1.2.4 動物模型建立 將雌性昆明小鼠分為5 組，正常組，模型對照組，AGS 低、中、高劑量組（0.5，5，20 mg/kg），每組12 只小鼠。本實驗遵守動物福利3R 原則、符合國際實驗動物倫理學(xué)要求，并由煙臺市百吉林生命科學(xué)研究院實驗動物倫理委員會審查批準(zhǔn)。小鼠在空調(diào)動物飼養(yǎng)室中同室群籠飼養(yǎng)，自由飲水。每天定時通風(fēng)，室內(nèi)溫度保持在22～24 ℃。濕度45%～60%。保持12 h 黑暗/12 h 照明的晝夜節(jié)律（8:00～20:00 亮燈）。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。在第8～10 d，空白組小鼠腹腔注射給予生理鹽水，其余組小鼠腹腔內(nèi)注射80 mg/kg/d 的環(huán)磷酰胺，建立環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫低下模型。在第11～20 d，進行給藥處理，處理方法如表1 所示。

表1 各組小鼠給藥處理表Table 1 Dosing and treatment of mice in each group

1.2.5 胸腺、脾臟指數(shù)的測定 臟器指數(shù)的測定參考董婧媛[13]的方法，在最后一次給藥后12 h，小鼠禁食脫水，脫臼處死后取出小鼠胸腺和脾臟并稱重。按公式1 和公式2 計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)：

1.2.6 小鼠碳廓清指數(shù)與吞噬指數(shù) 參考文獻[14]的方法，在最后一次給藥24 h 后，注入濃度為10%的墨汁于小鼠的尾部靜脈，墨汁用量為0.1 mL/10 g。提前配制0.1% NaCO3溶液，將2 min 和10 min 小鼠眼眶取血20 μL 分別加入到0.1% NaCO3溶液中并搖勻，于600 nm 處測定吸光度值。小鼠脫臼處死后，對肝臟和脾臟進行稱重，按公式3 和公式4 計算碳廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)：

式中：K—碳廓清指數(shù)；A1—2 min 時吸光度；A2—10 min 時吸光度；t1—2，min；t2—10，min；α—吞噬指數(shù)；m1—小鼠體重，g；m2—肝臟重量，g；m3—脾臟重量，g。

1.2.7 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖活性測定

1.2.7.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備 于75%乙醇中浸泡脫臼處理的小鼠1～2 min，在超凈工作臺中向小鼠腹腔緩慢注入5 mL 預(yù)冷的PBS 緩沖溶液，輕柔腹部1～2 min，用無菌注射器吸取腹水于離心管中，重復(fù)2～3 次。在4 ℃、1000 r/min 條件下離心5 min，棄上清，重懸細(xì)胞于RPMI-1640 完全培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.7.2 巨噬細(xì)胞活性的測定 利用RPMI-1640 完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個/mL 并接種于96 孔板中，每孔100 μL。設(shè)計空白組和實驗組，其中空白組以完全培養(yǎng)基調(diào)零，每組設(shè)計6 個復(fù)孔。在5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基并向每孔中加入含有10%的CCK-8 溶液100 μL，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后利用酶標(biāo)儀檢測450 nm 處吸光度[13]。

1.2.8 小鼠脾細(xì)胞懸液的制備及增殖測定

1.2.8.1 小鼠脾細(xì)胞的制備 于75%乙醇中浸泡脫臼處理的小鼠1～2 min，無菌條件下取出脾臟，過200 目細(xì)胞篩，置于盛有D-Hank’s 液的培養(yǎng)皿中，用D-Hank’s 緩沖溶液沖洗細(xì)胞篩并收集細(xì)胞懸液。在4 ℃、1000 r/min 條件下離心5 min，棄上清。在室溫條件下，加入5 mL 紅細(xì)胞裂解液裂解3 min，加入1 mL 胎牛血清后于4 ℃、1000 r/min 條件下離心5 min，重復(fù)2～3 次。利用RPMI-1640 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，置于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.8.2 脾細(xì)胞活性的測定 利用RPMI-1640 完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個/mL 并接種于96孔板中，每孔100 μL。設(shè)計空白組和實驗組，其中空白組以完全培養(yǎng)基調(diào)零，每組設(shè)計6 個復(fù)孔。在5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基并向每孔中加入含有10%的CCK-8 溶液100 μL，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后利用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度[13]。

1.2.9 小鼠脾細(xì)胞中自然殺傷細(xì)胞（NK 細(xì)胞）活力測定 參考翟星辰[12]的方法，按照脾細(xì)胞:人白血病細(xì)胞K562=50:1 接種于96 孔板中，即每孔接種5×105個脾細(xì)胞后再接種1×104個人白血病細(xì)胞K562 于同樣的孔板中，兩種細(xì)胞混合的孔為樣品孔，對照孔為各細(xì)胞單獨培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為24 h。按照公式5 計算小鼠脾細(xì)胞中NK 細(xì)胞活力：

式中：T—人白血病細(xì)胞K562 孔吸光度；S—樣品孔吸光度；E—脾細(xì)胞孔吸光度。

1.2.10 T 淋巴細(xì)胞亞群的測定 參考劉仁杰等[15]的方法，按照1.2.8.1 的方法制備小鼠脾淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液后，將細(xì)胞濃度調(diào)整為4×107個/mL，加入10 μL FITC anti-mouse CD3、PE anti-mouse CD4、APC anti-mouse CD8a 抗體，充分混勻并于4 ℃條件下避光孵育1 h。而后加入1 mL FACS buffer，在4 ℃、2000 r/min 條件下離心5 min，收集沉淀。緩慢加入150 mL FACS buffer 重懸細(xì)胞沉淀，用流式細(xì)胞儀檢測并計算CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞比例。

1.2.11 小鼠血清中TNF-α，IL-6，IFN-γ的測定 將小鼠處死后，取眼球全血3 mL 并分離出血清。用ELISA試劑盒檢測血清中TNF-α，IL-6，IFN-γ的分泌。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 整理實驗數(shù)據(jù)，使用SPSS 20.0軟件作統(tǒng)計分析，分析方法采用t檢驗，P＜0.05 時代表有顯著性差異，P＜0.01 時代表有極顯著性差異。使用Origin 2019 繪制圖形。實驗重復(fù)六次。

2 結(jié)果與分析

2.1 AGS 對巨噬細(xì)胞RAW264.7 吞噬能力的影響

中性紅是一種能被巨噬細(xì)胞吞噬的大分子熒光試劑，在540 nm 波長下有強吸收峰[12]。中性紅實驗?zāi)芊磻?yīng)吞噬細(xì)胞的吞噬能力，其吞噬能力與吸光度成正比，巨噬細(xì)胞的吞噬能力如表2 所示。與未進行處理（正常組）的巨噬細(xì)胞RAW264.7 相比，AGS 各濃度組及LPS 刺激的巨噬細(xì)胞的吞噬能力都顯著增強（P＜0.05），且樣品組與LPS 組無顯著差異，說明AGS 具有促進巨噬細(xì)胞吞噬大分子的能力，與絞股藍總皂苷增強巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力相似[16]。

表2 AGS 對RAW264.7 吞噬能力的影響Table 2 Effects of AGS on the phagocytosis of RAW264.7 cells

2.2 AGS 對巨噬細(xì)胞RAW264.7 細(xì)胞因子的影響

細(xì)胞因子主要由免疫細(xì)胞和個別非免疫細(xì)胞產(chǎn)生，是一類小分子蛋白[17]，能與相應(yīng)受體結(jié)合參與細(xì)胞間的信息傳遞，從而形成細(xì)胞動態(tài)網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和代謝、機體的免疫應(yīng)答[18]。細(xì)胞因子包括腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素、干擾素等，能介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和天然免疫等。AGS 對巨噬細(xì)胞RAW264.7 細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IFN-γ分泌的影響如圖1 所示。

圖1 AGS 對RAW264.7 細(xì)胞因子的影響Fig.1 Effects of AGS on the release of cytokines in RAW264.7 cells

TNF-α主要由M1 型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、與病原體和腫瘤細(xì)胞直接作用、清除異常細(xì)胞等都發(fā)揮了重要功能，能促進下游細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、黏附因子等的表達[12]。相對于未處理RAW 264.7，AGS 和LPS 組能顯著提高TNF-α的含量（P＜0.05），且AGS 1000 μg/mL 組與LPS 組效果無明顯差異（P＞0.05），說明AGS 能促進TNF-α的分泌，與Aminin 等[19]研究發(fā)現(xiàn)海參單體皂苷具有增強TNF-α分泌的作用相似。

IL-6 可由活化的巨噬細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生，能參與和刺激免疫應(yīng)答的細(xì)胞增殖、分化并提高免疫功能，具有誘導(dǎo)B 細(xì)胞分化、誘導(dǎo)IL-2 和IL-2 受體表達、增強NK 細(xì)胞活性、誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化等重要作用[20]。相對于未處理RAW264.7，AGS 和LPS組能顯著提高IL-6 的含量（P＜0.05），且AGS 500 和1000 μg/mL 組與LPS 組效果無明顯差異（P＞0.05），說明AGS 能較好地促進IL-6 的分泌，與羊肚菌多糖增強IL-6 的作用相似[21]。

干擾素可激活巨噬細(xì)胞，增強巨噬細(xì)胞的活性，而活化的巨噬細(xì)胞又可產(chǎn)生干擾素。IFN-γ可由活化的T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞產(chǎn)生，除成熟的紅細(xì)胞以外，IFN-γ分布于幾乎所有細(xì)胞表面，能通過旁鄰方式控制細(xì)胞的生長。相對于未處理組RAW264.7，AGS和LPS 組能顯著提高IFN-γ的含量（P＜0.05），且AGS各劑量組與LPS 組效果無明顯差異（P＞0.05），說明AGS 能較好地促進IFN-γ分泌。Bhardwaj 等[22]發(fā)現(xiàn)茶皂苷具有增強IFN-γ分泌的作用，與本研究結(jié)果一致。

2.3 AGS 對小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響

環(huán)磷酰胺因其具有較好的細(xì)胞毒性作用，普遍應(yīng)用于腫瘤疾病的治療之中。但與此同時，環(huán)磷酰胺也會導(dǎo)致免疫抑制[23]、骨髓抑制[24]、介導(dǎo)氧化還原反應(yīng)的平衡從而引起氧化應(yīng)激等反應(yīng)[25]。胸腺和脾臟是人體進行免疫調(diào)節(jié)的外周免疫器官，具有抗感染、造血等重要作用[26]，其質(zhì)量和大小受到免疫細(xì)胞增殖和分化的影響[27]。胸腺和脾臟的質(zhì)量隨著年齡的增長而逐漸萎縮，且在應(yīng)激條件下也能加速萎縮。AGS對免疫低下小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響如表3 所示。與正常組相比，免疫低下模型組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)都顯著降低（P＜0.05），說明環(huán)磷酰胺的注射導(dǎo)致了小鼠胸腺、脾臟的萎縮，質(zhì)量減輕，表明建模成功。與模型組相比，經(jīng)AGS 的灌胃后，AGS 各劑量組小鼠的胸腺、脾臟指數(shù)都有所提升，其中中、高劑量AGS 灌胃的小鼠差異均顯著（P＜0.05）。由此可推測出AGS 能夠緩解由環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫低下小鼠的胸腺、脾臟萎縮，質(zhì)量減輕的損害，其結(jié)果與積雪草皂苷的作用相似[28]。

表3 AGS 對免疫低下小鼠臟器指數(shù)的影響Table 3 Effects of AGS on organ indices in immunocompromised mice

2.4 AGS 對小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)的影響

肝臟、脾臟中的巨噬細(xì)胞具有清除碳粒的作用，吞噬能力是評價巨噬細(xì)胞的關(guān)鍵指標(biāo)[29,13]。而碳廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)能反映單核-巨噬細(xì)胞的吞噬能力。由表4 可知，與正常組相比，模型組小鼠的碳廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)都顯著降低（P＜0.05）。說明環(huán)磷酰胺能降低小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力。與模型組相比，AGS 中、高劑量小鼠的碳廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)都顯著提高（P＜0.05），說明AGS 具有緩解環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫低下小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的損害的作用。Chen 等[30]發(fā)現(xiàn)大豆皂苷能顯著提升巨噬細(xì)胞的吞噬能力，本研究結(jié)果與之類似。

表4 AGS 對免疫低下小鼠碳廓清指數(shù)、吞噬指數(shù)的影響Table 4 Effect of AGS on carbon clearance index and phagocytic index in immunocompromised mice

2.5 AGS 對小鼠巨噬細(xì)胞增殖活性的影響

巨噬細(xì)胞分布廣泛，幾乎存在于身體的所有組織中[31]，能吞噬和殺死病原體、將抗原呈遞給淋巴細(xì)胞并釋放大量生物活性分子，在特異性免疫和非特異性免疫都起到了重要作用[32]。由圖2 可知，模型組小組的巨噬細(xì)胞增殖活性顯著低于正常組小鼠（P＜0.05），說明環(huán)磷酰胺能降低小鼠巨噬細(xì)胞增殖活性。與模型組相比，中、高劑量組小鼠巨噬細(xì)胞增殖活性顯著升高（P＜0.05），說明AGS 對注射環(huán)磷酰胺小鼠巨噬細(xì)胞增殖能力降低具有一定的緩解作用，其結(jié)果與海參皂苷對巨噬細(xì)胞增殖活性的影響相似[13]。

圖2 AGS 對小鼠巨噬細(xì)胞增殖活性的影響Fig.2 Effects of AGS on proliferation of macrophages in mice

2.6 AGS 對小鼠脾細(xì)胞增殖活性的影響

脾細(xì)胞中含有多種免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞等，對機體的細(xì)胞免疫起到重要的調(diào)節(jié)作用[33]。由圖3 可知，經(jīng)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖活性顯著低于正常組小鼠（P＜0.05）。與模型組相比，低、中、高劑量組小鼠的脾細(xì)胞增殖活性都顯著提高（P＜0.05）。說明AGS 能較好地緩解環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖活性降低的現(xiàn)象。Rositsa 等[34]在研究黃芪皂苷時發(fā)現(xiàn)，黃芪皂苷具有增強脾細(xì)胞活性的作用，且具有劑量依賴性，本研究結(jié)果與之相似。

圖3 AGS 對小鼠脾細(xì)胞增殖活性的影響Fig.3 Effects of AGS on proliferation of splenocytes in mice

2.7 AGS 對小鼠脾細(xì)胞中NK 細(xì)胞活力的影響

NK 細(xì)胞能對病毒、炎癥、腫瘤等靶標(biāo)進行識別，從而具有抗腫瘤、抗病毒感染等作用[35]。白血病細(xì)胞K562 是自然殺傷細(xì)胞的敏感細(xì)胞，NK 細(xì)胞對其發(fā)揮著細(xì)胞毒性作用，據(jù)此研究NK 細(xì)胞的活力。由圖4 可知，與正常組小鼠相比，經(jīng)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)后小鼠NK 細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05），說明環(huán)磷酰胺能夠降低NK 細(xì)胞的功能。與模型組相比，低、中、高劑量組小鼠的NK 細(xì)胞活力都有所提高，且差異顯著（P＜0.05）。另外，經(jīng)過中、高劑量AGS 喂食的小鼠組NK 細(xì)胞活性與正常組小鼠差異不顯著（P＞0.05），效果較好。由此可推測，AGS 對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫低下小鼠的NK 細(xì)胞活性降低具有緩解作用，與日本刺參對NK 細(xì)胞活性增強的研究結(jié)果相似[36]。

圖4 AGS 對小鼠脾細(xì)胞中自然殺傷細(xì)胞（NK 細(xì)胞）活力的影響Fig.4 Effects of AGS on NK cell activity of splenocytes in mice

2.8 AGS 對小鼠脾臟T 淋巴細(xì)胞亞群CD4+，CD8+T細(xì)胞的影響

T 淋巴細(xì)胞參與機體的免疫調(diào)節(jié)，包含了不同功能的T 淋巴細(xì)胞亞群。其中，輔助性T 細(xì)胞和效應(yīng)T 細(xì)胞的表面標(biāo)記抗體為CD4；細(xì)胞毒性T 細(xì)胞和抑制性T 細(xì)胞的表面標(biāo)記抗體為CD8[37]。CD4+T細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞相互制約，形成T 細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，進而調(diào)節(jié)機體的細(xì)胞免疫的穩(wěn)定性，且免疫功能的高低能通過CD4+與CD8+的比值反應(yīng)[38]。經(jīng)合理設(shè)門后，不同處理組小鼠T 淋巴細(xì)胞亞群分群情況如圖5 所示。

圖5 AGS 對小鼠脾臟T 淋巴細(xì)胞亞群的影響Fig.5 Effect of AGS on T lymphocyte subsets of spleen in mice

經(jīng)計算，CD4+、CD8+水平及其比例如表5 所示。與正常組相比，模型組小鼠的CD4+水平顯著降低（P＜0.05）；CD8+水平顯著升高（P＜0.05）；CD4+/CD8+水平顯著降低（P＜0.05），說明環(huán)磷酰胺注射的小鼠免疫功能低下。與模型組小鼠相比，AGS 低、中、高劑量組小鼠的CD4+水平都有所提高，其中AGS 中、高劑量組差異顯著（P＜0.05），且中劑量組小鼠提升效果最明顯；AGS 各劑量組CD8+水平均顯著降低（P＜0.05），其中中劑量組小鼠降低效果最明顯；AGS 各劑量組CD4+/CD8+水平顯著增高（P＜0.05），其中中劑量組小鼠升高效果最佳。由此可知，AGS 能對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠免疫低下起到一定的緩解作用，能增強免疫低下小鼠的免疫功能，且中劑量組效果最好。研究表明，皂苷具有一定的毒性[39]，高劑量組效果稍差可能的原因是高劑量的AGS 表現(xiàn)出輕微的副作用。

表5 AGS 對小鼠脾臟T 淋巴細(xì)胞亞群的影響Table 5 Effect of AGS on T lymphocyte subsets of spleen in mice

2.9 AGS 對小鼠血清細(xì)胞因子的影響

TNF-α、IL-6、IFN-γ在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多方面都起到重要作用，AGS 對小鼠血清的TNF-α、IL-6、IFN-γ分泌影響如圖6 所示。

圖6 AGS 對小鼠血清細(xì)胞因子的影響Fig.6 Effects of AGS the release of cytokines in serum of mice

與正常組相比，模型組小鼠顯著降低了TNF-α的分泌（P＜0.05），說明環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)下小鼠TNF-α的分泌受到了抑制。與模型組相比，AGS 低、中、高劑量組的TNF-α分泌提升效果均顯著（P＜0.05），中劑量組與正常組小鼠無明顯差異（P＞0.05）。說明AGS 能較好地恢復(fù)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的TNF-α分泌降低的情況。

與正常組相比，模型組小鼠顯著降低了IL-6 的分泌（P＜0.05），說明環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)下小鼠IL-6 的分泌受到了抑制。與模型組相比，AGS 低、中、高劑量組的IL-6 分泌都有所提升，具有劑量依賴性，且各劑量組小鼠提升IL-6 分泌的效果與模型組差異顯著（P＜0.05），高劑量組與正常組小鼠無明顯差異（P＞0.05）。說明AGS 能較好地恢復(fù)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的IL-6 分泌降低的情況。

與正常組相比，模型組小鼠顯著降低了IFN-γ的分泌（P＜0.05），說明環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)下小鼠IFN-γ的分泌受到了抑制。與模型組相比，AGS 低、中、高劑量組的IFN-γ分泌提升效果均顯著（P＜0.05）。中、高劑量組與正常組小鼠無明顯差異（P＞0.05）。說明AGS 能較好地恢復(fù)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的IFN-γ分泌降低的情況。

NF-κB 信號通路通過胞外細(xì)胞因子與受體的結(jié)合，激活I(lǐng)κB 激酶，進而調(diào)節(jié)炎癥、癌癥、自身免疫疾病等[40]。TNF-α能作為NF-κB 經(jīng)典通路的細(xì)胞因子，激活NF-κB 信號通路。JAK-STAT 信號通路主要由細(xì)胞外信號因子、酪氨酸激酶相關(guān)受體、JAK激酶和轉(zhuǎn)錄因子STAT 四部分組成[41]。其中IL-6、INF-γ可作為細(xì)胞外信號因子，與細(xì)胞膜上相應(yīng)的IL-6 受體、INF-γ受體相結(jié)合，受體與JAK 激酶相結(jié)合，實現(xiàn)信號從細(xì)胞外到細(xì)胞內(nèi)的傳遞，從而參與免疫調(diào)節(jié)及細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。AGS 對TNFα、IL-6、INF-γ分泌的提高或許提示著其免疫增強活性與NF-κB 信號通路、JAK-STAT 信號通路有關(guān)。

3 結(jié)論

本論文通過對體外巨噬細(xì)胞RAW264.7 和體內(nèi)注射環(huán)磷酰胺建立免疫低下小鼠模型兩方面探究AGS 的免疫增強活性。結(jié)果表明AGS 各濃度組均能促進體外巨噬細(xì)胞吞噬中性紅大分子，提升TNFα、IL-6、IFN-γ分泌的能力；AGS 中劑量組和高劑量組均能緩解胸腺、脾臟萎縮和質(zhì)量減輕現(xiàn)象，增強巨噬細(xì)胞的吞噬能力，提高巨噬細(xì)胞和脾細(xì)胞的增殖活性，增強NK 細(xì)胞活性，提高CD4+/CD8+水平，提升小鼠分泌TNF-α、IL-6、IFN-γ的能力。綜上所述，AGS可通過對免疫器官、免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子等方面進行調(diào)節(jié)，從而起到免疫增強的作用。