王 艷，李虹佳，程美佳，謝金暉，劉天嬌，辛嘉英，張 娜

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)，食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150028）

在食品工業(yè)生產(chǎn)中常用的改性玉米淀粉包括復(fù)合改性淀粉、酯化淀粉、交聯(lián)淀粉、冷水可溶性淀粉、酸水解淀粉和糊精等[1-2]。不同改性淀粉添加到食品中后不僅可以改善食品的質(zhì)構(gòu)，起到增稠、懸浮、保水和穩(wěn)定的作用，還可以有效延長食品的保質(zhì)期，其主要用于飲料、糖果、面制品、肉制品以及調(diào)味料等食品的加工中[3-5]。而脂肪酸淀粉酯是一類新型的改性淀粉，因具有優(yōu)于傳統(tǒng)工業(yè)材料的理化特性，現(xiàn)已成為變性淀粉工業(yè)中的一個新興研究熱點(diǎn)[6]。脂肪酸淀粉酯制備分為兩大體系，即有溶劑體系和無溶劑體系。聶卉等[7]以離子液體為反應(yīng)介質(zhì)，采用化學(xué)法制備了阿魏酸淀粉酯，并對饅頭預(yù)發(fā)酵冷凍面團(tuán)物化性質(zhì)的影響進(jìn)行研究，證明適量添加阿魏酸淀粉酯有助于改善饅頭硬度、韌性及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的緊致性。Zhang 等[8]利用硬脂酸和月桂酸與淀粉在水介質(zhì)的條件下制備硬脂酸淀粉酯和月桂酸淀粉酯，探究了酯化條件對取代度（DS）及產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和性能的影響。Winkler 等[9]利用月桂酸、脂肪酸乙烯酯在二甲基亞砜（DMSO）體系中進(jìn)行酯交換反應(yīng)或在吡啶中與脂肪酸氯化物反應(yīng)從而制得月桂酸酯。

無溶劑反應(yīng)體系由于綠色環(huán)保，產(chǎn)品無有機(jī)試劑殘留而備受關(guān)注。目前，無溶劑體系中脂肪酸淀粉酯的制備主要是借助脂肪酶的界面催化特性，通過酯化或轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。Sn 等[10]在無溶劑條件下利用固定化脂肪酶催化反應(yīng)成功制備了辛酸木糖酰基酯、癸酸木糖?；?、月桂酸木糖?；ズ腿舛罐⑺崮咎酋；?。Allana 等[11]利用鯨蠟醇與棕櫚酸在無溶劑體系中通過酯化反應(yīng)合成十六烷基棕櫚酸酯，并對該酶促反應(yīng)動力學(xué)進(jìn)行了探究。微波技術(shù)和酶催化技術(shù)是淀粉改性研究中兩種重要的綠色合成手段，且將二者聯(lián)合應(yīng)用于淀粉的改性，會產(chǎn)生相互促進(jìn)的耦合效應(yīng)。Horchani 等[12]利用CaCO3固定化金黃色葡萄球菌脂肪酶，在無溶劑體系下通過微波加熱成功制備了油酸淀粉酯。但是在無溶劑體系下利用微波輔助脂肪酶催化油酸淀粉酯還存在一定的弊端，當(dāng)?shù)矸酆椭舅嶙鳛榈孜飼r(shí)，極性相差較大不易混溶，且淀粉并非脂肪酶的天然底物，因此脂肪酶不易催化淀粉與脂肪酸發(fā)生酯化反應(yīng)，產(chǎn)物的取代度較低[13]。

為解決以上問題，本實(shí)驗(yàn)擬采用納米金為載體固定游離脂肪酶制備納米金固定化酶，借助納米金與酶之間良好的生物相容性和其對微波的強(qiáng)吸收能力，在無溶劑體系下有效提高微波輔助酶催化脂肪酸淀粉酯的合成效率，為改性淀粉的制備與酯化反應(yīng)的綠色合成提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

預(yù)處理玉米淀粉 黑龍江省食品科學(xué)與工程高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制[14]；油酸（AR） 天津天力化學(xué)試劑有限公司；氯金酸（99%） 沈陽興惠達(dá)化工有限公司；南極假絲酵母脂肪酶（10000 U/g） 上海源葉生物科技有限公司；固定于大孔丙稀酸樹脂的南極假絲酵母脂肪酶Novozym 435（L477710000 U/g） 丹麥公司；檸檬酸鈉及其他常用試劑 均為國產(chǎn)分析純。

UV2550 型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；XH-100A 微波反應(yīng)器 北京祥鵠科技發(fā)展公司；GC-7890F 氣相色譜儀 上海天美儀器有限公司；Perkin Elmer 100 傅里葉變換紅外光譜儀 美國Perkin Elmer 公司；F-7000 熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；DHG-9053 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；AVANCEIII300 核磁共振波譜儀 布魯克（北京）科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)以脂肪酶催化油酸與玉米淀粉發(fā)生酯化反應(yīng)為研究模型，在無溶劑體系下借助微波輔助技術(shù)提高脂肪酶催化酯化反應(yīng)效率，其原理如圖1 所示，將脂肪酶與油酸、淀粉混合后放入微波反應(yīng)器中，在無溶劑體系下進(jìn)行油酸淀粉酯的合成制備。對比分析不同微波參數(shù)對游離的南極假絲酵母脂肪酶（CAL）、商品化固定化南極假絲酵母脂肪酶（Novozym 435）和本實(shí)驗(yàn)制備的納米金固定化南極假絲酵母脂肪酶（CAL@AuNPs）催化油酸與淀粉發(fā)生酯化反應(yīng)的能力的影響。并以油酸淀粉酯的取代度為指標(biāo)，利用甲醇醇解-氣相色譜法分析產(chǎn)物油酸淀粉酯的合成進(jìn)程。實(shí)現(xiàn)微波輔助酶催化油酸淀粉酯的高效合成，縮短反應(yīng)時(shí)間，提高取代度。

圖1 基于微波輔助耦合CAL@AuNPs 催化油酸淀粉酯合成示意圖Fig.1 Schematic diagram of synthesis of starch oleate esters catalyzed by microwave assisted coupling CAL@AuNPs

1.2.1 納米金的制備 參考王艷等[15]的實(shí)驗(yàn)方法，準(zhǔn)確量取0.01%的氯金酸溶液50 mL 置于平底燒瓶內(nèi)，加熱至溶液沸騰后逐滴加入1.4～1.75 mL 的濃度為1%的檸檬酸鈉溶液，持續(xù)攪拌加熱至溶液成酒紅色，冷卻至室溫后4 ℃低溫保存，即制得粒徑為10～18 nm 納米金，以蒸餾水為空白進(jìn)行紫外光譜檢測。納米金粒徑計(jì)算公式如下：

式中：AsPr 表示納米金溶液在紫外下最高峰的吸光度值；AuSo 表示納米金溶液在450 nm 處的紫外吸光度值。

1.2.2 CAL@AuNPs 的制備 準(zhǔn)確稱取0.10 g 南極假絲酵母脂肪酶，加入2 mL 的超純水配制成濃度為50 mg/mL 脂肪酶溶液后分別加入納米金溶液，將其充分混合后密封于恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)后進(jìn)行冷凍干燥，即為CAL@AuNPs。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 單因素采用控制變量法，將2 g淀粉、10 mL 油酸、濃度為50 mg/mL 的脂肪酶置于功率為400 W、溫度35 ℃的微波反應(yīng)器中充分反應(yīng)40 min，制備油酸淀粉酯，以油酸轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)確定納米金粒徑大小、納米金添加量、固定化反應(yīng)時(shí)間、溫度四個因素的最佳反應(yīng)條件。

1.2.3.1 納米金粒徑的大小對酶催化效果的影響固定化溫度為30 ℃、時(shí)間8 h、納米金添加量4 mL為固定因素，依次以10、12、14、16、18 nm，5 個梯度考察納米金粒徑大小對酶催化效果的影響。

1.2.3.2 納米金添加量對酶催化效果的影響 固定化溫度為30 ℃、時(shí)間8 h、納米金粒徑14 nm 為固定因素，依次以1、2、3、4、5 mL，5 個梯度考察納米金添加量對酶催化效果的影響。

1.2.3.3 固定化時(shí)間對酶催化效果的影響 固定化溫度為30 ℃、納米金粒徑14 nm、納米金添加量為4 mL 為固定因素，依次以4、5、6、7、8 h，5 個梯度考察固定化反應(yīng)時(shí)間對酶催化效果的影響。

1.2.3.4 固定化溫度對酶催化效果的影響 固定化時(shí)間6 h、納米金粒徑14 nm、納米金添加量為4 mL為固定因素，依次以30、35、40、45、50 ℃，5 個梯度考察固定化反應(yīng)溫度對酶催化效果的影響。

1.2.4 油酸轉(zhuǎn)化率的測定

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考課題組前期建立的氣相色譜法[16]并稍作改動。配制濃度為1×10-4、2.5×10-4、5×10-4、7.5×10-4、1×10-3mg/L 的油酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，抽取1 μL 進(jìn)入氣相色譜進(jìn)行測定。以油酸甲酯溶液的濃度C 為橫坐標(biāo)，氣相色譜峰的面積S 為縱坐標(biāo)構(gòu)建曲線，得到油酸甲酯溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程為：S=96.853C-879.2（R2=0.9998）。

1.2.4.2 色譜條件 色譜柱：DM-FFAP 石英毛細(xì)管柱，30 m×0.32 mm×0.25 μm；爐溫220 °C、進(jìn)樣器溫度250 °C、檢測器溫度為260 °C、氮?dú)饬魉贋?.5 mL/min、空氣流速為5.5 mL/min、尾吹為5.0 mL/min。進(jìn)樣量：1 μL。

1.2.4.3 產(chǎn)物甲酯化 參考文獻(xiàn)[17]并改動，取1.2.3中制備的油酸淀粉酯30 mg 加入0.5 mL 二甲基亞砜中進(jìn)行溶解。然后加入1 mL 0.07 mol/L 的甲醇甲醇鈉溶液后在70 ℃下回流40 min，冷卻，加入1 mL 去離子水和1 mL 正庚烷充分?jǐn)嚢? min 后靜置沉淀，上層油相即為油酸甲酯。

1.2.4.4 油酸轉(zhuǎn)化率的計(jì)算 采用外標(biāo)法算得1.2.4.3實(shí)驗(yàn)中所得油酸甲酯的量從而換算出油酸淀粉酯的量，進(jìn)而得到已反應(yīng)油酸的量，并與油酸總量10 mL進(jìn)行對比，可推導(dǎo)出油酸淀粉酯中油酸的轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式如下：

式中：α表示油酸的轉(zhuǎn)化率，%；n0表示油酸的總量，mol；n1表示生成油酸淀粉酯所消耗的油酸的量，mol。

1.2.5 CAL@AuNPs 的表征 準(zhǔn)確稱取0.10 g 南極假絲酵母脂肪酶，加入2 mL 的超純水配制成濃度為50 mg/mL 脂肪酶溶液后加入4 mL 粒徑為14 nm的納米金溶液，將其充分混合后密封于40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)6 h，取出進(jìn)行冷凍干燥，即為CAL@AuNPs，參考文獻(xiàn)[14]并稍作改動分別進(jìn)行紫外光譜、熒光光譜、紅外光譜進(jìn)行測定結(jié)構(gòu)表征。

1.2.5.1 紫外光譜分析 取濃度為 50 mg/mLCAL@AuNPs 溶液于石英比色皿中，通過紫外分光光度計(jì)全波長進(jìn)行掃描，得到紫外圖譜對比分析。

1.2.5.2 熒光光譜分析 將配制好南極假絲酵母脂肪酶溶液進(jìn)行紫外全波長掃描，確定其激發(fā)波長。熒光掃描激發(fā)狹縫與發(fā)射狹縫均設(shè)置為5 nm，光電倍增管電壓為700 V，掃描速度為2400 nm/min，固定激發(fā)波長為λex=275 nm。取1 mL 濃度為50 mg/mL南極假絲酵母酶液作為底物置于熒光比色皿中，30 ℃下每間隔5 min 添加20 μL 的納米金溶液，觀察分析熒光光譜發(fā)射峰的變化。

1.2.5.3 紅外光譜分析 將冷凍干燥得到的CAL@AuNPs 粉末和未經(jīng)處理的南極假絲酵母脂肪酶各取5 mg，置于傅里葉變換紅外光譜儀中，扣除平衡空白背景采用常規(guī)壓片法，在波數(shù)范圍為4000～450 cm-1，分辨率4 cm-1的條件下，掃描收集樣品的紅外光譜，分析固定化脂肪酶樣品分子基團(tuán)的變化。

1.2.6 微波輔助脂肪酶催化油酸淀粉酯的制備 稱取2 g 淀粉與油酸混合后分別加入CAL@AuNPs、游離酶（南極假絲酵母脂肪酶）、Novozym 435 于三頸燒瓶內(nèi)后充分?jǐn)嚢? min，置于微波反應(yīng)器中。反應(yīng)結(jié)束后用80 ℃無水乙醇進(jìn)行沖洗后放入105 ℃烘箱內(nèi)烘干2 h 至恒重，即油酸淀粉酯。

1.2.7 單因素實(shí)驗(yàn) 單因素實(shí)驗(yàn)采用控制變量法，以2 g 淀粉為固定因素，以取代度為指標(biāo)確定微波反應(yīng)功率、時(shí)間、溫度、脂肪酶添加量、油酸添加量五個因素的最佳反應(yīng)條件，并用以探究微波輔助條件下CAL@AuNPs 與Novozym 435 固定化酶催化活性的影響。

1.2.7.1 微波功率對脂肪酶催化活性的影響 在2 g 淀粉，油酸添加量為10 mL，脂肪酶添加量為5%（淀粉干重），微波反應(yīng)溫度為40 ℃，時(shí)間為40 min的條件下，依次以200、300、400、500、600 W，5 個梯度功率考察功率對脂肪酶催化活性的影響

1.2.7.2 微波反應(yīng)時(shí)間對脂肪酶催化活性的影響在2 g 淀粉，油酸添加量為10 mL，脂肪酶添加量為5%（淀粉干重），微波反應(yīng)溫度為40 ℃，功率400 W的條件下，依次以20、30、40、50、60 min，5 個梯度時(shí)間考察微波反應(yīng)時(shí)間對脂肪酶催化活性的影響。

1.2.7.3 微波反應(yīng)溫度對脂肪酶催化活性的影響在2 g 淀粉，油酸添加量為10 mL，脂肪酶添加量為5%（淀粉干重），微波反應(yīng)時(shí)間為40 min，功率400 W的條件下，依次以25、30、35、40、45 ℃，5 個梯度溫度考察微波反應(yīng)溫度對脂肪酶催化活性的影響。

1.2.7.4 脂肪酶添加量對脂肪酶催化活性的影響在2 g 淀粉，油酸添加量為10 mL，微波反應(yīng)時(shí)間為40 min，功率400 W，溫度為35 ℃的條件下依次加入3%、4%、5%、6%、7%（淀粉干基）的脂肪酶，5 個梯度脂肪酶添加量考察脂肪酶添加量對脂肪酶催化活性的影響。

1.2.7.5 油酸添加量對脂肪酶催化活性的影響 在2 g 淀粉，脂肪酶添加量為5%，微波反應(yīng)時(shí)間為40 min，功率400 W，溫度為35 ℃的條件下，依次加入6、8、10、12、14 mL 油酸，5 個梯度油酸添加量考察油酸添加量對脂肪酶催化活性的影響。

1.2.8 產(chǎn)物取代度的測定 取代度的測定方法采用本課題組前期建立的甲醇醇解-氣相色譜檢測法進(jìn)行測定[16]。計(jì)算公式為

式中：n 表示發(fā)生酯化的油酸的物質(zhì)的量，mol；M0表示樣品質(zhì)量，g；M1表示葡萄糖殘基的分子量，162；M2表示油酸分子量，282.46；MH2O表示水的分子量，18。

1.2.9 油酸淀粉酯的定性分析和結(jié)構(gòu)表征

1.2.9.1 紅外光譜分析 取適量原玉米淀粉與單因素最佳實(shí)驗(yàn)條件下制備的油酸淀粉酯，操作同1.2.5.3，分別收集二者紅外光譜，并進(jìn)行分析。

1.2.9.2 核磁共振氫譜分析 參考王艷等[13]的方法。取單因素最佳實(shí)驗(yàn)條件下制備的油酸淀粉酯溶于二甲基亞砜分析純?nèi)芤褐羞M(jìn)行檢測。具體參數(shù)為：觀察頻率：400 MHz，譜寬（δ）：0～15，探頭：5 mm，脈沖序列：30，測定溫度：25 ℃。在此實(shí)驗(yàn)條件下，進(jìn)行結(jié)果分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個單因素反應(yīng)條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，測定固定化脂肪酶結(jié)構(gòu)及油酸淀粉酯結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)3 次，利用Origin18 進(jìn)行作圖，單因素顯著性分析利用SPSS 軟件進(jìn)行分析，利用Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 CAL@AuNPs 的制備

2.1.1 CAL@AuNPs 制備條件優(yōu)化 納米金粒徑的大小、納米金添加量、固定化時(shí)間及固定化溫度均能影響CAL@AuNPs 的催化活性，其中AuNPs 粒徑大小不僅可以改變酶的結(jié)構(gòu)來影響酶的活性中心，還可以影響底物吸收微波的能力從而影響酶的催化效果。如圖2A 所示，當(dāng)粒徑小于14 nm 時(shí)，CAL@AuNPs催化效果隨AuNPs 粒徑增大而增強(qiáng)。這是因?yàn)槲⒉ㄝ椛鋵uNPs 具有選擇性加熱的特點(diǎn)，從而產(chǎn)生熱點(diǎn)效應(yīng)，進(jìn)一步提高酶的催化活性[18]。當(dāng)粒徑大于14 nm 時(shí)，油酸轉(zhuǎn)化率迅速下降，隨著粒徑的增大，納米金占據(jù)脂肪酶在底物中的位置，從而減弱底物的吸波能力使得脂肪酶的催化活性下降，導(dǎo)致油酸轉(zhuǎn)化率的降低，且納米金粒徑所選擇的5 個粒徑大小均存在顯著性差異（P＜0.05），因此選用粒徑為14 nm 的納米金溶液進(jìn)行CAL@AuNPs 的制備。

納米金添加量能夠在一定程度上影響脂肪酶的活性中心從而影響酶的催化活性。如圖2B 所示，隨著AuNPs 添加量的增加，油酸轉(zhuǎn)化率呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)AuNPs 添加量為4 mL 時(shí)， CAL@AuNPs催化效果最好，油酸轉(zhuǎn)化率最高為34.54%。這是因?yàn)锳uNPs 添加量影響酶與AuNPs的接觸面積[19]，隨著AuNPs 添加量的增加，酶與AuNPs 的接觸面積增大，從而保持了酶的催化穩(wěn)定性，且在一定程度上限制了脂肪酶的聚集現(xiàn)象，保持酶的活性狀態(tài)，使得底物與酶充分發(fā)生反應(yīng)。AuNPs在此也提供了一個有利于促進(jìn)脂肪酶催化反應(yīng)的環(huán)境，使微波能夠有效均勻發(fā)揮作用提高酶促反應(yīng)，提高油酸轉(zhuǎn)化率。但是，隨著納米金溶液的進(jìn)一步增加，AuNPs 的密度增加會阻礙酶與底物的接觸，同時(shí)高濃度的納米金形成聚集現(xiàn)象，從而降低了脂肪酶催化底物的活性。且在納米金添加量為1、2、3 mL時(shí)存在顯著性差異（P＜0.05），4、5 mL 時(shí)沒有顯著性差異（P＞0.05），因此選用4 mL 添加量進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖2 納米金粒徑（A）、納米金添加量（B）、固定化時(shí)間（C）及固定化溫度（D）對酶促反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of gold nanoparticles size (A)、additive amount (B)、immobilization time (C) and temperature (D) on enzymatic reaction

固定化時(shí)間也會對酶的催化活性產(chǎn)生影響，由圖2C 所示，CAL@AuNPs 制備時(shí)間在4～8 h 范圍內(nèi)，形成的CAL@AuNPs 催化能力隨時(shí)間的增加先增強(qiáng)后減弱，6 h 時(shí)效果最佳，油酸轉(zhuǎn)化率為37.23%。當(dāng)固定化時(shí)間繼續(xù)增加，所得固定化酶的催化能力會迅速降低。這是因?yàn)殡S著時(shí)間的增加，納米金表面已經(jīng)被成功固定化的脂肪酶可能會繼續(xù)被酶分子覆蓋，互相折疊掩蓋酶催化活性中心，其余酶的活性基團(tuán)可能與AuNPs 鍵合反而使其催化酯化反應(yīng)的效果下降。且當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為5、6、7、8 h 時(shí)無明顯差異（P＞0.05），與4 h 時(shí)有顯著性差異（P＜0.05）。因此，選擇5～8 h 內(nèi)固定化最佳時(shí)間為6 h。

溫度在酶催化反應(yīng)中影響脂肪酶的結(jié)構(gòu)從而直接影響著酶的活性和穩(wěn)定性。固定化溫度對酶催化效果如圖2D 所示，溫度在30～40 ℃時(shí)油酸轉(zhuǎn)化率不斷增加，這是因?yàn)殡S著溫度的升高，分子運(yùn)動速率加快，促進(jìn)AuNPs 與CAL 的有效結(jié)合，酶催化效果隨溫度的升高而增強(qiáng)，溫度為40 ℃時(shí)油酸的轉(zhuǎn)化率最高為38.48%。繼續(xù)升高溫度，CAL 的結(jié)構(gòu)隨著溫度的升高遭到破壞，且已經(jīng)固定化成功的CAL@AuNPs 隨著溫度升高納米金吸收熱量增加也會導(dǎo)致CAL@AuNPs 的結(jié)構(gòu)破壞，致使酶的催化活性下降。且35 ℃與45、50 ℃之間沒有顯著性差異（P＞0.05），而30、40 ℃與其他三組存在顯著性差異（P＜0.05）。因此，采用40 ℃作為制備固定化酶的最佳溫度。

綜上所述，CAL@AuNPs 的最佳制備條件為，50 mg/mL 的CAL 溶液中添加4 mL 粒徑為14 nm的納米金后置于40 ℃下固定化6 h。

2.1.2 CAL@AuNPs 的 表 征 CAL 是 由317 個 氨基酸組成的球狀蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，大多數(shù)脂肪酶都具有3 種能產(chǎn)生熒光發(fā)射光譜的內(nèi)源性氨基酸，分別是酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。CAL 固定在AuNP 上后必然引起CAL 的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，通過紫外光譜特征峰、熒光光譜以及紅外光譜對該現(xiàn)象進(jìn)行表征。從圖3A 中可以看出CAL 固定在AuNPs 上后，其特征峰從275 nm 處發(fā)生藍(lán)移且峰值下降，這可能是因?yàn)镃AL 中酪氨酸中含有苯環(huán)等大的不飽和基團(tuán)，且酪氨酸中的-OH 存在給電子共軛效應(yīng)。由于共軛體系中酪氨酸有n→π*躍遷，納米金粒子引起原苯環(huán)的振動以及AuNPs 能夠穩(wěn)定而迅速的吸附蛋白質(zhì)，這兩種作用共同引起特征峰的藍(lán)移且峰值下降。已知AuNPs 的特征峰在520 nm 左右，在圖中可以看出在552 nm 處出現(xiàn)新的特征峰，說明AuNPs 的顆粒在脂肪酶的作用下間距變小，發(fā)生聚集，更加準(zhǔn)確的說明了固定化酶結(jié)構(gòu)的變化。

從熒光光譜中（圖3B）也可看出脂肪酶中氨基酸的變化。酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸熒光峰位波長分別在348、303、282 nm 附近[20]。當(dāng)激發(fā)波長為275 nm 時(shí)，色氨酸和酪氨酸被同時(shí)激發(fā)，在圖3B 可以看出AuNPs 的引入致使303 nm 處色氨酸特征峰發(fā)生明顯的下降及藍(lán)移，且在550 nm 納米金特征峰處的峰值升高，說明脂肪酶上的色氨酸與AuNPs 結(jié)合形成固定化酶CAL@AuNPs。

圖3 CAL（a）和CAL@AuNPs（b）的紫外（A）、熒光（B）及紅外光譜圖（C）Fig.3 Ultraviolet spectra (A)、fluorescence spectra (B) and infrared spectroscopic analysis (C) of CAL (a) and CAL@AuNPs (b)

紅外光譜圖也可以用來分析脂肪酶結(jié)構(gòu)的變化，脂肪酶的酰胺Ⅰ帶（1600～1700 cm-1）可以反映脂肪酶的二級結(jié)構(gòu)，脂肪酶的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈骨架中局部肽段的構(gòu)象。α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)中存在較多的氫鍵，其作用使得規(guī)則二級結(jié)構(gòu)具有一定的穩(wěn)定性和剛性[21]。在1682～1700 cm-1為β-折疊結(jié)構(gòu)，1650～1660 cm-1為α-螺旋結(jié)構(gòu)[22]。如圖3C 所示，由AuNPs 制備的CAL@AuNPs 峰型較CAL 峰型有些許變化，在2925 cm-1處為C-H 鍵的吸收峰，在1650 cm-1處為C=C 鍵吸收峰，而CAL@AuNPs 在此處的峰值增強(qiáng)，說明此時(shí)β-折疊結(jié)構(gòu)和α-螺旋結(jié)構(gòu)都有改變，且在525 nm 處-S-S-鍵峰值減弱，結(jié)合紫外與熒光圖譜說明CAL 中色氨酸與酪氨酸中的-S-S-與AuNPs 粒子偶聯(lián)，形成Au-S 鍵，成功制備CAL@AuNPs。

2.2 微波輔助脂肪酶催化油酸淀粉酯合成條件優(yōu)化及脂肪酶催化活性對比分析

2.2.1 微波功率對脂肪酶催化活性的影響 在微波輔助CAL@AuNPs 催化制備油酸淀粉酯的過程中，低功率微波能夠促進(jìn)酯化反應(yīng)，Lukasiewicz 等[23]在實(shí)驗(yàn)中也證明了這一點(diǎn)。如圖4 所示隨著功率的增大，Novozym 435 和 CAL@AuNPs 的催化效果均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，400 W 時(shí)CAL@AuNPs 催化效果最強(qiáng)，測得取代度為0.0234，而Novozym 435在500 W 時(shí)催化效果最強(qiáng)，取代度為0.0188。這是因?yàn)槲⒉üβ实脑龃竽軌蚋纳频孜锱c酶分子之間的分子間的碰撞運(yùn)動，促進(jìn)酶與底物的反應(yīng)接觸均勻，進(jìn)而加速酯化反應(yīng)的完成。繼續(xù)增大功率，取代度下降，過大的微波功率對脂肪酶結(jié)構(gòu)造成破壞，降低脂肪酶催化活性。

圖4 微波功率對脂肪酶催化活性的影響Fig.4 Effect of microwave power on lipase catalytic activity

在圖中可以看出CAL@AuNPs 催化效果要優(yōu)于Novozym 435，這是因?yàn)榧{米金作為吸收微波載體產(chǎn)生熱點(diǎn)效應(yīng)，400 W 前納米金的熱點(diǎn)效應(yīng)隨著功率的增大而增大，因此催化效果較強(qiáng)。隨著微波功率的增大，微波能量直接作用于吸附在大孔樹脂上的Novozym 435 使其結(jié)構(gòu)破壞，而CAL@AuNPs 中納米金起到對CAL 的保護(hù)作用減小受破壞程度，酶不易失活，因此而催化活性雖然下降，但CAL@AuNPs催化活性依舊優(yōu)于Novozym 435。且CAL@AuNPs在300 與600 W 之間催化所得取代度沒有顯著性差異（P＞0.05），其他三組存在顯著性差異（P＜0.05）；Novozym 435 在400 與600 W 之間沒有顯著性差異（P＞0.05），其他三組存在顯著性差異（P＜0.05）。因此選用400 W 為CAL@AuNPs、500 W 為Novozym 435 催化最佳微波功率進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 微波反應(yīng)時(shí)間對脂肪酶催化活性的影響AuNPs 的加入能夠有效延長酶促反應(yīng)時(shí)間，在其保護(hù)下脂肪酶不會迅速失活。從圖5 中可以看出隨著微波作用時(shí)間的增加，二者取代度均隨著反應(yīng)時(shí)間的增大先增加后下降。在40 min 時(shí)，CAL@AuNPs 催化活性最強(qiáng)，取代度為0.0247，而Novozym 435 在50 min 時(shí)催化活性最強(qiáng)，取代度為0.0189。這是因?yàn)槲⒉軌蛟谝欢ǔ潭壬细淖兠傅姆肿咏Y(jié)構(gòu)，促進(jìn)酶活性中心暴露出來，充分與底物進(jìn)行反應(yīng)，提高酶的催化效率[24]。且隨著時(shí)間的增加，底物分子運(yùn)動相互接觸的時(shí)間增加也會促進(jìn)產(chǎn)物的生成。繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間，分子之間的碰撞運(yùn)動也會促使體系溫度升高，脂肪酶的結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞會使酶的活性迅速下降甚至失活，從而取代度下降[14]。

圖5 微波反應(yīng)時(shí)間對脂肪酶催化活性的影響Fig.5 Effect of microwave time on lipase catalytic activity

在圖中可以看出，CAL@AuNPs 催化活性優(yōu)于Novozym 435，這是因?yàn)橛捎贏uNPs 具有熱點(diǎn)效應(yīng)，吸收微波能量的能力強(qiáng)，且AuNPs 對脂肪酶具有良好的保護(hù)作用，因此所需催化時(shí)間短，催化活性高。且CAL@AuNPs 在20～50 min 內(nèi)催化所得取代度存在顯著性差異（P＜0.05），而60 min 與30 min 所得取代度無顯著性差異（P＞0.05）；Novozym 435 在20～50 min 內(nèi)存在顯著性差異（P＜0.05），而60 min 與40 min 所得取代度無顯著性差異（P＞0.05）。因此，選定40 min 為CAL@AuNPs、50 min 為Novozym 435 最佳反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)。

2.2.3 微波反應(yīng)溫度對脂肪酶催化活性的影響 反應(yīng)溫度是酯化反應(yīng)的重要影響因素之一，適宜的溫度會促進(jìn)脂肪酶活性基團(tuán)的暴露及淀粉-OH 的暴露，從而更好地發(fā)生酯化反應(yīng)[25]。如圖6 所示，隨著溫度的增大，二者取代度均隨著溫度的增大呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)溫度為35 ℃時(shí)，CAL@AuNPs 催化活性最強(qiáng)為0.0259，而Novozym 435 在溫度為40 ℃時(shí)催化活性最強(qiáng)，取代度為0.0197。這是因?yàn)殡S著溫度的升高，淀粉的結(jié)構(gòu)逐漸打開，淀粉的-OH 和油酸中-COOH 充分結(jié)合發(fā)生酯化反應(yīng)，且酶的活性中心充分暴露，酶促反應(yīng)更容易進(jìn)行[26]。隨著溫度的繼續(xù)上升，取代度隨之下降。這是因?yàn)槊缸鳛榇呋瘎┰谖⒉▓鲋斜患訜崴俣缺戎車橘|(zhì)更快，引起酶在體系內(nèi)吸收熱量更多，酶結(jié)構(gòu)被破壞，使得催化活性下降。

圖6 微波反應(yīng)溫度對脂肪酶催化活性的影響Fig.6 Effect of microwave temperature on lipase catalytic activity

在圖中可以看出，CAL@AuNPs 催化活性優(yōu)于Novozym 435，但其耐熱效果低于Novozym 435。這是因?yàn)镹ovozym 435 本身屬于耐熱性酶，在一定溫度下會保持酶的活性，且CAL@AuNPs 中AuNPs的熱點(diǎn)效應(yīng)隨著溫度的升高而增強(qiáng)，吸收熱量增大[13]，因此酶結(jié)構(gòu)被破壞，從而降低催化活性。且CAL@AuNPs 在25～40 ℃之間催化所得取代度存在顯著性差異（P＜0.05），當(dāng)溫度升高至45 ℃時(shí)所得取代度與30 ℃時(shí)所得取代度無顯著性差異（P＞0.05）；Novozym 435 在25～40 ℃之間催化所得取代度存在顯著性差異（P＜0.05），溫度升高至45 ℃時(shí)，與35、40 ℃之間所得取代度沒有顯著性差異（P＞0.05），因此，選定35 ℃為CAL@AuNPs、40 ℃為Novozym 435最佳反應(yīng)溫度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.4 脂肪酶添加量對酶促反應(yīng)的影響 從圖7 中可以看出，隨著脂肪酶添加量的增大，取代度呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)CAL@AuNPs 添加量（淀粉干基）為5%時(shí)，取代度最大為0.0203。而Novozym 435 添加量為6%時(shí)，取代度最大為0.0179。這是因?yàn)殡S著酶量的增加，酶的催化活性增強(qiáng)，底物與酶活性位點(diǎn)的接觸面積增大，二者酶催化活性增強(qiáng)。繼續(xù)增加酶量，過量的酶加入會使體系內(nèi)酶濃度與底物濃度飽和，由于Novozym 435 固定于大孔樹脂上，酶含量的增加導(dǎo)致酶聚集作用增強(qiáng)，使得酶催化活性下降。CAL@AuNPs 含量的增加導(dǎo)致體系內(nèi)AuNPs 含量增加，從而導(dǎo)致微波作用于AuNPs 產(chǎn)生的熱點(diǎn)效應(yīng)增強(qiáng)，吸收微波能量增強(qiáng)溫度升高，高溫導(dǎo)致酶的結(jié)構(gòu)被破壞，催化效果減弱[27]。

圖7 脂肪酶添加量對催化效果的影響Fig.7 Effect of lipase addition amount on catalytic effect

在圖中可以看出，CAL@AuNPs 催化活性不僅優(yōu)于Novozym 435，且用量前者少于后者，節(jié)省酶用量，降低成本。且CAL@AuNPs 在酶添加量為3%～6%時(shí)催化所得取代度存在顯著性差異（P＜0.05），當(dāng)酶添加量增加至7%時(shí)所得取代度與4%時(shí)所得取代度無顯著性差異（P＞0.05）；Novozym 435 在酶添加量為3%～5%時(shí)催化所得取代度存在顯著性差異（P＜0.05），當(dāng)添加量增加至6%與7%時(shí)均與5%時(shí)所得取代度沒有顯著性差異（P＞0.05），因此，選定5%為CAL@AuNPs、6%為Novozym 435 酶添加量作為最佳酶添加量進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。

2.2.5 油酸添加量對酶促反應(yīng)的影響 在酯化反應(yīng)中底物比也是影響酯化反應(yīng)的重要因素。由于固定化酶在非水相介質(zhì)中的催化反應(yīng)屬于非均相反應(yīng)，酶的擴(kuò)散程度較在水相介質(zhì)中小，受限制程度較大[28]，因此要選定適當(dāng)?shù)牡孜锉?，使得酶在體系內(nèi)擴(kuò)散均勻。從圖8 中可以看出，隨著油酸添加量的增大，取代度均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)添加量為10 mL時(shí)，經(jīng)CAL@AuNPs 和Novozym 435 催化所得油酸淀粉酯取代度均最大。前者為0.0259，后者為0.0198。這是因?yàn)樵诒緦?shí)驗(yàn)中油酸提供-COOH 與淀粉中的-OH 相結(jié)合生成酯化反應(yīng)，隨著油酸含量的增加-COOH 的量增加與直鏈淀粉螺旋結(jié)構(gòu)上的-OH相結(jié)合，促進(jìn)反應(yīng)中更多油酸淀粉酯的生成，取代度增大[16]。繼續(xù)增加油酸含量，取代度隨之下降。過量的油酸會出現(xiàn)脂肪酶活性中心被包裹的現(xiàn)象，使酶的活性位點(diǎn)不能完全暴露，限制了酶的催化效果，取代度降低。

圖8 油酸添加量對脂肪酶催化效果的影響Fig.8 Effects of oleic acid addition on lipase catalysis

在圖中可以看出，當(dāng)取代度下降時(shí)，經(jīng)CAL@AuNPs催化得到的油酸淀粉酯取代度下降平緩，進(jìn)一步說明AuNPs 熱點(diǎn)效應(yīng)增強(qiáng)體系吸收微波能力，使得CAL@AuNPs 活性減弱緩慢。且CAL@AuNPs 與Novozym 435 在油酸添加量為6～10 mL 時(shí)催化所得取代度存在顯著性差異（P＜0.05），當(dāng)油酸添加量增加至12 時(shí)，所得取代度與10 mL 時(shí)所得取代度無顯著性差異（P＞0.05）；因此，均選定10 mL 油酸添加量作為最佳油酸添加量。

2.2.6 油酸淀粉酯的結(jié)構(gòu)分析

2.2.6.1 紅外光譜圖分析 如圖9 所示，為淀粉與油酸在微波輔助下分別以游離的CAL、Novozym 435 脂肪酶及CAL@AuNPs 作為催化劑，單因素最佳條件下催化合成的產(chǎn)物油酸淀粉酯的紅外光譜圖。由圖可知，紅外光譜的特征峰在3000～2800 cm-1之間歸屬于氫鍵締合的C-H 伸縮振動；3600～3000 cm-1之間較為寬大的峰是由-OH 的伸縮振動產(chǎn)生；在1336 cm-1處是由葡萄糖殘基AGU 的伸縮振動產(chǎn)生的。與原玉米淀粉相比，經(jīng)過Novozym 435 脂肪酶與CAL@AuNPs 催化產(chǎn)生的油酸淀粉酯結(jié)構(gòu)中在3400～3200 cm-1處-OH 特征峰的強(qiáng)度小于原玉米淀粉，這是因?yàn)樵衩椎矸凵喜糠?OH 被取代而減少，且在1730 cm-1處均會出現(xiàn)一個新的特征峰且峰值明顯，2882 cm-1處出現(xiàn)了微弱的亞甲基C-H 吸收峰，此結(jié)果證明酯鍵的生成[29]，且后者的酯鍵峰值大于前者。由此可以判定Novozym 435 脂肪酶和CAL@AuNPs 在該體系下均能催化油酸淀粉酯的合成。另外，對比油酸淀粉酯和原淀粉的紅外譜圖可以看出，油酸淀粉酯圖譜中除了在1730 cm-1處出現(xiàn)酯鍵特征峰外，并沒有出現(xiàn)其他特征峰，由此可以證明無其他副產(chǎn)物產(chǎn)生。但以游離的CAL 為催化劑制備的產(chǎn)物紅外圖譜中并沒有看到酯鍵的生成，說明該體系下CAL 催化酯化反應(yīng)的能力極弱甚至不能催化酯化反應(yīng)的發(fā)生。因此選用Novozym 435 脂肪酶和CAL@AuNPs 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖9 玉米淀粉及脂肪酶催化制得油酸淀粉酯的紅外光譜圖Fig.9 Infrared spectra of corn starch and lipase catalyzed production of oleic acid starch esters

2.2.6.2 核磁共振圖譜分析 如圖10 所示為CAL@AuNPs 催化生成油酸淀粉酯的核磁共振圖譜，其中δ 3.3～5.6 產(chǎn)生的吸收峰為淀粉分子中氫核的吸收峰。油酸淀粉酯在δ 3.3～5.6 產(chǎn)生的吸收峰與淀粉產(chǎn)生的峰重疊，為淀粉中氫核的吸收峰。而δ 0.5～2.3 范圍內(nèi)的峰為油酸上氫原子的吸收峰。在δ 6 以后沒有出現(xiàn)吸收峰，說明油酸淀粉酯中沒有殘留的油酸，這也進(jìn)一步證明了用乙醇可以有效地除去未反應(yīng)的油酸。因此，結(jié)合紅外圖譜可以判定本實(shí)驗(yàn)制備的CAL@AuNPs 可以在微波條件下催化油酸與淀粉發(fā)生酯化反應(yīng)制備油酸淀粉酯，且無其它副產(chǎn)物產(chǎn)生。

圖10 玉米淀粉及脂肪酶催化制得油酸淀粉酯的核磁共振氫譜圖Fig.10 1H NMR of corn starch and lipase catalyzed production of oleic acid starch esters

3 結(jié)論

本研究制備了新型的固定化南極假絲酵母脂肪酶，并以此方式將AuNPs 引入到微波輔助酶催化體系，有效提高了微波輔助脂肪酶催化油酸淀粉酯的合成效率。在單因素實(shí)驗(yàn)下得到CAL@AuNPs 最佳制備條件為：納米金添加量4 mL、粒徑14 nm、反應(yīng)溫度40 ℃、反應(yīng)時(shí)間6 h。微波輔助條件下，商品化固定化Novozym 435 和本實(shí)驗(yàn)制備的CAL@AuNPs均可高效催化油酸淀粉酯的合成，且CAL@AuNPs的催化能力高于Novozym 435。微波條件下CAL@AuNPs 催化油酸淀粉酯合成的最佳制備條件為：微波功率400 W、反應(yīng)溫度35 ℃、反應(yīng)時(shí)間40 min、脂肪酶添加量5%（淀粉干基）、油酸添加量10 mL，此時(shí)取代度最高為0.0259。與商品化固定化Novozym 435 相比，在微波條件下CAL@AuNPs 催化活性較高，反應(yīng)時(shí)間短，有效解決無溶劑體系下微波輔助脂肪酶催化效果差，微波輻射能利用率低的難題。但目前，無溶劑體系下CAL@AuNPs 催化油酸淀粉酯合成的催化反應(yīng)機(jī)制并不明確，納米金是否具備催化活性仍需進(jìn)一步探討。