嚴慧婕 何金美

(廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院藥劑科，廣東 廣州 510360)

心肌缺血是以心臟供氧供血不足，能量代謝異常所導致心臟無法正常工作的疾病狀態(tài)，在中醫(yī)學中屬于“胸痹”的范疇[1]，病機為氣機凝澀、血脈不暢。根據(jù)“通則不痛”“氣行則血行，氣滯則血瘀”的原則，治療本病多選用活血、化瘀、行氣之藥，以行氣促進活血、化瘀之功效，三者相互為用，氣血雙調(diào)，使行氣活血、通絡止痛的功效更為顯著。丹參-檀香藥對具有極大的抗心肌缺血損傷的潛力。廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院臨床運用丹參-檀香藥對治療心肌缺血時，發(fā)現(xiàn)不同配比的丹參-檀香對心肌缺血患者的藥效差異較大。結合臨床使用的實際情況，本文采用膠囊的給藥形式，以心肌缺血再灌注損傷大鼠的治療效果為依據(jù)篩選丹參-檀香藥對的最優(yōu)配比。

1 材料與方法

1.1 儀器 酶標儀(美國伯騰儀器有限公司，型號：Elx800TSUVI)；SAR-1000型小動物呼吸機(上海玉研科學儀器有限公司)CBGT-48高速組織研磨機(常州德杜精密儀器有限公司)；XS-02型多功能高速粉碎機(上海兆申科技有限公司)。

1.2 試藥 肌酸激酶(CK)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒以及丙二醛(MDA)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所，批號分別為A032-1、A020-1、A001-1、A005-1、A003-1；生理鹽水(上海百特醫(yī)療用品有限公司，國藥準字H20013250)；注射用苯巴比妥鈉(上海新亞藥業(yè)有限公司,國藥準字H31020501)；復方丹參滴丸(天津天士力制藥集團股份有限公司,國藥準字Z10950111)。

1.3 方法

1.3.1 藥物的準備 (1)取30 g丹參，粉碎機粉碎，取過2號篩，未過3號篩的粉末備用。(2)取15 g檀香，粉碎機粉碎，取過2號篩，未過3號篩的粉末備用。

1.3.2 動物分組 取60只雌雄各半的SD 大鼠，體質量為(250±10) g，隨機分為6組，每組 10 只，雌雄各半，分為假手術組、模型組、陽性對照組、丹參-檀香給藥5 g∶5 g組(a組)、10 g∶5 g組(b組)、15 g∶5 g組(c組)。

1.3.3 模型的建立 大鼠腹腔注射0.1 mL苯巴比妥麻醉后，仰臥位固定好，將21 號聚乙烯針套插入聲門，接呼吸機，參數(shù)設為潮氣量 0.4～0.8 mL，吸呼比 1∶1～1∶1.2。胸大肌下面脫毛處理，之后沿著大鼠左側胸大肌下緣做一斜向大鼠左上肢的斜行皮膚切口，先用線將切口處縫上，但不閉合皮膚切口，待操作完成后再閉合。用鑷子鈍性分離肌肉組織后用開胸器進行支撐，使心臟暴露，將心包剪開；以心大靜脈作為標志，從其末端分叉點上方的1～2 mm、偏左 0.5～1 mm 處進針，從心臟的右側出針，使靜脈末端分叉點大概位于進針點和出針點的中間位置，結扎，可見心肌變紫，活動低下，缺血時間為 30 min。心電圖ST 段抬高，說明心肌缺血狀況出現(xiàn)；將結扎的活結拉起，松開后完成再灌注，當大鼠心電 ST 段波峰下降至原高度 50%左右時，提示再灌注損傷模型建立成功。在術中術后應保持適宜的溫度，并將大鼠置于無菌環(huán)境中進行恢復。假手術組造模方法與手術組一致，但開胸之后只穿線不結扎[2-4]。

1.3.4 不同比例丹參-檀香粉末給藥方案 造模前14 d，用生理鹽水將混合粉末進行混懸，按照2 mL/100 g大鼠體質量灌胃給藥，假手術組和模型組給予生理鹽水，陽性對照組給予約8 μg/100 g的復方丹參滴丸，不同配比丹參-檀香組大鼠給藥量見表1。在末次給藥 1 h后，進行手術造模，選擇造模成功且沒有死亡的大鼠進行后續(xù)實驗。

1.3.5 待測樣品前處理 造模成功恢復血流灌注 1 h 后，大鼠腹主動脈采血靜置2 h。頸椎脫臼處死大鼠，摘取心臟后，用錫紙包好凍存于-80 ℃冰箱中備用；凍存的心臟組織加入生理鹽水[按照重量(g)∶體積(mL)=1∶9]，用干凈的剪刀盡量剪碎組織，在低溫下用組織FA25勻漿機( 上海洽姆儀器科技有限公司)勻漿心臟組織；以上制備的血清、心臟組織和心臟勻漿液，分別于4 ℃、3600 r·min-1，離心10 min，離心半徑15 cm，分離血清，用5～50 μL移液槍,100～1000 μL移液槍[大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司]取血清至1.5 mL EP 管中，置-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)各項實驗指標的測定。

1.3.6 心肌梗死面積測定 取出恢復再灌注 60 min 的各組大鼠心臟，用預冷的生理鹽水將血沖洗干凈，再用干凈的濾紙吸去多余水分，于結扎線以下取左心室并均勻橫切為 5 部分，進行氮藍四唑(NBT)染色，切片采用多媒體彩色病例圖文分析系統(tǒng)，以固定象距測量正常心肌及梗死心肌面積，計算心肌梗死區(qū)面積，心肌梗死率=梗死區(qū)面積/左心室總面積×100%。

1.4 觀察指標 按照試劑盒說明步驟對血清中的CK和LDH，心肌組織中的MDA、GSH-Px和SOD的含量進行測定。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism8.4.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，經(jīng)檢驗所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分析，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同比例丹參-檀香粉末對大鼠心肌梗死面積的影響 與假手術組相比，模型組的心肌梗死率顯著升高(P<0.01)，說明造模成功。與模型組相比，陽性對照組和給藥a、b和c組大鼠的心肌梗死率均顯著下降(P<0.01)，其中給藥組b、c心肌梗死率由小到大依次是c組0.05)。見圖1。

2.2 不同比例丹參-檀香粉末對血清中CK和LDH含量的影響 模型組血清中的 CK 和 LDH 含量較假手術組顯著升高，表明心肌細胞損傷嚴重，造模成功。除給藥a組LDH的含量較模型組無差異外，給藥組和陽性對照組均較模型組顯著降低血清中CK和LDH的含量(P<0.01)；不同給藥組大鼠血清中CK含量由小到大依次是b組0.05)。見圖2。

2.3 不同比例丹參-檀香粉末對心臟組織中SOD、GSH-Px和MDA含量的影響 與假手術組相比，模型組心臟組織中的 SOD 和 GSH-Px含量顯著下降(P<0.01)，MDA 含量顯著升高(P<0.01)，說明造模成功。與模型組比較，陽性對照組SOD和GSH-Px含量顯著升高(P<0.01)，各給藥組的SOD和GSH-Px含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組的MDA含量顯著降低(P<0.01)，各給藥組的MDA含量明顯降低(P<0.05)。各給藥組大鼠心肌組織中SOD和GSH-Px含量隨丹參量的增加而增加，MDA含量隨丹參量的增加而減少，給藥組兩兩之間CK、LDH和MDA含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3、圖4。

綜上，給藥組治療效果依次為c>b>a，即正常成年人服用最優(yōu)劑量為丹參15 g，檀香5 g。

3 討論

丹參-檀香是經(jīng)典藥對之一。丹參主活血，檀香主行氣，二者配伍使用能增強行氣活血的作用，在臨床上常用于治療心血管系統(tǒng)疾病[5-7]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載丹參“味苦，微寒。主心腹邪氣，腸鳴幽幽如走水，寒熱積聚；破癥除瘕，止煩滿，益氣”，主要用于預防和治療心腦血管疾病和高脂血癥等代謝紊亂性疾病。檀香屬于理氣藥，《本草擇要綱目》記載檀香辛溫無毒，陽中微陰，消風熱腫毒。目前少有研究直接表明檀香對心血管系統(tǒng)疾病有治療作用，但有研究[8-12]報道檀香對丹參有效成分如丹參素的吸收、分布、代謝可能會產(chǎn)生影響，具有協(xié)同增效作用。

依據(jù)2015版《中華人民共和國藥典》[13]，正常成年人丹參日服用最大劑量為15 g，檀香日服用最大劑量為5 g。本實驗結合臨床應用經(jīng)驗，選擇丹參5 g，10 g和15 g，分別與檀香最大劑量5 g配伍應用，通過心肌缺血再灌注損傷大鼠模型尋找丹參-檀香最佳配比。根據(jù)藥效實驗結果分析可得，給藥b、c組效果好于給藥a組，且實驗組c效果比實驗組b好，但b組和c組效果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。出于節(jié)約成本的考慮，選擇實驗組b的藥材配比量為最佳配比，即丹參10 g，檀香5 g。