覃秋燕，曹小麗

缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）是人群死亡及殘疾的主要原因之一，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。研究表明，腦缺血損傷后中性粒細(xì)胞會(huì)迅速遷移至梗死核心部位，并釋放形成中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs），通過(guò)參與內(nèi)源性和外源性凝血機(jī)制、卒中后免疫抑制、繼發(fā)微小血栓形成等機(jī)制加重腦損傷，而中性粒細(xì)胞本身具有N1和N2兩種表型，其中N1表型可加重腦損傷，N2表型對(duì)腦卒中起保護(hù)作用[1,2]。已知缺血性腦卒中還與細(xì)胞分裂周期蛋白42（cell division cycle protein 42，Cdc42）表達(dá)下降有關(guān)，Cdc42作為重要的免疫調(diào)節(jié)分子，不僅可激活和促進(jìn)神經(jīng)干/祖細(xì)胞遷移，促進(jìn)腦損傷的修復(fù)；也可以調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的遷移，甚至誘導(dǎo)其極化表型的轉(zhuǎn)化。目前尚未有研究表明Cdc42和NETs在IS發(fā)生后的作用關(guān)系及機(jī)制，本文綜述了缺血性腦卒中后Cdc42蛋白水平及NETs的變化及二者的關(guān)系，試圖為IS的發(fā)病機(jī)制和治療提供新思路。

1 中性粒細(xì)胞、NETs與缺血性腦卒中

IS早期，外周免疫系統(tǒng)炎癥細(xì)胞因子、趨化因子廣泛激活，引起中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，加重腦損傷[3]。Neumann等[4]使用活體雙光子顯微鏡記錄小鼠卒中模型，發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞在局灶性缺血3 h后開(kāi)始向腦實(shí)質(zhì)浸潤(rùn)，在24～48 h達(dá)到峰值；腦實(shí)質(zhì)內(nèi)靠近缺血核心的區(qū)域，可見(jiàn)浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞通過(guò)血管緩慢滾動(dòng)、粘附、外滲及主動(dòng)遷移，而在離缺血中心較遠(yuǎn)的腦實(shí)質(zhì)未能觀察到中性粒細(xì)胞；同時(shí)發(fā)現(xiàn)浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞引起局部小膠質(zhì)細(xì)胞相互合作，形成扁平網(wǎng)狀的膜突起，阻止中性粒細(xì)胞進(jìn)一步浸潤(rùn)。在小鼠大腦中動(dòng)脈永久性閉塞模型中，梗死腦組織周邊區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞豐富，體外延時(shí)共聚焦顯微鏡可觀察到小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)中性粒細(xì)胞的吞噬作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞可分化出N1和N2表型，缺血核心區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞優(yōu)先吞噬N2表型中性粒細(xì)胞，加快清除炎癥組織中碎片，有利于腦卒中后神經(jīng)炎癥的緩解，而N1極化加重了葡萄糖氧剝奪模型（oxygenglucose deprivation，OGD）神經(jīng)元的死亡[2,6]。說(shuō)明缺血腦損傷導(dǎo)致中性粒細(xì)胞廣泛參與神經(jīng)炎癥發(fā)生并發(fā)揮重要作用，其中N1表型可加重腦損傷，N2表型對(duì)腦卒中起保護(hù)作用。

NETs是中性粒細(xì)胞釋放的細(xì)胞外纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，由DNA、組蛋白和中性粒細(xì)胞顆粒蛋白，包括彈性蛋白酶、組織蛋白酶G和髓過(guò)氧化物酶等組成；其功能是在細(xì)胞外解離和殺死病原體。NETs相關(guān)研究涉及感染、自身免疫、血栓疾病、癌癥、血管重建等[7,8]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)NETs會(huì)加重缺血神經(jīng)元損傷，并可作為IS早期診斷的循環(huán)標(biāo)志物，與健康人相比，急性缺血性卒中患者的NETs顯著升高[2,9,10]。多項(xiàng)研究表明NETs在IS的病理生理過(guò)程中存在多個(gè)干預(yù)靶點(diǎn)，與NETs形成機(jī)制和組成成分相關(guān)。瓜氨酸化組蛋白H3（H3Cit）和細(xì)胞外DNA是NETs形成的標(biāo)志物，Laridan等[11]對(duì)68例接受血管內(nèi)治療的缺血性卒中患者的血栓進(jìn)行免疫染色，發(fā)現(xiàn)均能檢測(cè)到中性粒細(xì)胞，H3Cit陽(yáng)性面積約占血栓總面積的13.45%，同時(shí)H3Cit與中性粒細(xì)胞釋放的細(xì)胞外DNA共定位也證實(shí)NETs的存在。臨床上發(fā)現(xiàn)體外組織型纖溶酶原激活劑（tissue type plasminogen activator，t-PA）治療聯(lián)合DNAse1的血栓溶解效果優(yōu)于單用t-PA，推測(cè)因?yàn)镈NAse1破壞NETs的DNA結(jié)構(gòu)，改善了“t-PA抵抗”[12]。有臨床研究表明急性腦梗死患者取栓組血管再通率高于使用rt-PA溶栓組[13]，“t-PA”抵抗可能是靜脈溶栓效果欠佳的原因之一。另一項(xiàng)對(duì)急性缺血性卒中患者血栓進(jìn)行的組織學(xué)分析也證實(shí)NETs位于血栓的外層，可作為細(xì)胞和多種凝血因子的支架，刺激纖維蛋白沉積；另外，通過(guò)PicoGreen?dsDNA定量分析和ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)血管病患者支架植入后外周血H3Cit和細(xì)胞游離DNA增高[14]。肽基精氨酸脫氨酶4（peptidylarginine deiminases 4，PAD4）是NETs形成所必需的酶，介導(dǎo)了組蛋白瓜氨酸化及染色質(zhì)解聚集的過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，卒中后缺血皮質(zhì)中PAD4的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致NETs增加，伴隨著新生血管的減少和血腦屏障損傷的增加，應(yīng)用藥物抑制PAD活性或使得中性粒細(xì)胞耗竭則可促進(jìn)血管修復(fù)，并增加新生血管，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[8]，反之PAD4缺乏致NETs活性降低，卒中后缺血性損傷較輕，說(shuō)明若能抑制NETs形成，可能有利于缺血后神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)。

有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞缺血使中性粒細(xì)胞遠(yuǎn)離N2表型，并促進(jìn)了NETs的形成[2]。全反式維甲酸（all-trans-retinoic acid，atRA）引導(dǎo)中性粒細(xì)胞向N2表型分化，減少了腦卒中損傷組織中NETs的形成[15]。體外研究證實(shí)N2中性粒細(xì)胞對(duì)氧糖剝奪/再氧合（OGD/R）誘導(dǎo)的原發(fā)性皮質(zhì)神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用[1]，而且N2表型與NETs的形成有相關(guān)性，說(shuō)明支持中性粒細(xì)胞向N2表型分化，NETs形成減少，有利于腦損傷修復(fù)。

2 Cdc42與神經(jīng)細(xì)胞遷移和神經(jīng)細(xì)胞損傷

Cdc42是一種鳥(niǎo)嘌呤三核苷酸（guanosine triphosphate，GTP）酶，屬于RhoGTPase家族成員，可作為分子“開(kāi)關(guān)”在細(xì)胞遷移中行使重要調(diào)節(jié)功能；Cdc42在位于細(xì)胞運(yùn)動(dòng)前緣的區(qū)域被激活，可引起微管和微絲等細(xì)胞骨架的極性分布，約束細(xì)胞爬行的方向，嚴(yán)格且動(dòng)態(tài)地控制處于活性狀態(tài)的Cdc42的含量和分布，細(xì)胞才能實(shí)現(xiàn)正常遷移。

Cdc42參與調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)及遷移過(guò)程。在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，軸突由細(xì)胞體向外延伸，與其他細(xì)胞形成突觸聯(lián)系主要依賴(lài)于其前部的生長(zhǎng)錐，生長(zhǎng)錐由絲足綱連接的絲狀足組成，已知Cdc42缺失的神經(jīng)細(xì)胞絲狀足的數(shù)量減少且生長(zhǎng)緩慢，在軸突生長(zhǎng)中存在缺陷，表明Cdc42參與調(diào)節(jié)軸突的生長(zhǎng)和延伸并起促進(jìn)作用。對(duì)小鼠小腦顆粒細(xì)胞前體進(jìn)行的Cdc42條件性缺失實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Cdc42信號(hào)通路是小腦發(fā)育過(guò)程中小腦顆粒細(xì)胞前體極性和神經(jīng)元-膠質(zhì)連接形成的關(guān)鍵調(diào)控因子[16]。研究表明，抗壞血酸通過(guò)其受體維生素C協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（sodiumvitamin C cotransporter 2，SVCT2）調(diào)節(jié)內(nèi)源性神經(jīng)干/祖細(xì)胞（endogenous neural stem/progenitor cell，eNSC/eNPC）的激活；SVCT2主要表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)，在腦室下區(qū)內(nèi)外部的eNSC/eNPC中均有表達(dá)，在實(shí)驗(yàn)環(huán)境下激活腦室下區(qū)和齒狀回的eNSC/eNPC有利于短期和長(zhǎng)期受損腦組織的恢復(fù)。添加Cdc42選擇性抑制劑的腦室下區(qū)eNSC/eNPC遷移細(xì)胞數(shù)和生長(zhǎng)距離明顯縮短，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白的聚集率、一級(jí)突起和二級(jí)分枝的形成率也有所下降，SVCT2過(guò)度表達(dá)并不能減輕這種抑制作用[17]；說(shuō)明在體外OGD條件下，SVCT2可能是通過(guò)激活Cdc42，促進(jìn)F-肌動(dòng)蛋白的聚集，從而影響eNSC/eNPC的遷移，促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)。

Cdc42可作為缺血半暗帶的潛在血清標(biāo)志物[18]。研究表明IS急性期患者外周血淋巴細(xì)胞中Cdc42陽(yáng)性比率及Cdc42蛋白表達(dá)水平顯著下降[19]。缺血/再灌注顯著改變Cdc42活性，酰基生長(zhǎng)素釋放肽在缺血再灌注損傷動(dòng)物模型中和體外培養(yǎng)的神經(jīng)元中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，?；L(zhǎng)素釋放肽處理可以促進(jìn)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)，減輕腦損傷，蛋白質(zhì)組學(xué)證實(shí)促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)的過(guò)程由Cdc42介導(dǎo)[20]；而排斥引導(dǎo)分子A（repulsive guidance molecule A，RGMa）通過(guò)CDC-42/PAK-1信號(hào)通路介導(dǎo)的血腦屏障破壞參與缺血再灌注損傷[21]。Cdc42介導(dǎo)缺血/再灌注神經(jīng)損傷的修復(fù)過(guò)程，同時(shí)Cdc42是內(nèi)皮細(xì)胞遷移和屏障功能的重要調(diào)節(jié)因子，通過(guò)炎癥作用介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)過(guò)程[22]，并且調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的遷移，所以Cdc42可能通過(guò)神經(jīng)炎癥介導(dǎo)缺血神經(jīng)損傷的修復(fù)。

3 Cdc42與NETs在IS發(fā)病機(jī)制中的協(xié)同作用

中性粒細(xì)胞在IS中聚集釋放形成的NETs在無(wú)菌性梗死組織中誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，加重組織損傷，中性粒細(xì)胞的遷移是聚集的關(guān)鍵；而Cdc42可通過(guò)改變中性粒細(xì)胞極化形態(tài)，調(diào)節(jié)其遷移及運(yùn)動(dòng)方向，通過(guò)介導(dǎo)CD11b信號(hào)調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞尾足來(lái)維持細(xì)胞的極性進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞定向遷移。Cdc42是Rho GTPase家族成員之一，而Rho GTPases是調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)的關(guān)鍵因子，Rho家族在細(xì)胞內(nèi)形成蛋白質(zhì)梯度，前部為較高的活性Rac和較低的活性Rho濃度，而后部以較高的活性Rho和較低的活性Rac濃度為特征；Rac在肌動(dòng)蛋白的前沿參與聚合反應(yīng)，形成層狀脂膜并控制粘附形成，Rho促進(jìn)肌動(dòng)蛋白組織形成應(yīng)力纖維，參與粘附裝配和細(xì)胞后部的尾巴縮回[23]。Cdc42位于細(xì)胞前部，調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白和粘附的組織，即在細(xì)胞遷移過(guò)程中，局部Cdc42信號(hào)直接轉(zhuǎn)向趨化劑，介導(dǎo)趨化調(diào)控行為[24]。

另外，有研究表明抑制Cdc42/Rac1 Rho GTPase可抑制人類(lèi)宿主防御肽LL-37介導(dǎo)的白細(xì)胞遷移，特別是單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的遷移[25]。LL-37是具有免疫調(diào)節(jié)功能的37個(gè)氨基酸的陽(yáng)離子肽，參與趨化因子的產(chǎn)生、白細(xì)胞的募集等促炎功能和其他抗炎反應(yīng)；趨化因子通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K、Ras、Rac、Cdc42、RhoA和其他信號(hào)控制肌動(dòng)蛋白的活動(dòng)；而Cdc42/Rho GTPase選擇性地控制宿主防御肽LL-37介導(dǎo)的趨化特性[25]，說(shuō)明在促炎反應(yīng)中Cdc42即受趨化因子調(diào)節(jié)，也能反饋調(diào)節(jié)趨化因子及中性粒細(xì)胞的募集，影響NETs的形成。

缺血發(fā)生后會(huì)產(chǎn)生活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），進(jìn)一步誘發(fā)炎癥反應(yīng)及神經(jīng)元凋亡[26]，ROS在NETs形成過(guò)程中起重要作用，ROS可以激活染色質(zhì)縮聚，調(diào)控下游PAD4的過(guò)表達(dá)，誘導(dǎo)NETs形成的增加并提高NETs結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和完整性[27]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Cdc42是GPCR激動(dòng)劑（fMLP和C5a）誘導(dǎo)的原代人中性粒細(xì)胞活化、脫顆粒和ROS形成的負(fù)調(diào)節(jié)因子，具有刺激依賴(lài)性[28]；其次，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白的分解是細(xì)胞膜破裂和細(xì)胞外DNA釋放的關(guān)鍵[29]，而Cdc42通過(guò)調(diào)節(jié)效應(yīng)蛋白，可調(diào)節(jié)F-肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的極性，這與NETs的形成密切相關(guān)。最近Tackenberg等[30]通過(guò)Sytox-green動(dòng)力學(xué)分析Cdc42的活性對(duì)原代人中性粒細(xì)胞NETs形成的作用，發(fā)現(xiàn)佛波酯（phorbol ester，PMA）和Cdc42抑制劑（casin）處理均顯著誘導(dǎo)NETs的形成，并且中性粒細(xì)胞與PMA和casin共同孵育可增加NETs形成；該實(shí)驗(yàn)使用Cdc42的藥理抑制劑和遺傳模型，證明Cdc42抑制通過(guò)NADPH氧化酶非依賴(lài)性途徑誘導(dǎo)NETs形成，Cdc42的抑制通過(guò)PKC、SK通道和線(xiàn)粒體活性增加了NETs的形成；支持Cdc42是原代人中性粒細(xì)胞NETs形成的負(fù)調(diào)節(jié)因子。

上述研究表明，Cdc42可抑制NETs的形成。鑒于NETs形成與中性粒細(xì)胞N2表型的相關(guān)性，筆者推測(cè)Cdc42對(duì)缺血腦損傷的保護(hù)作用與其誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞向N2表型轉(zhuǎn)化有關(guān)。

4 小結(jié)與展望

神經(jīng)炎癥是IS的重要研究靶點(diǎn)。目前已證明Cdc42對(duì)IS起保護(hù)作用，而促進(jìn)中性粒細(xì)胞N2極化及減少NETs形成有利于加快清除炎癥碎片，減輕神經(jīng)損傷。部分研究支持Cdc42可抑制NETs形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，所以筆者猜測(cè)Cdc42對(duì)IS起保護(hù)作用與抑制NETs的形成并影響中性粒細(xì)胞極化表型相關(guān)，但目前分子機(jī)制仍不清楚。這對(duì)研究Cdc42及中性粒細(xì)胞二者的關(guān)系至關(guān)重要，可能成為IS新的研究方向。