張麗燕，邱文英，陳奕帆，李 倩，湯笑語(yǔ)，羅文澤，胥燕芳

（1.華派生物工程集團(tuán)有限公司，四川 成都 641402；2.西南民族大學(xué)，四川 成都 610041）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的一種急性、高度接觸性胃腸道傳染病，該病的主要臨床癥狀為嚴(yán)重腹瀉、脫水以及迅速消瘦，最終因嚴(yán)重脫水而死亡[1]。中國(guó)于1979年發(fā)現(xiàn)PEDV，一直呈散發(fā)狀態(tài)。自2012年10月呈大規(guī)模流行趨勢(shì)，該病對(duì)哺乳仔豬的危害最為嚴(yán)重，感染后死亡率高達(dá)100%，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。此病毒在發(fā)現(xiàn)10年之后，Hofmann等[4]用在Vero細(xì)胞中添加胰酶的方式終于成功培養(yǎng)。本試驗(yàn)將豬流行性腹瀉病毒疑似病料處理后，接種Vero細(xì)胞以分離病毒[5-8]，通過(guò)RT-PCR特異性片段的檢測(cè)、典型病變的觀察和間接免疫熒光（IFA）試驗(yàn)，鑒定所分離到的毒株為PEDV，并對(duì)S1基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。PEDV在細(xì)胞上的成功分離及S1基因的遺傳進(jìn)化分析，為以后生物學(xué)、疫苗開發(fā)等研究提供了基礎(chǔ)。

1 發(fā)病情況和臨床癥狀

四川某豬場(chǎng)有存欄母豬1 000頭左右，2020年10月，初生7日齡內(nèi)仔豬陸續(xù)出現(xiàn)腹瀉不止，排淡黃色水樣稀便，脫水嚴(yán)重且死亡率較高。選取腹瀉癥狀較明顯的仔豬進(jìn)行剖檢發(fā)現(xiàn)，仔豬腸壁充氣、變薄、充血（圖1），腸絨毛脫落明顯，腸道中含有未消化的乳凝塊。

圖1 病豬剖檢后的腸道

2 材料與方法

2.1 細(xì)胞與主要試劑

非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）由華派生物工程集團(tuán)有限公司質(zhì)管部保存；鼠抗PEDV全病毒陽(yáng)性血清由華派生物工程集團(tuán)有限公司研發(fā)中心制備并保存。

FITC-羊抗鼠IgG購(gòu)自KPL公司；TRIzol? LS Reagent購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；高效率逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自東洋紡（上海）生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胰酶購(gòu)自GIBCO；新生牛血清購(gòu)自內(nèi)蒙古金源康生物工程材料有限公司。

2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載的PEDV S1基因序列，應(yīng)用MegAlign軟件分析出序列中較保守區(qū)域。使用Primer Primier 5.0軟件按照引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)合成1對(duì)擴(kuò)增PEDV的檢測(cè)引物，設(shè)計(jì)3對(duì)可覆蓋S1基因全長(zhǎng)的特異性引物，TGEV（豬傳染性胃腸炎病毒）、PRoV（豬輪狀病毒）、PDCoV（豬德爾塔冠狀病毒）檢測(cè)引物均由華派生物工程集團(tuán)有限公司研發(fā)中心保存，引物序列見表1，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列

2.3 臨床樣本中PEDV的檢測(cè)

參照TRIzol? LS Reagent試劑說(shuō)明書提取病毒的基因組RNA，以提取的總RNA為模板，利用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成病毒cDNA。以cDNA為模板，配制PCR擴(kuò)增體系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 3 μL，ddH2O 7.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃，5 min；95 ℃，45 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min；30個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。反應(yīng)結(jié)束后，使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行鑒定，對(duì)符合預(yù)期目的條帶的PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2.4 病料的處理及PEDV的分離培養(yǎng)

2.4.1 PEDV陽(yáng)性病料處理 取RT-PCR鑒定為PEDV單一陽(yáng)性的小腸組織，加入滅菌的PBS緩沖液研磨，制成20%（1∶5的重量體積比）組織懸液，反復(fù)凍融3次后離心收集上清液，上清液用0.22 μm濾器過(guò)濾除菌。將過(guò)濾除菌后組織液進(jìn)行分裝，一部分用于接下來(lái)的分離鑒定，剩下的保存于-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 PEDV病毒的分離與傳代培養(yǎng) 取長(zhǎng)滿單層的Vero細(xì)胞（T75細(xì)胞瓶），棄去生長(zhǎng)液，用PBS洗滌3次后，加入過(guò)濾的上清液2.0 mL（含10 μg/mL胰酶），置37 ℃吸附作用1 h后棄掉多余液體，加入含10 μg/mL胰酶的MEM，置37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。之后逐日觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)病變，無(wú)病變則在培養(yǎng)72 h左右收獲；連續(xù)進(jìn)行盲傳，直到出現(xiàn)明顯且穩(wěn)定的細(xì)胞病變。在第5代時(shí)進(jìn)行RT-PCR鑒定。

2.5 TCID50（半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）的測(cè)定

將第8代細(xì)胞毒進(jìn)行10-1～10-6的10倍系列稀釋，每個(gè)稀釋度重復(fù)8孔，分別接種于Vero細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置Vero細(xì)胞做陰性對(duì)照，連續(xù)培養(yǎng)3～5 d，統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)CPE孔數(shù)，按照Reed-Muench法計(jì)算細(xì)胞毒的TCID50。

2.6 PEDV分離株的間接免疫熒光鑒定（IFA）

將Vero細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%左右，將分離的病毒接種于Vero細(xì)胞，同時(shí)設(shè)定正常細(xì)胞作為陰性對(duì)照。接毒24 h后棄去上清液，用冷卻的多聚甲醛固定液固定40 min，之后加入5%脫脂乳封閉2 h。以1∶1 000鼠抗PEDV全病毒陽(yáng)性血清為一抗、以1∶200稀釋的FITC-羊抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行IFA鑒定。

2.7 PEDV分離株S1基因擴(kuò)增

以F8代細(xì)胞培養(yǎng)物cDNA為模板，通過(guò)引物PEDV-S1-1/S1-2/S1-3對(duì)分離株S1片段進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)符合預(yù)期目的條帶的PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2.8 S1基因序列變異情況分析

根據(jù)序列測(cè)定結(jié)果，利用DNAStar軟件將S1-1～S1-3片段拼接成完整的S1基因，將所獲得的S1基因序列提交到NCBI進(jìn)行比對(duì)分析，選出有代表性的PEDV參考毒株的S1基因序列（表2），運(yùn)用DNAStar、MEGA等軟件進(jìn)行分析比較，構(gòu)建基因系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表2 PEDV參考毒株及其序列信息

3 結(jié)果與分析

3.1 病毒的分離與培養(yǎng)

利用實(shí)驗(yàn)室已有的PEDV、TGEV、PRoV、PDCoV特異性引物對(duì)該腹瀉仔豬病料進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，檢出該樣品單一感染PEDV（圖2）。在Vero細(xì)胞上盲傳至第3代，細(xì)胞出現(xiàn)PEDV經(jīng)典的CPE。在傳至第8代后，病變穩(wěn)定，主要表現(xiàn)為：細(xì)胞融合，形成葡萄串珠狀（圖3）。將F5代病毒液進(jìn)行RT-PCR鑒定，擴(kuò)增出一條約700 bp的特異性目的條帶（圖4），表明試驗(yàn)成功從病料中分離到1株P(guān)EDV。

圖2 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 Vero細(xì)胞感染病毒產(chǎn)生的細(xì)胞病變

圖4 RT-PCR鑒定結(jié)果

3.2 TCID50的測(cè)定

將PEDV分離株連續(xù)傳代，并將第8代細(xì)胞毒接種于Vero細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)3 d后，統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)CPE孔數(shù)，按照Reed-Muench法計(jì)算第8代細(xì)胞毒的TCID50為10-4.5/0.1 mL。

3.3 PEDV分離株的間接免疫熒光鑒定

將分離的豬流行性腹瀉病毒（PEDV）毒株接種于Vero細(xì)胞，利用IFA方法對(duì)病毒感染的Vero細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光鑒定，未接毒的正常Vero細(xì)胞作為陰性對(duì)照。結(jié)果表明，PEDV分離株感染細(xì)胞后可與PEDV鼠源全病毒血清發(fā)生特異性結(jié)合，出現(xiàn)特異性免疫熒光，而對(duì)照組沒(méi)有出現(xiàn)熒光（圖5）。

圖5 X-6/2021株感染Vero細(xì)胞的間接免疫熒光鑒定

3.4 PEDV分離株S1基因的擴(kuò)增及序列測(cè)定

3對(duì)引物擴(kuò)增示意圖見圖6，PEDV-S1-1→PEDV-S1-3。對(duì)分離的PEDV X-6/2021株S1-1/S1-2/S1-3基因片段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒定，結(jié)果顯示，出現(xiàn)與預(yù)期片段大小相符的條帶（圖7），將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

圖6 PEDV-S1-1/2/3引物擴(kuò)增示意

圖7 引物PEDV-S1-1/2/3擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

3.5 S1基因序列變異情況分析

根據(jù)序列測(cè)定結(jié)果，利用DNAStar軟件將S1-1～S1-3片段拼接成完整的S1基因，將所獲得的S1基因序列提交到NCBI進(jìn)行比對(duì)分析，選出有代表性的PEDV參考毒株的S1基因序列（表2），運(yùn)用DNAStar、MEGA等軟件進(jìn)行分析比較，構(gòu)建基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，對(duì)參考序列與目標(biāo)序列進(jìn)行核苷酸相似性比對(duì)及繪制進(jìn)化樹（圖8）。

圖8 S1基因序列構(gòu)建的基因進(jìn)化樹

由進(jìn)化樹結(jié)果可得到，所有PEDV毒株根據(jù)S1基因序列分為2大組即Ⅰ型和Ⅱ型。PEDV-X-6/2021毒株與Ⅰ型參考毒株的同源性為90.6%～93.2%，與Ⅱ型參考毒株的同源性為97.6%～99.0%，驗(yàn)證了我們此次試驗(yàn)分離的毒株為PEDV流行毒株。

4 結(jié)論與討論

PEDV首次在歐洲被報(bào)道[2]，產(chǎn)生與豬傳染性胃腸炎相似的臨床癥狀[9]。但近年在亞洲和北美的流行對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失遠(yuǎn)大于歐洲。亞洲如泰國(guó)、韓國(guó)、日本、越南與中國(guó)等國(guó)家[10-13]，因近年P(guān)EDV的流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。感染仔豬主要表現(xiàn)嘔吐腹瀉，腸道剖檢發(fā)現(xiàn)腫大透明，內(nèi)有未消化的乳凝塊，最終嚴(yán)重脫水而死，死亡率較高可達(dá)100%[2-4，10，14]。

雖然疫苗在PED的防控中發(fā)揮了重要的作用，但是越來(lái)越多的豬場(chǎng)在使用PEDV疫苗后PED仍然會(huì)發(fā)生和流行，這說(shuō)明PEDV在環(huán)境壓力下一直處于變異的狀態(tài)，這可能是導(dǎo)致近年P(guān)EDV的大規(guī)模暴發(fā)，而不能以疫苗接種等措施控制此病流行的主要原因。目前，對(duì)此病沒(méi)有有效的治療措施，所以在發(fā)生疾病的豬場(chǎng)中隔離感染、發(fā)病豬只，做好生物安全措施是目前最好的方法[15]。

本試驗(yàn)從四川某地采集了仔豬小腸進(jìn)行RTPCR鑒定，利用Vero細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，盲傳3代后出現(xiàn)細(xì)胞病變，而且隨著傳代次數(shù)的增加出現(xiàn)細(xì)胞病變的時(shí)間以及形態(tài)逐漸穩(wěn)定，通過(guò)RTPCR、間接免疫熒光鑒定、基因序列測(cè)定，證實(shí)分離到的病毒為PEDV，命名為X-6/2021株。對(duì)X-6/2021株S1基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得的分離株S1全基因與國(guó)內(nèi)外PEDV毒株進(jìn)行序列比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，PEDV-X-6/2021毒株與Ⅰ型參考毒株的同源性為90.6%～93.2%，與Ⅱ型參考毒株的同源性為97.6%～99.0%。顯示PEDV毒株一直處在不斷遺傳演化過(guò)程中，遺傳關(guān)系表明，PEDV-X-6/2021毒株與近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的毒株在同一分支上，均為流行毒株，即為Ⅱ型毒株。S1基因序列的不斷變化，勢(shì)必會(huì)影響S蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的重要能力，進(jìn)一步影響到現(xiàn)有PED疫苗的保護(hù)效果。現(xiàn)在的PEDV流行毒株與經(jīng)典毒株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，若還是用經(jīng)典株進(jìn)行免疫，有可能導(dǎo)致豬群免疫失敗。在近些年來(lái)，PEDV變異株也越來(lái)越引起大家的重視。