王福厚，葛生虎

（1.甘肅畜牧工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 武威 733006；2.河北銘諸生物科技有限公司，河北 邢臺 054000）

豬瘟（CSF）又稱為“豬霍亂”，是由豬瘟病毒（CSFV）感染所引起的一種高致死性傳染病[1]。CSFV的易感動物主要是家豬和野豬，豬群感染CSF后主要臨床癥狀包括高熱、精神沉郁、多器官出血等，且病死率高。目前該病是影響我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的主要傳染性疾病之一，同時也是豬場優(yōu)先凈化的病種[2]。

CSFV屬于單鏈RNA病毒，為黃病毒科重要成員，該病毒基因組約12.3 kb，主要包含1個大的開放閱讀框（ORF），編碼多聚蛋白；多聚蛋白可進一步水解為4種結(jié)構(gòu)蛋白和8種非結(jié)構(gòu)蛋白，其中結(jié)構(gòu)蛋白為C、E0、E1和E2；非結(jié)構(gòu)蛋白則為Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B[3]。根據(jù)NS5B或E2部分核苷酸序列差異，可將全世界流行的CSFV毒株分為3個基因型（1、2和3）共11個基因亞型（1.1～1.4、2.1～2.3、3.3～3.4）；其中2.1基因亞型可進一步分為2.1a、2.1b、2.1c和2.1d[4]。目前我國流行的CSFV毒株主要是2.1亞型，20世紀90年代以來國內(nèi)流行CSFV毒株以2.1b亞型為主，但近年來國內(nèi)部分地區(qū)也出現(xiàn)了2.1c或2.1d亞型[4]。

國內(nèi)豬場防控豬瘟主要依賴于接種豬瘟兔化弱毒疫苗或E2亞單位疫苗，其效果較好，但豬瘟在我國豬場尚未根除，各地仍零星暴發(fā)疫情，嚴重危害當?shù)仞B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。為初步了解近年來河北省豬瘟流行情況，筆者從河北邢臺及周邊地區(qū)豬場采集血清及組織樣品分別檢測CSFV抗體和核酸，同時分析部分陽性樣品CSFV基因型，旨在為該病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2020年1月至2021年12月從河北邢臺、保定、邯鄲、秦皇島、張家口和石家莊等地區(qū)豬場采集血液樣品和疑似感染CSF組織樣品分別為1 644份和306份。將血液樣品保存于凝血管內(nèi)，將組織樣品裝入潔凈封口袋內(nèi)，低溫送至河北銘諸生物科技有限公司，待檢。

1.2 血清樣品處理及CSFV抗體檢測

將凝血管中血清吸出至1.5 mL離心管內(nèi)，其后低速（3 000 r/min）離心10 min，取上清液置于新的離心管內(nèi)，標記相關(guān)信息后保存于-20 ℃，待檢。

使用豬瘟病毒（CSFV）ELISA抗體檢測試劑盒（韓國金諾產(chǎn)品）檢測血清中是否存在CSFV抗體，每次檢測均設(shè)置2個陽性對照和2個陰性對照，作為質(zhì)控組。ELISA檢測步驟和結(jié)果判定均嚴格按照試劑盒提供說明書進行。

1.3 組織樣品處理及CSFV核酸檢測

在超凈工作臺上取出組織樣品，用滅菌手術(shù)刀切取少量組織樣品入研缽內(nèi)，剪碎后加入少許生理鹽水，充分研磨。取200 μL上清液用于病毒DNA/RNA基因組提取（試劑盒購自于武漢科前生物股份有限公司），基因組提取步驟嚴格按照試劑盒提供說明書進行。

使用豬瘟病毒通用熒光定量RT-PCR試劑盒（湖南冠牧生物科技有限公司產(chǎn)品）檢測核酸樣品是否存在CSFV核酸。每次檢測均設(shè)置陽性和陰性對照，操作步驟和結(jié)果判定嚴格參考試劑盒說明書進行。

1.4 CSFV陽性樣品E2基因序列RT-PCR擴增、測序及分析

參考Yao等發(fā)表文章[4]中擴增CSFV毒株E2基因序列所用引物，將引物送至生工生物工程（上海）有限公司合成。取4份CSFV陽性且CT值均低于22的RNA樣品，用于CSFV E2基因序列RT-PCR擴增，其PCR體系與反應(yīng)條件與參考文獻[4]均一致。RT-PCR反應(yīng)結(jié)束后取少許產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果后將剩余陽性RT-PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司進行雙向測序。

在GenBank數(shù)據(jù)可中下載不同基因型CSFV毒株E2基因核苷酸序列，采用DNAstar軟件分析本試驗獲得的CSFV E2基因序列與不同基因型參考毒株對應(yīng)序列的同源性，以此初步分析本文獲得毒株的基因型及遺傳變異情況。

2 結(jié)果

2.1 血清CSFV抗體檢測結(jié)果

調(diào)查結(jié)果如表1所示，本試驗共采集血清樣品1 644份，共1 330份血清檢測為CSFV抗體陽性，平均陽性率為80.90%。進一步分析可知，2020年收集血清樣品CSFV抗體陽性率（76.33%）較2021年（85.13%）低；散養(yǎng)戶、中小型規(guī)模豬場和大型規(guī)模化豬場送檢樣品CSFV抗體陽性率分別為72.13%（264/366）、77.39%（534/690）和90.48%（532/588）。

表1 不同年份及不同養(yǎng)殖模式豬場血清CSFV抗體檢測結(jié)果

2.2 組織樣品CSFV核酸檢測結(jié)果

本試驗共收集306份疑似感染CSF豬的組織樣品，用于檢測CSFV核酸陽性率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共45份組織樣品為CSFV核酸陽性，平均檢出率為14.71%；其中2020年和2021年收集樣品CSFV檢出率分別為18.69%（20/107）和12.56%（25/199）。此外，該病在一年四季均可發(fā)生，其中春季、夏季、秋季和冬季送檢樣品CSFV核酸檢出率分別為11.29%（7/62）、14.89%（14/94）、12.50%（10/80）和20.00%（14/70）。詳見表2。

表2 不同年份及季節(jié)組織樣品CSFV核酸檢測結(jié)果

2.3 CSFV毒株E2基因RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

采用RT-PCR法檢測4份不同地區(qū)且CT相對較低CSFV陽性樣品的E2基因序列，并將RT-PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳。如圖1所示，4份樣品均擴增出約1 500 bp大小條帶，與預(yù)期片段大小一致，且陽性對照和陰性對照均成立。說明成功擴增出4份陽性樣品E2基因序列。

2.4 序列分析結(jié)果

4份樣品E2基因核苷酸序列長度一致，為1 491 bp，進一步的核苷酸序列同源性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2），4個樣品之間E2基因核苷酸序列均與GenBank收錄的豬瘟病毒2.1d亞型毒株同源性最高，為99.7%～99.8%，而與其它亞型毒株同源性相對較低。以上結(jié)果說明本試驗獲得的4個CSFV毒株均為2.1d亞型。

圖2 本試驗獲得4個陽性樣品E2基因核苷酸序列同源性對比結(jié)果

3 討論

近年來，非洲豬瘟在我國廣泛流行，為有效防控該病，養(yǎng)殖企業(yè)（戶）采取系列措施提高豬場生物安全水平，同時也積極開展傳染病凈化工作，其中包括偽狂犬病和CSF的凈化。盡管如此，CSFV仍然在我國部分地區(qū)流行，且近年來筆者在河北地區(qū)接觸到許多豬場暴發(fā)CSF的案例。為初步評估CSF在河北省流行情況，本研究從河北邢臺及周邊地區(qū)采集血清及組織樣品分別檢測CSF抗體和病原情況，以評估豬場CSF疫苗免疫效果和CSFV分子流行情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，被調(diào)查地區(qū)豬場血清CSF抗體陽性率為80.90%，已達到農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的70%以上水平，其中2020年和2021年采集抗體陽性率分別為76.33%和85.13%，說明養(yǎng)殖企業(yè)（戶）逐漸開始重視了CSF的疫苗免疫工作。盡管如此，本研究結(jié)果仍然低于張利平等（河南地區(qū)豬場）[5]和任昊（山西長子縣）[6]調(diào)查結(jié)果，張利平等[5]和任昊的調(diào)查結(jié)果分別為91.03%（639/702）和84.12%（3 719/4 421），這可能與采集樣品豬場類型、樣品數(shù)量和生豬生長階段等因素有關(guān)。

分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，被檢測的306份組織樣品中CSFV抗原檢出率為14.71%，且各被調(diào)查地區(qū)均有CSFV陽性豬場，說明該病原目前廣泛流行于河北各地區(qū)。此外，本研究結(jié)果低于張衛(wèi)兵調(diào)查山西地區(qū)結(jié)果[18.0%（45/250）][7]，但該地區(qū)豬群CSFV抗體陽性率超過85%，提示CSF的防控不能僅僅依賴于疫苗免疫，提高豬場生物安全水平也是十分必要的。進一步分析發(fā)現(xiàn)2021年采集組織樣品CSFV抗原陽性率低于2020年，說明近年來豬場已開始重視CSF的防控工作；但該病原在四季均可檢出，說明該病的發(fā)生無明顯的季節(jié)性，企業(yè)需持續(xù)關(guān)注CSF的防控與凈化工作。

為進一步分析河北省CSFV流行毒株的基因型，筆者采用RT-PCR法擴增并分析了4份陽性樣品E2基因序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4份陽性樣品E2基因核苷酸序列已知CSFV 2.1d亞型毒株對應(yīng)序列同源性最高，說明4個CSFV流行毒株均為2.1d亞型。由于本研究獲得毒株序列較少，僅能說明2.1d亞型CSFV毒株流行于河北省部分地區(qū)，但該毒株是否為主要基因型，或是否有其它基因亞型毒株也流行于河北省，還需要進一步調(diào)查。