羅同平，黃春東，張月雄，秦媛媛，岑貞陸，劉 馳，韋敏益，秦 鋼，馬增鳳，黃大輝

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所/廣西水稻遺傳育種重點實驗室/國家水稻改良中心南寧分中心，南寧 530007；2.玉林市農(nóng)業(yè)科學院/廣西農(nóng)業(yè)科學院桂東南分院，廣西 玉林 537000；3.廣西農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技信息研究所，南寧 530007；4.廣西農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，南寧 530007)

【研究意義】水稻白葉枯病由革蘭氏陰性菌黃單孢菌[Xanthomonasoryzaepv.oryza(Xoo)]引起，是水稻的重要細菌性病害，可造成高達50%的水稻產(chǎn)量損失[1-2]。細菌性條斑病(簡稱細條病)由革蘭氏陰性菌黃單孢菌[X.oryzaepv.oryzicola(Xoc)]引起，是屬于檢疫對象的細菌性病害，暴發(fā)時水稻產(chǎn)量損失高達40%。利用抗性基因培育抗性品種是防治白葉枯病和細條病最經(jīng)濟有效的途徑。我國白葉枯病抗性資源豐富，目前已從各類稻種資源中發(fā)現(xiàn)46個白葉枯病抗性基因[3]。細條病抗源在稻種資源中也較豐富，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包括qBlsr5a在內(nèi)的13個抗細條病QTLs，以及BLS1、bls2和Xo1等少數(shù)幾個主效抗病基因[4-7]。白葉枯病和細條病病原菌屬于黃單孢菌的2個變種，二者在形態(tài)特征、生物學特性及病害流行因素等方面均很相似。因此，篩選既抗白葉枯病又抗細條病的抗源，對豐富我國水稻育種遺傳基礎具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前發(fā)現(xiàn)的46個抗白葉枯病基因中已有16個主效基因獲得克隆[3]。與白葉枯病研究相比，僅有BLS1、bls2和Xo1等少數(shù)幾個主效抗細條病基因得到克隆和分子標記定位[4, 6-7]。其中，抗病基因bls2被精細定位在2號染色體上的RM13592和RM13599分子標記之間[4]；BLS1基因位于第6染色體，過表達BLS1或低表達其等位基因bls1，會減弱或增強水稻對條斑病細菌特定小種JZ-8的抗性，但過表達BLS1或低表達bls1基因都能提高水稻的非小種特異性廣譜抗性，說明BLS1和bls1基因對Xoc菌株JZ-8的小種特異性抗性具有負調控作用，而對廣譜抗性具有正調控作用和負調控作用[6]；Xo1是顯性抗細條病基因，被定位在第4染色體1.09 Mbp范圍內(nèi)[7]。科學家們一直在上述基因中發(fā)掘和利用既抗白葉枯病又抗細條病的基因。姬廣海和許志剛[8]、郭亞輝和許志剛[9]研究發(fā)現(xiàn)，在攜帶不同白葉枯病抗性基因的近等基因系中，xa5基因對白葉枯病和細條病均具有很強的抗性。基因克隆結果進一步說明，xa5(qBlsr5a)是兼抗白葉枯病和細條病的基因[5]。秦鋼等[10]從285份水稻材料中鑒定出9份兼抗白葉枯病和細條病的水稻資源，其中2份攜帶xa5基因。劉馳等[11]利用xa5基因培育出兼抗白葉枯病和細條病的多抗、優(yōu)質強恢復系桂恢663。xa5基因是隱性基因，可有效應用于常規(guī)水稻品種抗性改良，但用于雜交稻品種需同時改良多個親本的抗性，xa5基因的應用效果會受到限制[12]。不同遺傳背景能影響基因表達效果，因此也有研究認為xa5基因是部分顯性基因[13]，能有效應用于雜交稻抗性改良。目前水稻育種存在遺傳基礎狹窄及同質化嚴重問題，導致難以培育出具有突破性的新品種[14]。廣西普通野生稻具有豐富的遺傳多樣性，是水稻品種改良、培育新品種的重要基因源[15]，利用廣西普通野生稻已培育出桂99和測253兩個優(yōu)良恢復系[16-17]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，針對xa5基因應用于雜交稻抗性改良的可行性研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】利用攜帶xa5基因的廣西普通野生稻與感病親本雜交，選出后代優(yōu)良單株，再與優(yōu)良主栽水稻品種雜交，培育強優(yōu)勢恢復系，組配出含xa5基因的雜交組合，并對其抗性進行鑒定評價，為豐富我國水稻抗性育種的遺傳物質基礎及水稻白葉枯病和細條病的抗性改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

普通野生稻DP3(也稱PY3)、秈稻9311、不育系平豐A等供篩選xa5基因的102份水稻品種資源(材料)(包括廣恢998)均由廣西農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所抗性育種研究室收集提供。田間抗性鑒定接種所用菌株為華南秈稻區(qū)白葉枯強毒菌株(Ⅴ型)及抗性鑒定圃接種細條病菌株JZ-8(廣西優(yōu)勢Ⅱ致病型)，均由廣西農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗病基因xa5檢測 采用CTAB法[18]提取水稻葉片基因組DNA。根據(jù)Blair等xa5基因定位結果，結合IRGSP(2005)的SSR標記總表，選用與xa5緊密連鎖且多態(tài)性好的分子標記RM17743作為檢測標記。參考劉馳等[11]的方法進行抗病基因xa5的分子標記檢測。引物(RM17743F：5′-CCTTGCTAGATCTGACGGTTCTC-3′，RM17743R：5′-AGGACTCTCTGTCACCGCTTCG-3′)由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。PCR反應體系10.0 μL：1.0 μL DNA模板，0.8 μL引物，1.0 μL Buffer，0.2 μL dNTP(10 mmol/L)，0.1 μLTaq酶(5 U/L)，ddH2O2補足10.0 μL；擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR反應產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染顯色。

1.2.2 白葉枯病抗性鑒定 參照Kauffman等[19]的方法將培養(yǎng)的白葉枯病菌用無菌水稀釋為1×109CFU/mL，采用人工剪葉法于分蘗盛期接種，每株接種5張葉片，21 d后根據(jù)Gu 等[20]的調查標準調查病斑長度和抗性級別，其中，病斑長度≤3.0 cm為抗(R)，3.0 cm﹤病斑長度≤6.0 cm為中抗(MR)，6.0 cm﹤病斑長度≤9.0 cm為中感(MS)， 病斑長度﹥9.0 cm為感(S)。

1.2.3 細條病抗性鑒定 參考岑貞陸等[21]的針刺法在水稻分蘗期接種，接種20 d后參考農(nóng)秀美等[22]的方法，以病斑長度1.5 cm作為抗、感分界線，按照如下標準調查病情：免疫(I)，傷口無癥狀或僅有褐點；高抗(HR)，0.1 cm<病斑長度≤0.5 cm；抗(R)，0.5 cm<病斑長度≤1.0 cm；中抗(MR)，1.0 cm﹤病斑長度≤1.5 cm；感(S)，1.5 cm﹤病斑長度≤2.5 cm；高感(HS)，病斑長度﹥2.5 cm。

1.2.4 野栽型強恢復系選育 按照莫永生等[17]的方法，結合分子標記輔助選擇選育野栽型強恢復系。

1.3 統(tǒng)計分析

水稻產(chǎn)量及米質相關數(shù)據(jù)來源于廣西農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳官方網(wǎng)站-種子管理專欄的區(qū)試結果(http://nynct.gxzf.gov.cn/gxzyl)，采用Excel 2003進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 xa5基因檢測及抗性鑒定

利用與xa5基因緊密連鎖的分子標記RM17743對普通野生稻DP3、秈稻9311和不育系平豐A等102份材料進行檢測，其中，攜帶xa5基因的單株N36、廣恢998和DP3等能擴增出小于100 bp的特異片段；經(jīng)多次重復檢測，新B未能擴增出相應的特異片段(圖1)。由表1可知，從102份水稻材料中篩選出17份攜帶xa5基因的材料，分別為DP3、IRBB5、N36、廣恢998、N663、金香B、群B、N776、N777、N779、桂99、華秈粳、P89、白R54、白R55、白R56和五山絲苗，xa5基因在102份材料中出現(xiàn)頻率為16.7%。如表2所示，經(jīng)抗性鑒定，DP3、IRBB5、N36、N776、N777、N779和P89等7份材料對白葉枯病和細條病均表現(xiàn)為抗；廣恢998中抗細條病，感白葉枯?。还?9和華秈粳對白葉枯病和細條病均表現(xiàn)為感；其他材料對白葉枯病和細條病均表現(xiàn)為中抗以上抗性。7份兼抗白葉枯病和細條病水稻材料的獲得為培育抗白葉枯病兼抗細條病水稻品種提供了重要基因資源。

M：DL2000 Marker；1：金剛30；2：9311；3：平豐A；4：IRBB5(陽性對照)；5：金剛30(陰性對照)；6～32：其他材料(其中，13為新B，16為N36，25為廣恢998，26為DP3)；箭頭所指為DNA片段大小M：DL2000 Marker；1：Jingang 30；2：9311；3：Pingfeng A；4：IRBB5(positive control)；5：Jingang 30(negative control)；6-32：The other materials(including 13 of Xin B，16 of N36，25 of Guanghui 998 and 26 of DP3)；Arrow line indicated the size of DNA fragment圖1 xa5基因檢測Fig.1 Detection of xa5 gene

表1 102份水稻材料的xa5基因檢測

2.2 野栽型強恢復系野香占的選育過程

按照圖2所示開展野栽型強恢復系野香占選育：2008年早造，以分子標記檢測含有xa5基因并兼抗白葉枯病和細條病的普通野生稻DP3為父本，以9311為母本進行雜交獲得雜交種，晚造種植雜交種并獲得后代種子；2009年早造，大規(guī)模種植DP3×9311雜交組合的F2代植株2000株以上，結合分子標記選擇，從中篩選獲得農(nóng)藝性狀較優(yōu)良的單株Y240-1，晚造以該單株為父本，以綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的廣恢998為母本進行雜交，獲得雜交種；2010年早造種植Y240-1×廣恢998的F1群體，2010年晚造大規(guī)模種植F2群體(2000株以上)，通過分子標記選擇，從中選出優(yōu)良單株自交形成不同株系；2011年早造，從Y240-1×廣恢998的F3群體開始，通過系譜法，結合分子標記選擇，于2014年晚造篩選出攜帶純合型xa5基因的株系，包含N717、N776、N812和N918的4個優(yōu)良株系(圖3)；4個優(yōu)良株系繼續(xù)自交，并分別與平豐A、豐田1A和思豐A等不同不育系測交，經(jīng)過優(yōu)中選優(yōu)，至2017年晚造，篩選出雜種優(yōu)勢強、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的株系N776，并將該恢復系命名為野香占。野香占于2022年獲得植物新品種權。

圖2 野香占系譜圖Fig.1 Pedigree diagram of Yexiangzhan

M：DL2000 Marker；1：DP3；2：9311；3：平豐A；4：IRBB5(陽性對照)；5：金剛30(陰性對照)；6～32：后代材料[其中，23、24、25和26分別為攜帶純合型xa5基因的4個優(yōu)良株系 N717、N776(野香占)、N812和N918]；箭頭所指為DNA片段大小M：DL2000 Marker；1：DP3；2：9311；3：Pingfeng A；4：IRBB5(positive control)；5：Jingang 30(negative control)；6-32：The other materials[including 23(N717)，24(N776, Yexiangzhan)，25(N812) and 26(N918) indicated the 4 elite lines with homozygous of xa5]；Arrow line indicated the size of DNA fragment圖3 xa5基因分子標記輔助選擇檢測 Fig.3 Molecular marker-assisted selection of xa5 gene

2.3 野香占的抗性反應

以IRBB5為抗病對照，金剛30為感病對照，利用白葉枯華南秈稻區(qū)強毒菌株(Ⅴ型)和細條病廣西優(yōu)勢Ⅱ致病型菌株JZ-8對野香占、平豐A及野香占涉及的親本DP3、9311和廣恢998進行抗性鑒定。結果表明，攜帶純合型xa5基因的DP3、IRBB5和野香占對白葉枯病和細條病均表現(xiàn)兼抗；經(jīng)標記檢測，攜帶xa5基因的廣恢998感白葉枯病，中抗細條?。黄截SA、9311和感病對照金剛30抗性反應一致，均表現(xiàn)為感白葉枯病、高感細條病(表2)?？梢?，野栽型兼抗白葉枯病和細條病恢復系野香占的選育有利于拓寬水稻遺傳基礎。

表2 水稻材料的抗性級別和平均病斑長度比較

2.4 強優(yōu)勢組合平豐優(yōu)香占的評價

野香占與平豐A配制的感光雜交稻新組合平豐優(yōu)香占于2022年通過廣西壯族自治區(qū)農(nóng)作物品種審定委員會審定(審定編號：桂審稻2022036號)。該組合2020和2021兩年區(qū)試平均產(chǎn)量為493.96 kg/666.7 m2，比豐田優(yōu)553(CK)增產(chǎn)4.96%，全生育期平均為121.4 d，比豐田優(yōu)553(CK)長4.0 d；2021年多點生產(chǎn)試驗全生育期平均121.3 d，比豐田優(yōu)553(CK)長5.0 d，平均產(chǎn)量為477.18 kg/666.7 m2，比豐田優(yōu)553(CK)增產(chǎn)2.88%，增產(chǎn)點比例達75%，米質達部標2級優(yōu)質米標準。平豐優(yōu)香占的抗性表現(xiàn)：稻瘟病抗性綜合指數(shù)2020—2021年度分別為3.0和4.0，穗瘟損失率最高級3級；白葉枯病2020—2021年度分別為5級和3級；中抗稻瘟病、中感白葉枯病。為進一步科學評價攜帶xa5基因的野香占在白葉枯病和細條病抗性育種改良中的利用價值，以IRBB5為抗病對照，金剛30為感病對照，利用白葉枯華南秈稻區(qū)強毒菌株(Ⅴ型)和細條病廣西優(yōu)勢Ⅱ致病型菌株JZ-8對野香占、平豐A及二者的雜交組合平豐優(yōu)香占進行抗性鑒定。結果發(fā)現(xiàn)野香占的抗性反應與陽性對照IRBB5一致，二者對白葉枯病和細條病均表現(xiàn)為抗；平豐A的抗性反應與感病對照金剛30一致，均感白葉枯病、高感細條??；雜交組合平豐優(yōu)香占對白葉枯病和細條病均表現(xiàn)中抗(表3)。根據(jù)對抗性級別和病斑長度的分析結果，攜帶xa5基因的野香占能組配出抗性比感病親本得到明顯改良的雜交組合，說明xa5基因具有部分顯性效應，在雜交稻抗性改良中具有一定應用潛力。

表3 野香占、平豐A及其雜交組合平豐優(yōu)香占的抗性表現(xiàn)

3 討 論

目前發(fā)現(xiàn)的抗白葉枯病兼抗細條病基因為xa5，另一個可能是Xa17[8]。國內(nèi)抗病基因xa5的主要來源為IRBB5。王禎等[23]利用與xa5基因緊密連鎖的分子標記對103個雜交稻親本進行檢測，未發(fā)現(xiàn)攜帶xa5基因的親本。史波[24]對79份主栽水稻品種進行分析，也未發(fā)現(xiàn)攜帶xa5基因的水稻品種。秦鋼等[10]檢測9份兼抗白葉枯病和細條病的水稻材料，僅發(fā)現(xiàn)1份材料(L661)攜帶xa5基因。而L661的親本之一就是IRBB5，因此推測L661的xa5基因極可能來自IRBB5。夏志輝等[25]對9份普通野生稻材料進行分析，未發(fā)現(xiàn)攜帶xa5基因的材料。李定琴等[26]對普通野生稻、藥用野生稻和疣粒野生稻進行鑒定，也未發(fā)現(xiàn)攜帶xa5基因的野生稻。但隨著研究的深入，近兩年來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)除IRBB5外的一些xa5基因抗源，如楊雅云等[27]研究發(fā)現(xiàn)7個居群的云南藥用野生稻均含有xa5基因，宗凱等[28]在栽培稻和普通野生稻中檢測出xa5基因。本研究發(fā)現(xiàn)，普通野生稻DP3和栽培稻廣恢998均攜帶xa5基因，但進一步進行抗性鑒定發(fā)現(xiàn)廣恢998不抗白葉枯病，說明廣恢998不一定攜帶xa5基因，原因是本研究所用的分子標記RM17743與xa5基因編碼區(qū)有約80 kb的物理距離，因此檢測結果不夠精確，導致廣恢998可能的假陽性。為提高檢測結果的精確度，建議在以后的工作中開發(fā)應用簡便功能型分子標記。本研究獲得的攜帶xa5基因普通野生稻DP3有利于豐富該基因的遺傳基礎。

一般認為xa5基因是隱性基因，具有廣譜抗性，對白葉枯病大部分生理小種和細條病均具有抗性[8-9，29]。xa5基因在常規(guī)稻品種抗性改良中已得到有效利用，如成太輝等[30]研究報道利用來自IRBB5的xa5基因已育成白香占、白粳占和白絲占等抗白葉枯病常規(guī)水稻品種。關于xa5基因的顯性和隱性問題，Li等[13]研究認為，xa5基因是部分顯性或具有加性效應，曾列先等[31]利用高抗白葉枯病的IRBB5(攜帶xa5基因)與高感白葉枯病(9級)的五豐A、吉田A和金剛30雜交，所得相應F1植株的抗性(7級)均高于這3個高感白葉枯病親本，進一步說明xa5基因具有一定的加性效應。xa5基因部分顯性或具有加性效應暗示該基因在雜交水稻抗性育種改良中具有應用潛力，如劉馳等[11]利用分子標記輔助選擇培育出抗白葉枯病兼抗細條病的強恢復系桂恢663，本研究對包括野生稻在內(nèi)的102份水稻品種資源進行篩選，利用優(yōu)良親本進行雜交，再通過分子標記輔助選擇，也選育出攜帶xa5基因的野栽型抗白葉枯病兼抗細條病強恢復系野香占。野香占與平豐A所配制的雜交組合平豐優(yōu)香占中抗白葉枯病和細條病，病斑長度比感病親本平豐A明顯降低，而抗性水平比平豐A高1～2個級別，說明xa5基因具有部分顯性效應，可有效應用于雜交水稻的抗性改良育種。

遺傳基礎狹窄、品種間同質化嚴重及突破性新品種稀缺是目前水稻育種面臨的重要問題[12]。普通野生稻是亞洲栽培稻的祖先，保留其豐富的遺傳多樣性對充實水稻基因源庫、拓寬水稻遺傳基礎及進行現(xiàn)代水稻遺傳育種改良均具有極其重要的意義。廣西是普通野生稻分布點最多的省(區(qū))之一，具有遺傳多樣性豐富的普通野生稻，利用廣西普通野生稻已培育出一些突破性的優(yōu)良品種，如桂99和測253[16-17]。本研究以攜帶xa5基因的普通野生稻DP3為親本，通過雜交和分子標記輔助選擇，選育出含有四分之一普通野生稻血緣、兼抗白葉枯病和細條病的強恢復系野香占，野香占與感病不育系平豐A可組配出強優(yōu)勢組合平豐優(yōu)香占，該組合中抗白葉枯病和細條病，產(chǎn)量比豐田優(yōu)553增產(chǎn)4.96%，米質達到部標二級優(yōu)質米標準。

4 結 論

xa5基因具有部分顯性效應，可用于雜交水稻育種改良；培育出含有野生稻血緣的野香占能組配出強優(yōu)勢水稻雜交組合，中抗白葉枯病和細條病，有助于豐富和拓寬水稻育種遺傳基礎。