韋云芳，李飛翔，星 云，李居?xùn)|，萬九生，陳方良，陳 超

(1. 公安部昆明警犬基地，昆明 650204；2. 警犬技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650204；3. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動科學(xué)院，昆明 650201)

【研究意義】昆明犬是中國唯一一個國產(chǎn)工作犬品種，經(jīng)過半個多世紀(jì)的培育，于2007年審定成為犬類國家級畜禽新品種。作為中國寶貴的工作犬犬業(yè)種質(zhì)資源，昆明犬在軍警工作犬領(lǐng)域具備極為廣泛的應(yīng)用并形成了較大的影響力，成為了中國警犬的驕傲。近年來，隨著現(xiàn)代分子育種技術(shù)的不斷發(fā)展與進(jìn)步，探明昆明犬生長發(fā)育遺傳變異機(jī)理進(jìn)而應(yīng)用分子育種技術(shù)進(jìn)一步改良提高其生長發(fā)育性能也一直是繁育工作者所追求的目標(biāo)。胰島素樣生長因子受體(Insuline-like growth factor 1 receptor,IGF1R)是一種細(xì)胞表面跨膜受體，屬于酪氨酸激酶受體超家族，其結(jié)構(gòu)與胰島素受體非常相似，在胰島素樣生長因子(IGFs)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用[1]。因此，探究昆明犬IGF1R基因序列結(jié)構(gòu)特征及其組織表達(dá)模式，為探究IGF1R基因在昆明犬上生長發(fā)育的調(diào)控機(jī)制及分子遺傳育種的相關(guān)研究提供參考依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】IGF1R是IGFs家族中兩類生長因子IGF1和IGF2的主要結(jié)合受體，IGF1和IGF2通過與IGF1R結(jié)合來啟動胞內(nèi)相關(guān)信號的級聯(lián)反應(yīng)，從而參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生理代謝過程，在胚胎和出生后機(jī)體生長發(fā)育調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，IGF1基因突變會導(dǎo)致動物胚胎生長不足及生長發(fā)育遲緩等，表現(xiàn)為侏儒癥[4-5]。IGF2基因的功能性失活也會導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯或生長遲緩[6]。IGF1R缺乏會導(dǎo)致人和小鼠生長發(fā)育受阻、體型重量減小[7-9]，而過表達(dá)則可能導(dǎo)致細(xì)胞的腫瘤轉(zhuǎn)化[10]。針對家犬的研究發(fā)現(xiàn)，IGF1通路在控制犬體型大小上發(fā)揮著關(guān)鍵作用，攜帶IGF1基因突變的犬體型較小，其體內(nèi)的IGF1激素水平也顯著降低[11]。另外，研究者還發(fā)現(xiàn)在很多迷你型犬類身上同時存在IGF1R基因的突變[12]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】犬IGF1R基因位于3號染色體，基因全長361 103 bp，由21個外顯子構(gòu)成(CanFam3.1, GCF_000002285.3)。盡管IGF1R作為調(diào)控動物生長發(fā)育的候選基因已在諸多動物中被克隆，然而目前尚未發(fā)現(xiàn)昆明犬有關(guān)IGF1R基因克隆及表達(dá)的研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】作為對犬生長發(fā)育性狀有調(diào)控作用的重要因子，分析IGF1R基因結(jié)構(gòu)功能并闡明其表達(dá)規(guī)律，在犬類的遺傳繁育和品種改良中具有重要意義。文章以昆明犬為研究對象，首次克隆獲得了昆明犬IGF1R基因編碼區(qū)序列，并對其結(jié)構(gòu)、表達(dá)水平及編碼蛋白功能進(jìn)行了初探，這些基本數(shù)據(jù)將有利于后續(xù)進(jìn)一步對犬生長發(fā)育相關(guān)研究的開展與探索。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試的3頭動物選自公安部昆明警犬基地，為2.5月齡體況良好幼犬。犬只麻醉后立即取其心、肝、脾、肺、腎、肌肉組織于液氮凍存。主要試劑為TRIzol RNA分離試劑(美國Invitrogen公司生產(chǎn))；Taq酶、dNTP及Buffer等開展PCR實(shí)驗(yàn)的試劑(上海生工生物股份有限公司生產(chǎn))；pMD18-T載體、E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞等分子克隆相關(guān)試劑(TaKaRa公司生產(chǎn))；反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR相關(guān)試劑(南京諾唯贊生物科技股份有限公司生產(chǎn))。

1.2 引物設(shè)計與合成

以NCBI中公布的家犬IGF1R基因序列(XM_545828.6)為參考序列，利用Primer 5.0設(shè)計引物?；贗GF1R基因CDS區(qū)較長，分成5個片段依次進(jìn)行引物設(shè)計。另外，以GAPDH基因(NM_001003142.2)為內(nèi)參基因，設(shè)計qRT-PCR引物，引物均由上海生工生物公司合成，引物相關(guān)信息見表1。

表1 引物信息

1.3 總RNA提取及cDNA合成

上述昆明犬6種組織樣本的總RNA按照TRIzol RNA分離試劑說明書中的步驟進(jìn)行提取，獲得的RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測后，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。以RNA為模板，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明合成cDNA。

1.4 CDS擴(kuò)增、克隆與測序

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA作模板來開展昆明犬IGF1R編碼的CDS序列的擴(kuò)增，PCR體系(總25 μL)：含12.5 μL PCR Buffer(2×)，0.2 μL dNTP(10 mmol/L)，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，1 μL反轉(zhuǎn)錄所得cDNA(100 ng/μL)，0.2 μLTaq酶(5 U/μL)，最后加DNase-free ddH2O 10.1 μL。開展擴(kuò)增的程序?yàn)轭A(yù)變性(95 ℃) 3 min；變性(94 ℃)30 s，分別依據(jù)表1中各引物的退火溫度退火30 s，延伸(72 ℃) 40 s，共32個循環(huán)；后延伸(72 ℃) 5 min；最終4 ℃保存。采用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，正確條帶通過2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行切膠回收，并與pMD18-T克隆載體進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，鑒定后選擇陽性單克隆進(jìn)行測序。

1.5 生物信息學(xué)分析

使用DNAStar比對IGF1R基因核苷酸序列同源性并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。家犬(Canislupusfamiliaris，XM_038661228.1)、赤狐(Vulpesvulpes，XM_026001628.1)、牛(Bostaurus，NM_001244612.1)、小鼠(Musmusculus，NM_010513.2)、雞(Gallusgallus，NM_205032.3)、羊(Ovisaries，XM_027957015.2)、豬(Susscrofa，NM_214172.1)及貓(Feliscatus，XM_023254966.1)的序列來源于NCBI數(shù)據(jù)庫。參照文獻(xiàn)中的方法來進(jìn)行該基因所編碼蛋白的理化參數(shù)、細(xì)胞定位及結(jié)構(gòu)特征等的分析[13]。

1.6 昆明犬IGF1R基因表達(dá)檢測

通過qRT-PCR方法檢測IGF1R基因在2.5月齡昆明犬心、肝、脾、肺、腎及肌肉共6種組織中的表達(dá)量，用內(nèi)參基因GAPDH對昆明犬不同組織的表達(dá)水平進(jìn)行定量結(jié)果分析，每個樣品平行測定3次。20 μL反應(yīng)體系，加入2.0 μL cDNA模板，各0.4 μL的上、下游引物(5 μmol/L)，10 μL PCR Master Mix(2×)，0.4 μL Rox Reference Dye(50×)，RNase-free H2O補(bǔ)足剩余體系。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法來處理數(shù)據(jù)，通過單因素方差分析結(jié)果的差異性，差異性顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05，極顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)為P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 IGF1R基因分段克隆與測序

以cDNA為模板進(jìn)行PCR，得到昆明犬IGF1R基因CDS區(qū)各片段，擴(kuò)增產(chǎn)物長度分別約889、900、925、925、695 bp(圖1)。通過測序分析得到4104 bp CDS序列，編碼1367個氨基酸。

M：DL2000 DNA Marker；1～5：PCR擴(kuò)增的IGF1R基因CDS區(qū)各片段M：DL2000 DNA Marker; 1-5：PCR amplified fragments of CDS region of IGF1R gene圖1 昆明犬IGF1R基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification products of IGF1R gene in Kunming dogs

2.2 GF1R基因同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

把昆明犬IGF1R基因序列與家犬、赤狐、貓等8個物種的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析顯示，昆明犬IGF1R基因核苷酸序列與家犬的同源性為100%，與同為犬科動物赤狐的同源性也較高(99.3%)，而與雞的同源性較低(78.8%，圖2)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)顯示，昆明犬與家犬聚為一枝，與赤狐聚為一類，與雞相距最遠(yuǎn)，親緣關(guān)系也較遠(yuǎn)，從而直觀地展示出不同動物間進(jìn)化關(guān)系的差異，符合動物實(shí)際進(jìn)化歷程。

圖2 不同物種IGF1R序列比對Fig.2 Alignment of IGF1R nucleotide sequences in different species

圖3 昆明犬與其它動物IGF1R基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of IGF1R gene in Kunming dog and other animals

2.3 昆明犬IGF1R蛋白結(jié)構(gòu)和功能分析

2.3.1 理化性質(zhì)和疏水性 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)由組成它的氨基酸所決定，昆明犬IGF1R蛋白氨基酸組成分析表明，IGF1R蛋白分別具有149個帶正電荷(Arg+Lys)和175個帶負(fù)電荷的殘基數(shù)(Asp+Glu)(表2)，推測IGF1R蛋白可能帶負(fù)電。理化性質(zhì)分析表明其理論等電點(diǎn)為5.58(表3)，分子質(zhì)量為154 890.07 ku，屬不穩(wěn)定的親水性蛋白。蛋白疏水性分析(圖4)再次證實(shí)昆明犬IGF1R屬親水性蛋白(親水性殘基數(shù)高于疏水性殘基數(shù))，最大疏水值(3.189)位于第944位氨基酸處，最小疏水值(-3.567)位于第737位氨基酸處。

表2 昆明犬的IGF1R氨基酸

表3 昆明犬IGF1R蛋白理化性質(zhì)

圖4 昆明犬IGF1R疏水結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction of hydrophobic structure of IGF1R in Kunming dogs

2.3.2 IGFIR蛋白跨膜區(qū)、信號肽預(yù)測與亞細(xì)胞定位分析 SignalP-5.0在線分析顯示,該蛋白信號肽剪切位點(diǎn)在第30～31位氨基酸間，概率為0.9378，表明其屬分泌型蛋白(圖5)。利用TMHMM-2.0分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白存在1個跨膜結(jié)構(gòu)，位置處于第936～958位氨基酸間，前935位氨基酸處于膜外，第959～1367位氨基酸處于膜內(nèi)(圖6)，說明昆明犬IGF1R屬跨膜蛋白，與跨膜運(yùn)輸調(diào)節(jié)有關(guān)。通過軟件PSORT分析發(fā)現(xiàn)，昆明犬IGFIR定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體及質(zhì)膜上，三者比例均為33.3%，說明昆明犬IGF1R蛋白非常均勻地分布于這3個膜結(jié)構(gòu)細(xì)胞器中，可能在跨膜信號識別中起重要作用。

圖5 昆明犬IGF1R蛋白的信號肽剪切位點(diǎn)預(yù)測Fig.5 Prediction of signal peptide cleavage sites of IGF1R protein in Kunming dogs

圖6 昆明犬IGF1R蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Transmembrane structure prediction of IGF1R protein in Kunming dogs

2.3.3 磷酸化位點(diǎn)預(yù)測 利用在線軟件NetPhos 3.1預(yù)測發(fā)現(xiàn)，昆明犬IGF1R蛋白含123個磷酸化位點(diǎn)(圖7)，分別為絲氨酸(Ser)63個、蘇氨酸(Thr)38個，酪氨酸(Tyr)22個，這些位點(diǎn)為蛋白發(fā)生磷酸化作用的潛在位點(diǎn)。

圖7 昆明犬IGF1R磷酸化潛能分析Fig.7 Analysis of phosphorylation potential of IGF1R in Kunming dogs

2.3.4 蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測 昆明犬IGF1R蛋白二級結(jié)構(gòu)的分析由在線軟件SOPMA完成，結(jié)果顯示該蛋白無規(guī)則卷曲(48.43%)和α-螺旋(25.24%)占比較多，其次是延伸鏈，占20.99%，β-轉(zhuǎn)角占5.34%(圖8)。SMART分析表明，昆明犬IGF1R具有IGF受體蛋白特征性結(jié)構(gòu)域(圖9)，包括1個半胱氨酸富集區(qū)(FU, 227～270)，3個纖連蛋白型結(jié)構(gòu)域(FN3, 489～914)，1個跨膜區(qū)(936～958)和1個酪氨酸蛋白激酶區(qū)(Tyrkc, 999～1266)。使用SWISS-MODEL預(yù)測的該蛋白三級結(jié)構(gòu)見圖10，該蛋白預(yù)測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符，蛋白結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲和α-螺旋組成。

最長豎線：α-螺旋；次長豎線：延伸鏈；次短豎線：β-轉(zhuǎn)角；最短豎線：無規(guī)則卷曲The longest vertical line: Alpha helix; The second-long vertical line: Extended chain; The secondary short vertical line: Beta turn; The shortest vertical line: Random coil圖8 IGF1R二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.8 IGF1R secondary structure prediction

圖9 昆明犬IGF1R蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.9 Functional domain prediction of IGF1R protein in Kunming dogs

圖10 IGF1R三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.10 Predicted tertiary structure of Kunming dog IGF1R protein

2.4 IGF1R基因在昆明犬組織中的表達(dá)模式分析

IGF1R基因在昆明犬6種組織(心、肝、脾、肺、腎和肌肉)中的相對表達(dá)量具有明顯差異(圖11)，以肺臟為參照，雖然該基因在昆明犬不同組織中均有表達(dá)，但其在肝臟中的表達(dá)量最低(P<0.01)，在肌肉中也呈較低表達(dá)水平(P<0.01)，在脾臟中則呈低表達(dá)水平(P<0.01)，而在腎臟和心臟中呈高表達(dá)水平，且無顯著差異(P>0.05)。

**表示差異極顯著(P<0.01)** mean extremely significant difference (P<0.01)圖11 昆明犬6種組織中IGF1R基因的相對表達(dá)量Fig.11 Relative expression levels of IGF1R gene in six tissues of Kunming dogs

3 討 論

IGF1R是調(diào)節(jié)生長軸激素受體級聯(lián)反應(yīng)的效應(yīng)分子，是IGF1和IGF2發(fā)揮功能的關(guān)鍵受體，其作為GH-IGFs軸信號傳導(dǎo)的主要介導(dǎo)者，在機(jī)體新陳代謝的多種生物過程中發(fā)揮重要作用[14-15]。例如，敲除IGF1R基因會導(dǎo)致小鼠胚胎時期肌肉發(fā)育不足或發(fā)生死亡[7]，肝組織再生能力下降、肺部發(fā)育出現(xiàn)異常[2,16]，相反，肌肉中IGF1R的過表達(dá)則出現(xiàn)肌肉發(fā)育過度、異常肥大[7]。有研究認(rèn)為，IGF1R基因結(jié)構(gòu)的變異、轉(zhuǎn)錄和翻譯效率的降低可能是導(dǎo)致機(jī)體矮小的原因[17]，例如在小鼠和人上都已證實(shí)IGF1R基因突變會導(dǎo)致個體體型減小或重量降低及生長發(fā)育遲緩受阻[7,9]。目前，豬[18]、牛[19]、羊[20]、禽類[21]及水產(chǎn)動物[22]的IGF1R基因研究相對較多，而對于犬的IGF1R基因結(jié)構(gòu)功能分析及表達(dá)模式的研究尚未見報道。

本研究克隆獲得昆明犬IGF1R基因完整CDS序列4104 bp，編碼1367個氨基酸。昆明犬IGF1R基因核苷酸序列與其它動物的同源性比對發(fā)現(xiàn)，其核苷酸序列與家犬同源性為100%，與同為犬科動物赤狐的同源性高達(dá)99.3%，初步說明IGF1R基因進(jìn)化在犬科動物中是相當(dāng)保守的。序列同源性在一定程度上反映了物種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，本實(shí)驗(yàn)中IGF1R基因序列同源性分析結(jié)果與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果一致。同時，昆明犬IGF1R基因序列與其他哺乳動物如與貓、豬也具有較高的同源性(分別為94.3%、91.7%)，而與禽類雞的同源性較低(78.8%)，存在較大差異，說明其與哺乳動物的關(guān)系較禽類距離更近、保守性更高，推測該基因在哺乳動物應(yīng)具備相似功能。IGF1R基因核苷酸序列在昆明犬與其它動物的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與它們的分類學(xué)的地位、物種進(jìn)化的結(jié)果相一致。磷酸化潛能的預(yù)測分析顯示，該基因編碼的蛋白質(zhì)具備潛在的123個磷酸化位點(diǎn)，這些不同的位點(diǎn)發(fā)生磷酸化作用后，將可能引發(fā)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域裝配信號的改變，從而使多種途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞活動產(chǎn)生變化[23]。IGF1R蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，約400個氨基酸組成了昆明犬IGF1R的3個Ⅲ型纖連蛋白(FN3)結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域會有DNA、肝素等物質(zhì)在此結(jié)合[24]；1個富含半胱氨酸的FU代表furin-like結(jié)構(gòu)域可與配體結(jié)合，導(dǎo)致酪氨酸殘基產(chǎn)生自身磷酸化，進(jìn)而激活胞內(nèi)MAPK、P13K-KT等信號通路的傳導(dǎo)，由此調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡等[25]；位于936～958氨基酸位置的跨膜區(qū)證實(shí)IGF1R屬跨膜蛋白受體；酪氨酸激酶(TyrKc)結(jié)構(gòu)域具備多種結(jié)合位點(diǎn)，可促發(fā)胞內(nèi)發(fā)生多種催化反應(yīng)[22, 26]。研究發(fā)現(xiàn)，不同品種的豬、綿羊IGF1R基因上存在大量的SNPs，其中部分突變會導(dǎo)致IGF1R蛋白構(gòu)象的改變和表達(dá)的差異，進(jìn)而對機(jī)體的生長性狀產(chǎn)生顯著影響，或造成品種體型上差異較大[27-28]。奶牛上的研究同樣發(fā)現(xiàn)IGF1R基因遺傳變異與產(chǎn)奶量、乳脂及乳蛋白性狀顯著相關(guān)，有望作為奶牛基因選育的分子標(biāo)記[29]。

本研究對昆明犬IGF1R基因在多種組織中的表達(dá)模式進(jìn)行了初探，結(jié)果顯示該基因在多種重要器官組織中均有表達(dá)，IGF1R的廣泛分布提示IGFs的功能除了通過內(nèi)分泌途徑實(shí)現(xiàn)，還有自分泌或旁分泌途徑；同時IGF1R高度富集于2.5月齡昆明犬心臟、肺臟及腎臟組織，提示IGF1R在幼犬的主要臟器生長發(fā)育中起重要作用。IGF1R在肺中高度富集，但在肝中的表達(dá)水平極低，這與南江黃羊的研究結(jié)果存在相似性[20]，而IGF1R在心臟和腎臟的高表達(dá)結(jié)果又與大花白及長大二元雜豬的表達(dá)模式相一致[30]。IGF1R基因在昆明犬不同組織的表達(dá)特征，例如在心臟、肺臟及腎臟中的相對高表達(dá)、肝組織中的相對低表達(dá)，可能提示其對重要器官的生長發(fā)育及功能的維持具有重要意義。

4 結(jié) 論

本研究首次克隆了昆明犬IGF1R基因CDS區(qū)全長序列，分析了其組織表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，IGF1R基因編碼區(qū)序列在生物進(jìn)化過程中具有較強(qiáng)的保守性。昆明犬IGF1R蛋白包含3個纖連蛋白型結(jié)構(gòu)域，1個半胱氨酸富集區(qū)和1個酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，屬親水性跨膜蛋白，其均勻地分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體及質(zhì)膜上這3個膜結(jié)構(gòu)細(xì)胞器中。IGF1R基因在昆明犬6個組織中均有表達(dá)，其中心臟、肺臟及腎臟組織中的表達(dá)量較高。IGF1R是一類重要的生長調(diào)控因子，本研究對昆明犬IGF1R的克隆、序列和組織表達(dá)分析進(jìn)一步深化對犬類IGFs受體分子的認(rèn)識，也為昆明犬生長性狀分子標(biāo)記輔助育種的研究提供參考。