劉威，董浩，曾曉房，白衛(wèi)東，于立梅*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣州 510225；2.廣東省嶺南特色食品科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510225；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部嶺南特色食品綠色加工與智能制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510225)

醬油是起源于我國(guó)的一種傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品，在日常烹飪中發(fā)揮著調(diào)味、調(diào)色、增鮮、增香的重要作用。醬油是利用發(fā)酵微生物將高蛋白質(zhì)的植物性原料(豆類，以黃豆為主)分解為眾多的氨基酸、有機(jī)酸等物質(zhì)，再經(jīng)過復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)和各類代謝途徑形成的具有豐富營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和獨(dú)特風(fēng)味的調(diào)味液。

由于微生物和非生物化學(xué)反應(yīng)，醬油釀造過程中會(huì)出現(xiàn)氨基酸脫羧或醛轉(zhuǎn)氨現(xiàn)象，產(chǎn)生不良化合物生物胺(biogenic amines， BAs)。BAs具有生物活性，與人體健康息息相關(guān)。攝入含有高濃度BAs的食物可能會(huì)對(duì)人體造成不良毒理學(xué)影響甚至產(chǎn)生癌細(xì)胞[1]。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)醬油的研究主要集中在醬油BAs的檢測(cè)[2-4]、調(diào)控[5-6]以及品質(zhì)[7]等方面。本文對(duì)BAs的產(chǎn)生機(jī)理、生成因素、調(diào)控方法進(jìn)行系統(tǒng)的歸納總結(jié)，旨在為科學(xué)生產(chǎn)醬油、減少醬油中BAs的生成、調(diào)控等提供參考。

1 醬油中生物胺的形成機(jī)制

BAs是在食品長(zhǎng)期發(fā)酵中產(chǎn)生的低分子量含氮有機(jī)化學(xué)物質(zhì)。醬油發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)在曲霉等微生物的作用下被分解為游離氨基酸和小分子肽，同時(shí)代謝出氨基酸脫羧酶氨，使氨基酸發(fā)生脫羧反應(yīng)，導(dǎo)致BAs的產(chǎn)生。因此，在BAs形成過程中，以下因素發(fā)揮作用：微生物——分泌促使氨基酸脫羧的酶；前體物質(zhì)——原料中蛋白質(zhì)被分解后的游離氨基酸；環(huán)境需求——滿足微生物生長(zhǎng)、脫羧酶活性以及脫羧反應(yīng)的條件。生物胺的合成有兩種途徑：一是氨基酸的脫羧作用，包括丙酮?；鶊F(tuán)脫羧機(jī)制和磷酸吡哆醛脫羧機(jī)制；二是酮和醛的轉(zhuǎn)氨和胺化作用。

1.1 醬油中BAs種類

各種發(fā)酵醬油中BAs的類型和含量并不一致，其中酪胺是醬油中含量最豐富的BAs，醬油中常見的BAs見表1。按照不同的分類標(biāo)準(zhǔn)，BAs有不同的分類，BAs的分類見表2。BAs作為食品被吸收進(jìn)人體后，不同的BAs發(fā)揮著不同的生理作用。

表1 醬油中8種生物胺基本信息Table 1 Basic information of eight biogenic amines in soy sauce

表2 生物胺的分類Table 2 Classification of biogenic amines

1.2 醬油中產(chǎn)生BAs的微生物

動(dòng)植物原料的使用是食品含有一部分BAs的原因，而微生物的合成作用則是BAs來源的重要原因。醬油的釀造就是微生物將固態(tài)蛋白質(zhì)原料轉(zhuǎn)變?yōu)橐簯B(tài)調(diào)味料的一個(gè)過程，微生物的存在決定醬油的形成。霉菌、細(xì)菌和酵母菌與BAs形成密切相關(guān)，但是并非所有微生物都能促進(jìn)BAs的形成，大部分微生物缺乏分泌氨基酸脫羧酶的能力。李巧玉[8]對(duì)高鹽稀態(tài)醬油醬醪中的魏斯氏菌進(jìn)行分離，得到3種菌——融合魏斯氏菌、類腸膜魏斯氏菌和食竇魏斯氏菌，發(fā)現(xiàn)大部分魏斯氏菌缺乏合成BAs的能力，僅僅個(gè)別類腸膜魏斯氏菌能夠產(chǎn)生多種BAs。日本學(xué)者Ibe發(fā)現(xiàn)組胺是由Lactobacillussp.產(chǎn)生的，而酪胺是由Enterococcusfaecium產(chǎn)生的，產(chǎn)生酪氨的菌株是一種革蘭氏陽性球菌，并被鑒定為腸球菌[9-10]。Li等[11]的研究結(jié)果表明，BAs產(chǎn)生的關(guān)鍵在醬油制曲和發(fā)酵階段。在醬油前期發(fā)酵有賴于霉菌，在醬油發(fā)酵后期得益于乳酸菌和酵母菌。微生物菌種由于所產(chǎn)生的脫羧酶種類、數(shù)量、質(zhì)量的差異，最終造成BAs的差異。在發(fā)酵過程中微生物菌群的變化也牽動(dòng)著生物胺的變化，兩者相互關(guān)聯(lián)、密不可分。

2 影響生物胺形成的因素

2.1 原料

原料是影響B(tài)As形成的一個(gè)基本因素。原料產(chǎn)地、種類、數(shù)量、質(zhì)量等方面存在差異，為醬油中BAs的差異創(chuàng)造了條件。原料對(duì)BAs形成的影響主要包括以下幾個(gè)方面：第一，原料本身存在BAs，作為底物和反應(yīng)的場(chǎng)所，參與其生成。Nout等[12]明確了原料中大豆的種類和比例影響發(fā)酵豆制品中BAs的含量。曹忠娜[13]發(fā)現(xiàn)，與豆粕相比，黃豆可減少BAs的生成；第二，不同的原料因其營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成不同，適合不同的菌群生存，形成不同的微生物群體，最終形成不同的BAs；第三，具有氨基酸脫羧酶活性的假單胞菌、腸球菌、腸桿菌等細(xì)菌會(huì)污染處理前的原料，增加BAs生成幾率。在發(fā)酵過程中，在這些細(xì)菌死亡后仍伴隨氨基酸脫羧酶活性，從而無法阻止BAs在發(fā)酵食品生產(chǎn)、貯存過程中的不斷累積[14]。因此，對(duì)釀造醬油的原料進(jìn)行加工工藝和衛(wèi)生管理把控，實(shí)行危害分析與關(guān)鍵控制點(diǎn)(HACCP)有利于降低BAs，減少BAs的生成。

2.2 鹽含量

食鹽對(duì)BAs的形成有雙重效果：一方面，食鹽的高滲透壓能阻礙產(chǎn)胺微生物的生長(zhǎng)、繁殖；另一方面，影響細(xì)菌細(xì)胞膜上氨基酸脫羧酶的活性，導(dǎo)致其脫羧能力下降，從而降低發(fā)酵制品中BAs的積累。Kim等[15]發(fā)現(xiàn)隨著食鹽濃度的增加，BAs的含量隨之減少。也有研究發(fā)現(xiàn)，高鹽稀態(tài)醬油中將鹽含量提高至20%，可有效降低BAs的產(chǎn)生。但為了保證傳統(tǒng)醬油正常的咸度和風(fēng)味，一般將鹽含量控制在16%～18%。其次，并不是鹽含量越高，BAs的含量就越低，兩者也不是負(fù)相關(guān)關(guān)系。因?yàn)樵诟啕}濃度下耐鹽微生物的氨基酸脫羧酶活性反而得以增強(qiáng)，有利于BAs的增加。鹽對(duì)于BAs產(chǎn)生促進(jìn)作用還是抑制作用，取決于菌種對(duì)鹽的耐受程度。袁樹昆[16]采用較高鹽濃度生產(chǎn)魚醬油，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群落與低鹽度相比沒有明顯差異，優(yōu)勢(shì)菌屬?zèng)]有明顯的變化。劉蕊[17]應(yīng)用新型低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝釀造醬油，減少了發(fā)酵使用鹽量，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵組的8種BAs總量均不超過250 mg/mL,保證了醬油的品質(zhì)安全。因此，鹽度的高低對(duì)于BAs含量的影響也是復(fù)雜的。

2.3 pH

pH是微生物生長(zhǎng)和氨基酸脫羧酶活性的關(guān)鍵因素。有報(bào)道表明，pH值在3.0～6.0范圍內(nèi)細(xì)菌最適宜產(chǎn)生脫羧酶[18]，脫羧酶活力在pH 為4.0～5.5之間最高。pH的降低一方面抑制微生物的生長(zhǎng)，降低BAs的生成；另一方面增加氨基酸脫羧酶的生成量和增強(qiáng)其活性，促進(jìn)BAs形成[19]。原因在于，在低pH環(huán)境下，為了抵抗外部酸度環(huán)境，細(xì)菌產(chǎn)生更多的BAs。在醬油初始發(fā)酵階段，發(fā)酵液的pH約為6.5，耐酸微生物占優(yōu)勢(shì)，代謝能力增強(qiáng)，氨基酸脫羧酶活性提升，促使大量游離氨基酸釋放出來，為BAs的形成提供了條件[20]。因此，在pH影響下，微生物與脫羧酶相互作用貫穿醬油整個(gè)發(fā)酵過程，最終決定BAs的含量。

2.4 溫度

溫度對(duì)醬油中微生代謝物和酶活性都有影響。大部分微生物、蛋白水解酶以及氨基酸脫羧酶在低溫(≤5 ℃)或高溫(≥40 ℃)條件下都難以正?；顒?dòng)，因此BAs的合成受到影響；而在20～37 ℃溫度條件下則有利于BAs的積累。 Eleonora等[21]發(fā)現(xiàn)在30～37 ℃酪氨酸脫羧酶脫羧力度最強(qiáng)。目前釀造醬油的兩種發(fā)酵方式中，低鹽固態(tài)釀造采取的發(fā)酵溫度≥35 ℃，而高鹽稀態(tài)釀造選擇的發(fā)酵溫度一般在28～30 ℃之間。研究表明，高溫條件有利于增加BAs的生成[22]。目前醬油的釀造主要采取高鹽稀態(tài)發(fā)酵方式，如何在保證醬油風(fēng)味和品質(zhì)的前提下，致力于低溫發(fā)酵醬油生產(chǎn)和改善低鹽固態(tài)發(fā)酵中存在的問題是未來醬油研發(fā)的方向。

3 醬油中生物胺的調(diào)控措施

根據(jù)影響B(tài)As形成的途徑可以從游離氨基酸、微生物、氨基酸脫羧酶活性以及降解菌4個(gè)方面對(duì)BAs進(jìn)行控制。

3.1 控制醬油中游離氨基酸的含量

游離氨基酸是BAs的來源之一，也是重要的限制因子。游離氨基酸被氨基酸脫羧酶作用發(fā)生脫羧反應(yīng)產(chǎn)生BAs。某種程度上，BAs的種類和數(shù)量取決于游離氨基酸的種類和含量，兩者呈正相關(guān)[23]。游離氨基酸是反應(yīng)的前體物質(zhì)，減少游離氨基酸含量能夠達(dá)到降低BAs合成量的結(jié)果。Wang等[24]研究表明，在一定范圍內(nèi)提高溫度，適當(dāng)降低鹽含量有利于促進(jìn)蛋白酶的水解活性，加快了對(duì)蛋白質(zhì)的分解，推動(dòng)了游離氨基酸的累積，利于生物胺的生成。但是氨基酸的種類、數(shù)量和原料的蛋白質(zhì)含量反映了醬油的風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)等關(guān)鍵指標(biāo)，為了限制BAs的生成而控制游離氨基酸和蛋白質(zhì)含量的措施缺乏可行性。López-Rituerto等[25]發(fā)現(xiàn)葡萄酒發(fā)酵中利用酵母可實(shí)現(xiàn)由組氨酸到組氨醇的轉(zhuǎn)變，Yerlikaya等[26]研究發(fā)現(xiàn)谷氨酰轉(zhuǎn)胺酶(microbial transglutaminase，MTGase)能夠使蛋白質(zhì)之間的氨基酸結(jié)合，從而無法被氨基酸脫羧酶利用。因此，對(duì)游離氨基酸的轉(zhuǎn)化過程施加影響，形成新的結(jié)合物，可為調(diào)控BAs合成開發(fā)一個(gè)新路徑。

3.2 調(diào)控醬油中的微生物

微生物是BAs形成的前提條件之一，缺乏產(chǎn)氨基酸脫羧酶微生物的參與，食物中的游離氨基酸無法形成BAs。因此，通過控制原有的產(chǎn)氨基酸脫羧酶微生物生長(zhǎng)代謝活性而降低食品中BAs的含量，是目前控制BAs含量非常有效的方法。另外，改變微生物中的菌群種類、比例、數(shù)量，或者引進(jìn)另外的微生物對(duì)于抑制BAs的生成也能夠起到非常好的效果。

Guo等[27]通過對(duì)不同耐滲透酵母菌株的聯(lián)合接種發(fā)現(xiàn)，Z.rouxiiCICC 1417和T.candidaCICC 1019聯(lián)合接種的BAs含量最低(89.43 mg/L)。Mohamed等[28]利用宏基因組學(xué)和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究在醬油發(fā)酵過程中香菜對(duì)微生物菌群和BAs的影響，發(fā)現(xiàn)醬油發(fā)酵過程中加入香菜改變了微生物菌群的組成，有效抑制了BAs的生成。Qi等[29]研究廣東醬油發(fā)酵過程中微生物群落對(duì)BAs含量的影響，發(fā)現(xiàn)接種QH-17和嗜鹽桿菌CGMCC 3792，苯乙胺、酪胺、組胺含量均顯著降低。Kim等[30]發(fā)現(xiàn)在韓國(guó)醬油(Cheonggukjang)發(fā)酵中蠟樣芽孢桿菌具備產(chǎn)胺能力，加入地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)使該菌株的含量從3～4 lg CFU/g降低到1 lg CFU/g以下，并且有效地降低了BAs的含量。由此可見，在醬油原本微生物體系中引入外源微生物，作為新型發(fā)酵劑，對(duì)原本產(chǎn)胺微生物菌株產(chǎn)生拮抗作用，可降低BAs的生成累積。這些結(jié)果表明，生物干擾是醬油發(fā)酵過程中減少和消除BAs的有效策略。

3.3 控制醬油中氨基酸脫羧酶活力

氨基酸脫羧酶是一類裂解酶，對(duì)氨基酸進(jìn)行催化裂解使其脫去羧基，形成對(duì)應(yīng)的胺。通過調(diào)節(jié)pH、含鹽量、溫度等因素可以控制氨基酸脫羧酶的活力。鄒陽等在醬油制曲時(shí)添加冰醋酸，成功地降低了醬油中精胺、亞精胺及組胺的含量。Liu等利用高效液相色譜(HPLC技術(shù))，證明了鹽度在高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵中對(duì)降低BAs具有關(guān)鍵作用。pH、鹽度、溫度等與醬油中BAs的含量并不是單一的線性關(guān)系，它們屬于醬油本身的某種特性，改變這些因素將對(duì)醬油的品質(zhì)和風(fēng)味造成影響。因此，采用單一調(diào)節(jié)某一個(gè)因素的方法抑制酶活性的措施并未得到廣泛的應(yīng)用。目前，更多的研究通過優(yōu)化組合來控制氨基酸脫羧酶活力，達(dá)到調(diào)控BAs生成的目的。曹忠娜等在高鹽稀態(tài)醬油制作過程中，既將發(fā)酵溫度降低到約20 ℃，又將鹽的含量提高到20%，有效降低了BAs生成總量。Li等研究得出在原料(DSW)、制曲環(huán)境(密封曲機(jī))、發(fā)酵溫度(38 ℃)、氯化鈉(19%)、發(fā)酵時(shí)間(40 d)的條件下釀造的醬油的BAs得到有效抑制，同時(shí)特征營(yíng)養(yǎng)素沒有丟失。另外，Qiu等[31]研究豆腐乳在成熟過程中，添加乙醇的豆腐乳總BAs含量明顯降低，推測(cè)乙醇對(duì)BAs的抑制作用機(jī)制可能是乙醇抑制了豆腐乳中脫羧酶活性。

3.4 提升醬油中BAs的降解水平

除了在源頭上阻止BAs的生成外，降解已經(jīng)存在的目標(biāo)產(chǎn)物的BAs也是一個(gè)有效的調(diào)控方法。生物胺氧化酶(amine oxidases，AOs)由BAs降解菌株合成，能夠?qū)As分解成相應(yīng)的乙醛(acetaldehyde)、氨和過氧化氫(H2O2)。微生物菌株除了能產(chǎn)胺氧化酶，還必須保證不具有產(chǎn)氨基酸脫羧酶活性，只有滿足這兩個(gè)條件才能用來降解食品中的BAs。程淑敏等[32]將BAs降解菌Wickerhamomycesanomalus和Millerozymafarinosa作為發(fā)酵劑接種至醬油發(fā)酵醪中，結(jié)果表明BAs被得到有效的降解。楊明泉等[33]將從醬醪中篩選獲得的一株嗜鹽片球菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，添加到以高鹽稀態(tài)工藝釀造的醬油的醬醪中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酪胺含量下降了77.00%，色胺含量下降了100%。符姜燕等[34]證實(shí)了從低生物胺醬醪中篩選出的一株嗜鹽四聯(lián)球菌在正常生長(zhǎng)發(fā)育過程中無法產(chǎn)生BAs。張雁凌等[35]在低鹽醬油發(fā)酵過程中添加嗜鹽四聯(lián)球菌 TS71和魯氏酵母A22，發(fā)現(xiàn)低鹽醬油的BAs降低了3.42 mg/kg。Cheng等[36]從一些自然發(fā)酵食品樣品中分離出異常威氏鐮刀菌和法氏鐮刀菌。在一定條件下該菌株表現(xiàn)出較高的多重BAs降解活性。藍(lán)翔等[37]將兩株BAs降解菌EnterococcusfaeciumR7和MillerozymafarinoseA3接種到發(fā)酵魚露中，發(fā)現(xiàn)接種復(fù)合降解菌的降解能力強(qiáng)，生物胺降解菌的聯(lián)合接種為抑制BAs合成提供了一個(gè)新路徑。

4 總結(jié)

醬油是中國(guó)的傳統(tǒng)調(diào)味品，但是醬油中的BAs存在超標(biāo)的情況，因此對(duì)釀造醬油中BAs的形成機(jī)理以及調(diào)控方法進(jìn)行研究對(duì)于提升醬油的品質(zhì)，保證民眾的健康顯得尤為重要。了解BAs在醬油中的生成機(jī)理以及影響因素才能夠深入挖掘抑制BAs形成的方法。在生物胺形成的過程中離不開微生物、酶活性、原料的成分、反應(yīng)的環(huán)境等諸多因素的作用，由于這些因素在發(fā)酵過程中并不是獨(dú)立作用的，而是相互影響，因此BAs的調(diào)控需要綜合考慮，在實(shí)現(xiàn)醬油中BAs的有效降低和不損害醬油的品質(zhì)中找到一個(gè)平衡點(diǎn)。