毛 竹， 朱繼孝， 曾金祥， 吳茜娃， 任玲玲

(江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心，江西 南昌 330004)

藥物性肝損傷是指藥物本身或/和其活性代謝產(chǎn)物所致的肝損傷，其與10%急性肝炎、50%以上急性肝衰竭、4%住院性黃疸有關(guān)[1]。近年來，我國藥物性肝損傷的發(fā)病率已超過西方發(fā)達國家，成為嚴重威脅人們身體健康不可忽視的公共衛(wèi)生問題[2]。N-乙酰半胱氨酸(NAC)、異甘次酸鎂、糖皮質(zhì)激素、水飛薊素、甘草酸和S-腺苷基甲硫氨酸常用于治療急性藥物性肝損傷[3-5]，但NAC治療窗口窄且具有嚴重的胃腸道毒副作用[3-4]，而其它藥物是否可成功防治藥物性肝損傷仍然存在疑問[5]。

中草藥及其成分對藥物性肝損傷具有良好的療效[6-9]，為篩選抗藥物性肝損傷藥物提供了重要途徑[10]。藏藥短管兔耳草系玄參科兔耳草屬植物LagotisbrevitubaMaxim.的干燥全草，為藏藥“洪連”的基原植物之一，具有清熱解毒、行血調(diào)經(jīng)之功效[11]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明短管兔耳草具有降尿酸、抗痛風、改善阿爾茨海默病癥、調(diào)節(jié)小鼠免疫功能、抗腫瘤等多種活性[11-15]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)短管兔耳草可通過清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、調(diào)控炎癥因子等途徑，有效防治急性酒精性肝損傷、α-異硫氰酸萘酯致肝損傷、四氯化碳致肝損傷[16-18]。最新研究表明，TLR4/NF-κB信號通路對肝損傷疾病的防治具有重要研究意義[19-21]?；诖?，本研究通過TLR4/NF-κB通路繼續(xù)探討短管兔耳草提取物對對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)致藥物性肝損傷的保護作用及機制，以期為抗藥物性肝損傷的新藥開發(fā)提供一定的物質(zhì)與理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物 SPF級健康雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，購自江西中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(贛)2018-0003，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進行實驗，本實驗符合江西中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會標準。

1.2 藥材 短管兔耳草購于成都荷花池藥材市場，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)鐘國躍研究員鑒定為玄參科兔耳草屬植物短管兔耳草LagotisbrevitubaMaxim.的干燥全草。稱取短管兔耳草100 g，曬干粉碎，加入10倍體積60%乙醇加熱回流提取2 h，過濾提取液，濾渣再同法提取2次，合并3次提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收乙醇，濃縮至無醇味，得短管兔耳草提取物。以0.5%羧甲基纖維素鈉配制高、中、低劑量(給藥劑量按生藥計分別為4.0、2.0、1.0 g/kg，小鼠灌胃容量為15 mL/kg)，給藥劑量參考文獻以及前期預(yù)實驗研究確定[16]。

1.3 試劑 對乙酰氨基酚試劑(批號099K0257)購自美國Sigma公司；N-乙酰-L-半胱氨酸(批號R018043)購自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；ALT、AST、SOD、MDA、GSH-Px、考馬斯亮藍蛋白定量測定試劑盒(批號C009-2、C010-2-1、A001-3、A003-1、A005、A045-2)購自南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-1β ELISA 試劑盒(批號EMC102a、EMC001b)購自深圳欣博盛生物科技有限公司；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(批號G1120)購自北京索萊寶科技有限公司；NF-κB p65、TLR4(批號ab16502、ab024751)購自英國Abcam公司；GAPDH、二抗(批號10494-1-AP、SA00001-2)購自美國Proteintech公司。

1.4 儀器 BT25S電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；RE5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；超低溫冰箱、Multiskan GO 全波長酶標儀(美國Thermo公司)；電熱恒溫烘箱(上海博迅實業(yè)有限公司)；DY89-Ⅱ電動勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Centrifuge 5430R低溫冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；PowerPac Basic電泳儀、ChemiDoc XR+凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；WD-9405B水平搖床(深圳沃德生命科技有限公司)；H1210撈片機、HistoCore Arcadia C切片機、TP1020-1包埋機(德國Lecia公司)；Nikon elipse ci-s 生物顯微鏡(日本尼康公司)。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 將60只昆明種小鼠隨機分成6組，為正常組，模型組(APAP)，陽性藥物組(N-乙酰-L-半胱氨酸)，短管兔耳草提取物低、中、高劑量組(1.0、2.0、4.0 g/kg)，每組10只。短管兔耳草提取物組灌胃給予相應(yīng)劑量藥物，陽性藥物組灌胃給予0.2 g/kgN-乙酰-L-半胱氨酸，正常組和模型組灌胃給予等量0.5%羧甲基纖維素鈉，每天1次，連續(xù)7 d。第7天給藥1 h后，正常組小鼠腹腔注射生理鹽水，其余組小鼠腹腔注射250 mg/kg APAP(溶于生理鹽水)誘導(dǎo)藥物性肝損傷。造模后小鼠禁食不禁水，4 h后摘眼球取血，取血后脫頸處死小鼠，立即于冰臺上迅速取肝臟，用冷生理鹽水漂洗肝臟，每組取相同部位肝組織(肝大葉)固定于10%甲醛中，剩余肝組織置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。血液室溫下靜置1 h，3 500 r/min離心15 min，取血清，4 ℃冷藏備用[9,22]。

2.2 試劑盒檢測血清及肝組織各指標水平 按照試劑盒說明書操作，檢測血清中ALT、AST活性，TNF-α、IL-1β水平及肝組織中MDA水平，GSH-Px、SOD活性。

2.3 HE染色觀察肝組織病理學(xué)變化 取固定好的小鼠肝組織，置于包埋盒中流水沖洗過夜，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟浸臘，包埋，切片，HE染色，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察肝臟病理學(xué)變化。

2.4 Western blot檢測小鼠肝組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達 取50 mg肝組織加1 mL 2%SDS勻漿，4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清，采用BCA定量測定蛋白樣品濃度。根據(jù)濃度制備樣品后進行常規(guī)電泳，再將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗GAPDH(1∶5 000)、TLR4(1∶3 000)、NF-κB p65(1∶5 000)4 ℃下孵育過夜，洗膜3次，二抗(1∶5 000)室溫下孵育1 h，洗膜3次，用ECL發(fā)光底物進行顯影，采用Image Lab軟件對所得蛋白質(zhì)條帶進行定量分析。

3 結(jié)果

3.1 短管兔耳草提取物對小鼠血清ALT、AST活性及TNF-α、IL-1β水平的影響 如表1所示，與正常組比較，模型組小鼠血清ALT、AST活性及TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.01)，表明造模成功；與模型組比較，陽性藥物組和短管兔耳草提取物各劑量組血清ALT、AST活性及TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05，P<0.01)，表明短管兔耳草可有效預(yù)防APAP致藥物性肝損傷小鼠的肝損傷。

表1 短管兔耳草對小鼠血清ALT、AST活性及TNF-α、IL-1β水平的影響

3.2 短管兔耳草提取物對小鼠肝組織MDA水平及GSH-Px、SOD活性的影響 如表2所示，與正常組比較，模型組小鼠肝組織MDA水平升高(P<0.01)，SOD、GSH-Px活性降低(P<0.01)，說明APAP代謝形成的氧化應(yīng)激產(chǎn)生了較大的肝損傷；與模型組比較，陽性藥物組和短管兔耳草提取物各劑量組MDA水平降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性升高(P<0.05，P<0.01)，表明短管兔耳草提取物能有效減緩APAP致藥物性肝損傷小鼠的氧化應(yīng)激。

表2 短管兔耳草對小鼠肝組織MDA水平及SOD、GSH-Px活性的影響

3.3 短管兔耳草提取物對小鼠肝組織病理學(xué)的影響 如圖1所示，正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞排列整齊呈放射狀且核圓而清晰，肝組織無炎性細胞浸潤現(xiàn)象；模型組小鼠肝組織損傷嚴重，有大量炎性細胞浸潤，肝細胞索排列紊亂，肝細胞間無明顯界限，且大量肝細胞壞死；陽性藥物組能改善小鼠肝細胞排列，肝組織結(jié)構(gòu)較清晰，炎性細胞浸潤及肝細胞壞死數(shù)量明顯減少；短管兔耳草提取物低劑量組肝索排列紊亂，肝細胞出現(xiàn)大量核增生及核固縮，大量肝細胞壞死；短管兔耳草提取物中、高劑量組肝組織結(jié)構(gòu)較清楚，肝細胞出現(xiàn)部分核固縮，炎性細胞浸潤及肝細胞壞死數(shù)量明顯減少。以上結(jié)果表明，短管兔耳草提取物可有效改善APAP致藥物性肝損傷小鼠的肝臟病理學(xué)形態(tài)。

3.4 短管兔耳草提取物對小鼠肝組織中TLR4、NF-κB p65蛋白表達的影響 如圖2所示，與正常組比較，模型組小鼠肝組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達升高(P<0.01)，說明APAP可激活TRL4/NF-κB p65信號通路；與模型組比較，短管兔耳草提取物各劑量組TLR4、NF-κB p65蛋白表達均降低(P<0.01)，說明短管兔耳草提取物對TLR4/NF-κB信號通路具有很好的抑制作用。

4 討論

APAP為臨床上常用的一種解熱鎮(zhèn)痛藥，由于其本身為非處方藥且常與其它藥物聯(lián)用，故極易因不規(guī)范性使用導(dǎo)致急性肝損傷甚至肝功能衰竭[23]。APAP誘導(dǎo)的肝損傷已成為篩選抗藥物性肝損傷藥物的理想模型[24]。APAP在過量使用情況下，經(jīng)細胞色素P450酶(CYP450)代謝生成大量毒性產(chǎn)物N-乙酰對苯醌亞胺(NAPQI)，NAPQI在耗竭GSH之后，可與細胞膜上的蛋白結(jié)合，導(dǎo)致肝細胞損傷。同時，APAP還可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量活性氧自由基(ROS)，消耗SOD、GSH-Px、GSH等抗氧化劑，導(dǎo)致人體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)失衡，觸發(fā)細胞內(nèi)炎癥信號通路釋放炎癥細胞因子，最終導(dǎo)致肝細胞損傷，嚴重時會導(dǎo)致肝細胞壞死[25-26]。ALT、AST及MDA等是評價藥物性肝損傷程度的常用指標。當發(fā)生肝細胞發(fā)生損傷時，MDA水平升高，且細胞中ALT和AST會釋放到血清中導(dǎo)致血清中ALT和AST活性升高[7]。本研究顯示，短管兔耳草提取物能夠降低APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠血清ALT和AST活性，降低肝組織MDA水平，表明短管兔耳草提取物對APAP致藥物性肝損傷具有一定的保護作用。短管兔耳草能提升肝組織SOD及GSH-Px活性，說明其可以通過改善氧化應(yīng)激減輕APAP致藥物性肝損傷發(fā)揮肝保護作用[6,8]。

TLR4屬于細胞表面信號轉(zhuǎn)導(dǎo)跨膜受體，廣泛表達于Kupffer細胞、肝巨噬細胞、肝中性粒細胞及肝樹突狀細胞等多種肝細胞中，在免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用。NF-κB在細胞生長、凋亡和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，是重要的核轉(zhuǎn)錄因子[19]。在病理狀態(tài)下，TLR4信號通路可激活一系列程序，包括使NF-κB p65轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，使炎性細胞因子如TNF-α、IL-1β釋放等[21]。其中，TNF-α由Kupffer細胞產(chǎn)生并由T細胞激活，是最主要的炎癥細胞調(diào)節(jié)因子[27]。而IL-1β由活化的巨噬細胞產(chǎn)生，在肝細胞壞死中起著重要作用[28]。這些釋放的炎癥因子表達過量又可反饋作用于NF-κB，繼而加重炎癥反應(yīng)進一步加深肝組織的損傷[21]。因此，TLR4/NF-κB信號通路在抗肝損傷中起著重要作用[19-21]。本研究結(jié)果顯示，不同劑量短管兔耳草提取物均能抑制TLR4和NF-κB p65蛋白表達，使炎性細胞因子TNF-α及IL-1β水平降低，說明抑制TLR4/NF-κB信號通路降低炎癥因子水平是短管兔耳草提取物抗APAP誘導(dǎo)藥物性肝損傷的重要機制。

綜上所述，短管兔耳草提取物對APAP誘導(dǎo)藥物性肝損傷小鼠肝臟具有一定的保護作用，其機制與TLR4/NF-κB信號通路有關(guān)。目前基于TLR4/NF-κB通路對藥物性肝損傷的藥理及藥效物質(zhì)研究仍不多見，本課題組將進一步對短管兔耳草化學(xué)成分及其藥效物質(zhì)進行研究，為短管兔耳草基于TLR4/NF-κB通路抗藥物性肝損傷藥物開發(fā)提供實驗依據(jù)及物質(zhì)基礎(chǔ)。