梁 艷， 張 峰

(1.河南應用技術職業(yè)學院，河南 鄭州 450040；2.開封市食品藥品檢驗所，河南 開封 475001)

復方益肝丸是由茵陳、野菊花、牡丹皮等28味中藥組成的復方制劑，主治清熱利濕、疏肝理脾[1]，方中茵陳和野菊花所含綠原酸、青皮所含橙皮苷、枳殼所含柚皮苷、牡丹皮所含丹皮酚、桂枝所含桂皮醛均具有抗氧化、抗炎活性，而柴胡所含柴胡皂苷具有保護肝臟作用，車前子所含毛蕊花糖苷具有抗血栓、抗腫瘤等作用[2-5]，并且五味子所含五味子醇甲對肝臟受損細胞保護，以及大黃所含大黃酸、大黃素利肝功效也起到協(xié)同作用。文獻[5]采用HPLC法對復方益肝丸中丹皮酚、大黃素、大黃酸進行含量測定，但未涉及君藥茵陳主要成分綠原酸，同時含量較低的橙皮苷、柴胡皂苷A、柴胡皂苷D均無法以紫外檢測器進行定量。因此，本實驗首次建立UPLC-MS/MS法同時測定復方益肝丸中綠原酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、橙皮苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸、大黃酸、柴胡皂苷A、五味子醇甲、柴胡皂苷D、大黃素的含量，以期為該制劑質(zhì)量控制提供技術支撐。

1 材料

Waters 2695e-Xevo TQ-S Micro超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters 公司)；KQ-250ES超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；New Classic電子天平(十萬分之一，瑞士Mettler-Toledo公司)。綠原酸(110753-201415，純度96.2%)、毛蕊花糖苷(111530-201914，純度95.2%)、柚皮苷(110722-201815，純度91.7%)、橙皮苷(110721-201617，純度96.1%)、桂皮醛(110710-201821，純度99.6%)、丹皮酚(11708-201908，純度99.8%)、甘草酸銨(110731-202021，純度96.2%)、大黃酸(110757-201607，純度99.3%)、柴胡皂苷A(110777-201912，純度94.8%)、五味子醇甲(110857-201815，純度99.7%)、柴胡皂苷D(110777-201912，純度94.8%)、大黃素(110756-201512，純度98.7%)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。甲酸、甲醇、乙腈為色譜純(德國默克公司)；乙醇為分析純；水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC-MS/MS條件

2.1.1 色譜 Phenomenex Kinetex C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，2.6 μm)；流動相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫(0～0.8 min，88%B；0.8～2.5 min，88%～70%B；2.5～8 min，70%～30%B；8～8.5 min，30%～88%B；8.5～13 min，88%B)；體積流量0.35 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源(ESI)；多反應監(jiān)測(MRM)模式，正負離子掃描；噴霧電壓3.1 kV；錐孔電壓40 V；干燥氮氣溫度450 ℃，體積流量 950 L/h；碰撞氣Ar；霧化器壓力248 kPa；離子源溫度155 ℃，其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 各成分質(zhì)譜參數(shù)

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 分別取橙皮苷、丹皮酚、甘草酸、大黃酸、綠原酸、柴胡皂苷A、毛蕊花糖苷、五味子醇甲、柴胡皂苷D、大黃素對照品約10 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，作為貯備液(1.00 g/L)。再分別取桂皮醛、柚皮苷對照品約10 mg，精密精定，置于50 mL量瓶中，加入上述貯備液，70%乙醇稀釋至刻度，即得(毛蕊花糖苷、柚皮苷、橙皮苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸、大黃酸、柴胡皂苷A、五味子醇甲、柴胡皂苷D、綠原酸、大黃素質(zhì)量濃度分別為0.040 88、0.201 8、0.010 35、0.204 2、0.104 6、0.102 6、0.040 44、0.010 22、0.040 76、0.010 48、0.101 1、0.040 68 g/L)。

2.2.2 供試品溶液 取本品20丸，研碎，取約0.2 g，精密稱定，置于250 mL錐形瓶中，加入約50 mL無水乙醇超聲處理30 min，濾過，濾液置于200 mL量瓶中，殘渣轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，加入70%乙醇約100 mL，60 ℃水浴加熱回流提取90 min，放冷，濾過，濾液濾入量瓶中，70%乙醇洗滌殘渣并稀釋至刻度，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 參照文獻[1]中的處方，分別取除野菊花、茵陳、車前子、大黃、青皮以外的23味藥材(陰性樣品Ⅰ)，除牡丹皮、枳殼、桂枝、五味子、柴胡、炙甘草以外的22味藥材(陰性樣品Ⅱ)，除野菊花、茵陳、車前子、牡丹皮、大黃、青皮、枳殼、桂枝、五味子、柴胡、炙甘草以外的17味藥材(陰性樣品Ⅲ)，分別按“2.2.2”項下方法制備，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察 取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖1～5。由此可知，各成分峰形良好，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.3.2 線性關系考察 精密吸取對照品溶液適量，70%乙醇稀釋至系列質(zhì)量濃度，在“2.1”項條件下進樣測定。以對照品峰面積為縱坐標(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(X)進行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關系良好。

表2 各成分線性關系

2.3.3 精密度試驗 取“2.3.2”項下中間質(zhì)量濃度對照品溶液，在“2.1”項條件下進樣測定6次，測得綠原酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、橙皮苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸、大黃酸、柴胡皂苷A、五味子醇甲、柴胡皂苷D、大黃素峰面積RSD分別為2.82%、2.46%、2.54%、3.02%、2.84%、2.63%、2.25%、3.06%、3.22%、2.77%、3.41%、2.99%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 取同一批樣品6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項條件下進樣測定，測得綠原酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、橙皮苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸、大黃酸、柴胡皂苷A、五味子醇甲、柴胡皂苷D、大黃素含量RSD分別為2.45%、2.34%、2.14%、2.94%、3.25%、3.22%、3.05%、2.47%、3.51%、3.33%、3.61%、2.84%，表明該方法重復性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.3.4”項下供試品溶液，于0、2、4、8、12、20、24 h在“2.1”項條件下進樣測定，測得綠原酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、橙皮苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸、大黃酸、柴胡皂苷A、五味子醇甲、柴胡皂苷D、大黃素峰面積RSD分別為3.58%、3.24%、2.36%、3.14%、3.33%、2.46%、2.54%、2.45%、3.22%、3.61%、3.05%、3.37%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的本品9份，每份約0.1 g，精密稱定，置于250 mL錐形瓶中，精密量取“2.2.1”項下溶液0.25、0.5、0.75 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液各3份，在“2.1”項條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，綠原酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、橙皮苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸、大黃酸、柴胡皂苷A、五味子醇甲、柴胡皂苷D、大黃素平均加樣回收率分別為98.34%、98.02%、98.98%、98.20%、97.16%、97.89%、98.10%、99.42%、97.07%、98.59%、97.60%、98.06%，RSD分別為2.01%、1.92%、1.64%、2.23%、2.73%、1.82%、2.26%、2.61%、2.08%、2.16%、2.73%、2.32%。

2.3.7 樣品含量測定 取3批樣品，每批2份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項條件下進樣測定，計算含量，結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測定結(jié)果(mg/g)

3 討論

課題組前期查閱文獻[6-8]發(fā)現(xiàn)，各成分的提取方法有浸漬法、水提法、超聲波提取法、回流提取法，考慮到乙醇無毒，故聯(lián)合應用超聲波提取法和回流提取法，此時提取率較高[9]。本實驗分別采用不同體積分數(shù)乙醇超聲、回流提取，發(fā)現(xiàn)先用無水乙醇超聲提取，再用70%乙醇回流提取時效果最佳；分別考察了回流時間30、60、90、120、150 min，發(fā)現(xiàn)超過90 min后各成分提取率無明顯變化；由于柴胡皂苷熱穩(wěn)定性較差，故選擇提取溫度為60 ℃。另外，各成分在不同pH值下的穩(wěn)定性有所差異，同時考慮到溶劑效應的影響，最終選擇70%乙醇作為溶劑對樣品進行稀釋。

在篩選色譜條件時，本實驗比較了流動相0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈、乙酸銨緩沖鹽-甲醇、乙酸銨緩沖鹽-乙腈[10-18]，發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸-乙腈梯度洗脫時各成分拖尾因子均最理想。同時，在多反應檢測模式下對正負離子進行切換掃描，可得到較高的靈敏度，從而保障了方法的專屬性。

4 結(jié)論

本實驗首次建立UPLC-MS/MS法同時測定復方益肝丸中綠原酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、橙皮苷、桂皮醛、丹皮酚、甘草酸、大黃酸、柴胡皂苷A、五味子醇甲、柴胡皂苷D、大黃素的含量，該方法專屬性強，速度快，靈敏度高，可為該制劑質(zhì)量控制提供參考。