潘錦超，劉獻(xiàn)，高敬，3，湯響林△，高月△

（1廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510006；2軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；3河南大學(xué)，河南 開封 475004）

我國(guó)是世界上高原地區(qū)面積最大、平均海拔最高、定居人口最多的國(guó)家。每年有大約1億人因各種原因前往高海拔地區(qū)［1］。高海拔地區(qū)低壓缺氧及強(qiáng)紫外線的環(huán)境對(duì)從平原來(lái)到高原的人群產(chǎn)生不適影響，許多人會(huì)出現(xiàn)頭痛、胸悶、乏力等輕微癥狀，嚴(yán)重者會(huì)患急性高原病。因此探究高原低壓缺氧對(duì)機(jī)體損傷的機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)。目前低壓缺氧對(duì)機(jī)體的損傷研究大多集中在腦、肺以及心臟方面，但對(duì)缺氧同樣敏感的腎臟這一器官，高原缺氧對(duì)其功能損傷的研究仍有欠缺。已有的文獻(xiàn)證明急性高原缺氧能夠?qū)е录毙阅I損傷［2］，并且持續(xù)的急性腎損傷會(huì)導(dǎo)致急性腎功能衰竭或慢性腎病，因此需要盡早發(fā)現(xiàn)急性腎損傷并進(jìn)行治療。在目前已有的高原急性腎損傷研究中，用來(lái)評(píng)價(jià)腎損傷的指標(biāo)主要集中在血清肌酐（serum creatinine，SCr）［3-4］、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）［5-6］、尿中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）［4，7］、尿腎損傷分子1（kidney injury molecule-1，KIM-1）［3，8］、尿白細(xì)胞介素18（interleukin-18，IL-18）、尿Na+/H+交換蛋白3（Na+/H+exchanger 3，NHE3）［9］等。然而，已有研究?jī)H局限于單一的海拔高度，對(duì)不同海拔高度腎臟損傷情況尚不清楚。另外，傳統(tǒng)的SCr僅在腎小球?yàn)V過(guò)率下降超過(guò)50%才會(huì)顯著降低，因此不能及時(shí)反映腎臟功能的變化。除NGAL和KIM-1外，目前的臨床研究也證明了其他幾種生物標(biāo)志物如肝型脂肪酸結(jié)合蛋白（liver-type fatty acid-binding protein，L-FABP）、金屬蛋白酶組織抑 制 因 子2（tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2）和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7（insulinlike growth factor binding protein 7，IGFBP7）均能很好地評(píng)價(jià)急性腎損傷，然而在動(dòng)物水平上的評(píng)價(jià)作用研究較少。因此，本研究通過(guò)模擬不同海拔高度，觀察低、中、高三個(gè)不同海拔高度下大鼠腎臟的損傷程度，以及L-FABP、TIMP-2和IGFBP7在大鼠腎臟中的表達(dá)情況，旨在探究潛在新型標(biāo)志物在大鼠不同程度高原腎損傷中的變化情況，同時(shí)對(duì)三種新型腎損傷標(biāo)志物的靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià)，為新型標(biāo)志物在高原腎臟損傷及其他腎臟疾病中的應(yīng)用提供依據(jù)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

動(dòng)物低壓氧艙（貴州風(fēng)雷航空軍械有限公司）；血細(xì)胞分析儀（Sysmex）；生化分析儀（Hitachi）；酶標(biāo)儀（PerkinElmer）；Heraeus高速冷凍離心機(jī)（Thermo Scientific）。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（貨號(hào)：MM-0386R1）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（貨號(hào)：MM-0180R1）、L-FABP試 劑 盒（貨號(hào)：MM-70115R1）、TIMP-2試劑盒（貨號(hào)：MM-0127R1）和IGFBP7試劑盒（貨號(hào)：MM-70148R1）均購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組8周齡健康SPF級(jí)SD大鼠64只，雌雄各半，體重180～200 g，均購(gòu)自北京維通利華公司［生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011］。動(dòng)物飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)，將大鼠隨機(jī)分為高原缺氧組和對(duì)照組，高原缺氧組又分為海拔3 500 m組、海拔4 500 m組及海拔5 500 m組，每組16只。

2.2 模型制備將3 500 m組大鼠于第1天上午8：00置于低壓氧艙中，連續(xù)缺氧72 h；于第3天晚8：00對(duì)大鼠禁食處理，第4天上午8：00將大鼠從低壓氧艙中取出，同時(shí)將4 500 m組大鼠置于低壓氧艙中；于第6天晚8：00對(duì)大鼠禁食處理，第7天上午8：00將大鼠從低壓氧艙中取出，同時(shí)將5 500 m組大鼠置于低壓氧艙中；于第9天晚8：00對(duì)大鼠禁食處理，第10天上午8：00將大鼠從低壓氧艙中取出。對(duì)照組大鼠在常壓常氧環(huán)境下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠自由進(jìn)食飲水。高原缺氧組大鼠從低壓氧艙中取出后立即注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，迅速剪開腹腔取腹主動(dòng)脈血和雙側(cè)腎臟。對(duì)照組大鼠與海拔5 500 m組大鼠在同一時(shí)段內(nèi)取材。

2.3 血細(xì)胞含量測(cè)定取部分腹主動(dòng)脈血裝入抗凝管中，用血細(xì)胞分析儀測(cè)大鼠全血中血細(xì)胞含量。

2.4 SCr、BUN、血清尿酸（uric acid，UA）含量測(cè)定剩余血液裝入不含抗凝劑的EP管中，室溫放置2 h后于4℃、2 012.4×g離心15 min，取一部分上清液用生化分析儀檢測(cè)SCr、BUN和血清UA含量。

2.5 腎組織SOD、TNF-α、L-FABP、TIMP-2和IGFBP7水平測(cè)定取部分右腎放入2 mL EP管中，加入預(yù)冷的PBS，用組織勻漿機(jī)勻漿，離心取上清液，按試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各指標(biāo)。

2.6 腎臟組織病理染色取左腎，縱向切開，切取1 cm×1 cm×1 cm大小組織塊放入4%多聚甲醛固定液中固定，脫水包埋、切片，分別進(jìn)行HE染色及Masson染色后置于光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織病理情況。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用GraphPad Prism 8.0.2軟件統(tǒng)計(jì)并繪圖。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠血細(xì)胞含量變化

對(duì)各組大鼠外周血象數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。與對(duì)照組相比，高原缺氧組大鼠全血中紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）計(jì)數(shù)和紅細(xì)胞比容（hematocrit，HCT）均有一定升高，其中4 500 m組和5 500 m組有顯著差異（P＜0.01），血紅蛋白（hemoglobin，HGB）含量和網(wǎng)織紅細(xì)胞（reticulocyte，RET）計(jì)數(shù)均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

Figure 1.Changes of blood cells in rats at different altitudes.A：changes of red blood cell（RBC）count in each group；B：changes of hemoglobin（HGB）content in each group；C：changes of hematocrit（HCT）in each group；D：changes of reticulocyte（RET）count in each group.Mean±SD.n=16.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal control（NC）group.圖1 不同海拔高度下大鼠血細(xì)胞變化情況

2 SCr、BUN和血清UA含量變化

與對(duì)照組相比，高原缺氧組大鼠SCr含量均有所升高，其中4 500 m組和5 500 m組顯著升高（P＜0.01）；3 500 m組大鼠BUN含量與對(duì)照組相比有升高趨勢(shì)，5 500 m組顯著升高（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，僅4 500 m組大鼠血清UA含量顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

Figure 2.Changes of serum creatinine（SCr），blood urea nitrogen（BUN）and serum uric acid（UA）levels in rats at different altitudes.A：changes of SCr content in each group；B：changes of BUN content in each group；C：changes of serum UA content in each group.Mean±SD.n=16.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal control（NC）group.圖2 不同海拔高度下大鼠SCr、BUN和血清UA含量變化

3 腎組織中SOD、TNF-α、L-FABP、TIMP-2和IGFBP7水平

與對(duì)照組相比，高原缺氧組大鼠腎組織中SOD活性均顯著降低（P＜0.05），其中5 500 m組降低更為顯著（P＜0.01）；高原缺氧組大鼠腎組織中TNF-α含量均顯著升高（P＜0.01）；大鼠腎組織中L-FABP、TIMP-2和IGFBP7含量均隨海拔高度的增加而逐漸升高（P＜0.05或P＜0.01），見(jiàn)圖3。

4 腎組織HE染色結(jié)果

HE染色顯示，對(duì)照組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，腎皮質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量毛細(xì)血管纏繞形成的腎小球，腎小球間質(zhì)內(nèi)排列大量腎小管，腎皮質(zhì)與髓質(zhì)界限清晰，髓質(zhì)內(nèi)分布大量集合管，組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)明顯病理改變；與對(duì)照組相比，3 500 m組大鼠腎組織中部分腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣脫落，部分腎小管上皮細(xì)胞水腫，細(xì)胞腫脹、胞質(zhì)淡染；4 500 m組大鼠腎皮質(zhì)區(qū)內(nèi)部分腎小管上皮細(xì)胞水腫，細(xì)胞腫脹、胞質(zhì)淡染，部分腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣脫落；5 500 m組大鼠腎組織內(nèi)大量腎小管出現(xiàn)損傷，上皮細(xì)胞水腫，細(xì)胞腫脹、胞質(zhì)淡染，部分腎小球萎縮，球內(nèi)毛細(xì)血管數(shù)量減少，且可見(jiàn)明顯腎小球分葉現(xiàn)象。腎組織病理評(píng)分結(jié)果顯示，高原缺氧組與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖4。

Figure 3.Changes of superoxide dismutase（SOD），tumor necrosis factor-α（TNF-α），liver-type fatty acid-binding protein（LFABP），tissue inhibitor of metalloproteinase-2（TIMP-2）and insulin-like growth factor binding protein 7（IGFBP7）levels in kidney tissue of rats at different altitudes.A：changes of SOD activity in each group；B：changes of TNF-αcontent in each group；C：changes of L-FABP content in each group；D：changes of TIMP-2 content in each group；E：changes of IGFBP7 content in each group.Mean±SD.n=16.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal control（NC）group.圖3 不同海拔高度下大鼠腎組織中SOD、TNF-α、L-FABP、TIMP-2和IGFBP7水平的變化

5 腎組織Masson染色結(jié)果

Masson染色顯示，對(duì)照組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)無(wú)顯著纖維化情況，高原缺氧組大鼠腎組織出現(xiàn)顯著纖維化變化；計(jì)算膠原纖維面積百分比結(jié)果顯示，由于3 500 m組和5 500 m組大鼠組內(nèi)存在個(gè)體差異，因此僅4 500 m組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖5。

討 論

目前已知高原低壓缺氧環(huán)境能夠?qū)π呐K、腦、肺造成損傷，對(duì)腎臟功能影響的報(bào)道較少。研究表明急進(jìn)高原早期健康人群腎臟功能有一定改變，表現(xiàn)為尿IL-18、尿NAGL、尿KIM-1、BUN、SCr、血UA和血cystatin C水平的變化［6，8］，提示腎小球?yàn)V過(guò)、腎小管重吸收和分泌功能受到損傷，且隨海拔高度的增加而加重。由于腎臟的代償作用，這種損傷會(huì)隨缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)而減弱［10］。目前對(duì)高原腎損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究往往停留在單一海拔高度，且評(píng)價(jià)腎損傷的標(biāo)志物靈敏度較差。因此本研究評(píng)價(jià)了新型腎損傷標(biāo)志物在評(píng)價(jià)動(dòng)物水平高原腎損傷中的靈敏度，為其在動(dòng)物腎臟疾病研究的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

本研究結(jié)果表明：缺氧后大鼠全血中紅細(xì)胞、血紅蛋白、網(wǎng)織紅細(xì)胞含量及紅細(xì)胞比容較對(duì)照組有不同程度升高，這表明隨海拔的升高，大鼠全血中與攜氧能力有關(guān)的血細(xì)胞與蛋白呈現(xiàn)出梯度的升高趨勢(shì)。急性低壓缺氧后，大鼠腎組織中炎癥因子（TNFα）含量增加。炎癥在許多高原疾病中都有參與，雖然目前尚不清楚其具體作用機(jī)制，但在其他能夠產(chǎn)生低氧微環(huán)境的疾病中，已被證明HIF-1α具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)［11-13］，加重炎癥損傷的功能［14］。另外，炎癥因子能夠通過(guò)NF-κB通路激活HIF［15-18］，進(jìn)而調(diào)控HIF下游蛋白的表達(dá)。氧化應(yīng)激是機(jī)體產(chǎn)生ROS的含量超過(guò)抗氧化能力時(shí)的一種狀態(tài)［19］。缺氧能夠通過(guò)HIF-1α/NOX4通路積累ROS［20］，造成氧化應(yīng)激，本研究結(jié)果顯示低壓缺氧后大鼠腎組織中SOD含量減少，大鼠抵抗氧化應(yīng)激能力減弱。一直以來(lái)，腎小球?yàn)V過(guò)率都被認(rèn)為是評(píng)價(jià)腎臟健康與否的黃金指標(biāo)［21］，而SCr常作為估計(jì)腎小球?yàn)V過(guò)率的重要指標(biāo)［22］。目前臨床經(jīng)常使用SCr或BUN來(lái)作為評(píng)價(jià)腎損傷的指標(biāo)，然而這兩者的值往往在腎小球?yàn)V過(guò)率低于50%時(shí)才會(huì)發(fā)生顯著升高，并且BUN受疾病、飲食等因素影響較大，因此用SCr與BUN診斷早期腎臟損傷很可能是不準(zhǔn)確的。尋找更靈敏的評(píng)價(jià)腎臟損傷的標(biāo)志物是十分重要的。

Figure 4.Pathological changes of kidneys in rats at different altitudes（HE staining，scale bar=100μm）.A：normal control group；B：3 500 m group［part of renal tubular epithelial cells with brush border exfoliation（black arrow），and some renal tubular epithelial cell edema（red arrow）］；C：4 500 m group［edema of some renal tubular epithelial cells（green arrow）and brush margin exfoliation of some renal tubular epithelial cells（black arrow）］；D：5 500 m group［edema of renal tubular epithelial cells（red arrow），atrophy of some glomeruli，reduction of intraglomerular capillaries，and glomerular paging（black arrow）］.Mean±SD.n=16.*P＜0.05，**P＜0.01 vs A.圖4 不同海拔高度下大鼠腎臟病理形態(tài)變化（HE染色）

Figure 5.Renal pathomorphological changes（Masson staining，scale bar=100μm）in each group at different altitudes.A：normal control group；B：3 500 m group；C：4 500 m group；D：5 500 m group.Mean±SD.n=16.*P＜0.05，**P＜0.01 vs A.圖5 不同海拔高度下大鼠腎臟病理形態(tài)變化（Masson染色）

L-FABP是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)脂肪酸結(jié)合蛋白家族的成員，它在調(diào)節(jié)脂肪酸新陳代謝和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸方面起著至關(guān)重要的作用［23］。除了在肝臟中表達(dá)外，它在腎臟近端腎小管上皮細(xì)胞中也有表達(dá)，并在腎小管損傷時(shí)分泌到尿液中［24］。臨床研究表明，心血管手術(shù)患者術(shù)后尿L-FABP值對(duì)其是否會(huì)發(fā)生急性腎損傷具有較好的預(yù)測(cè)作用［23］。另外，研究表明，F(xiàn)ABP1基因啟動(dòng)子區(qū)域含有缺氧反應(yīng)元件［25］，在腎小管遭受缺血缺氧時(shí)FABP1分泌增多，因此FABP1可以作為一個(gè)表征缺氧性腎臟損傷的指標(biāo)。

TIMP-2是腎組織遠(yuǎn)端小管表達(dá)并分泌的一種物質(zhì)［26］，是一種細(xì)胞周期阻滯蛋白，已被證明TIMP-2與α3β1整合素結(jié)合，使細(xì)胞停留在G1期，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖［27］。IGFBP7主要在近端小管表達(dá)［26］，其能夠在腎小管上皮細(xì)胞受到損傷后以自分泌和旁分泌的方式釋放并作用于未受到損傷的細(xì)胞，通過(guò)調(diào)控p53和p21的表達(dá)來(lái)阻斷細(xì)胞周期的進(jìn)程［28］。這兩者均能夠在腎小管細(xì)胞損傷的早期階段釋放并參與G1期停滯［29］。已有的臨床研究也表明TIMP-2與IGFBP7對(duì)患者發(fā)生急性腎損傷的預(yù)測(cè)作用優(yōu)于其他生物標(biāo)志物［28］。因此這3種物質(zhì)在能夠急性腎損傷早期起到預(yù)測(cè)作用，且較SCr有更好的敏感性，然而它們?cè)趧?dòng)物水平腎損傷的預(yù)測(cè)作用研究較少。

在本研究中，與對(duì)照組相比，高原缺氧組大鼠SCr及腎組織L-FABP、TIMP-2和IGFBP7含量升高，提示高原缺氧能夠降低大鼠腎小球?yàn)V過(guò)率，造成急性腎損傷；高原缺氧組各組之間相比，腎臟病理變化隨海拔高度增加逐漸明顯。與4 500 m組及5 500 m組相比，3 500 m組大鼠腎臟損傷程度相對(duì)較小，SCr變化較少，然而TIMP-2和IGFBP7含量在3 500 m組就已發(fā)生顯著升高。這提示TIMP-2和IGFBP7較SCr靈敏度更佳，在病理形態(tài)尚未出現(xiàn)明顯改變時(shí)可提示損傷的發(fā)生，而L-FABP的靈敏度較TIMP-2和IGFBP7稍差，僅在海拔4 500 m時(shí)發(fā)生明顯升高。BUN與血清UA含量并未隨海拔高度的升高逐漸增多，推測(cè)可能是其他因素影響了這兩者含量的變化。

在高原缺氧導(dǎo)致的大鼠腎臟損傷中，氧化應(yīng)激和炎癥似乎參與了這一進(jìn)程，然而在病理結(jié)果上并未出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，因此關(guān)于高原缺氧導(dǎo)致的腎臟損傷機(jī)制需要進(jìn)一步研究。另外，本實(shí)驗(yàn)是基于健康大鼠，對(duì)于患有糖尿病腎病、高血壓或其他腎功能不良的大鼠，高原缺氧能否加重其腎臟功能損傷，還有待進(jìn)一步研究。在健康人水平上，由于急進(jìn)高原初期健康人腎臟功能有一定改變，因此初上高原1周內(nèi)，要密切關(guān)注高原駐防官兵的腎臟功能，對(duì)于出現(xiàn)腎臟相關(guān)指標(biāo)異常的官兵，要及時(shí)給予糾正，以免損傷加重。另外在相關(guān)藥物的使用方面要注意藥量的調(diào)整，避免發(fā)生由于藥量過(guò)高產(chǎn)生的毒副作用。