何立彬，郭 冉，于志文，高佳朋，韓佳樂

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，河北秦皇島 066000)

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)別名南美白對(duì)蝦，是世界上產(chǎn)量最高、養(yǎng)殖最為廣泛的三大對(duì)蝦品種之一[1-3]。近年來，工廠化養(yǎng)殖發(fā)展迅速，高密度集約化養(yǎng)殖方式也給中國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來了諸多問題。其中，養(yǎng)殖水體中的大量殘余餌料和糞便致使水質(zhì)惡化，進(jìn)而導(dǎo)致了各種水產(chǎn)類疾病頻發(fā)，嚴(yán)重危及對(duì)蝦養(yǎng)殖安全[4]。作為凡納濱對(duì)蝦賴以生存的環(huán)境，養(yǎng)殖水體的安全是健康養(yǎng)殖的關(guān)鍵，水體中的微生物群落多樣性發(fā)揮著重要作用[5]。一些有益菌，如芽孢桿菌、光合細(xì)菌、乳酸菌、酵母菌等對(duì)改善養(yǎng)殖水體環(huán)境、增強(qiáng)對(duì)蝦抗病能力、促進(jìn)對(duì)蝦生長(zhǎng)等方面效果顯著[6]。因此，了解養(yǎng)殖水體微生物菌群結(jié)構(gòu)及多樣性變化至關(guān)重要[7]。高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)研究宏基因組學(xué)(Metagenomics)有重要意義，是一種不需要對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)和純化，便可直接研究自然環(huán)境條件下微生物群落多樣性的重要手段和方法[8]。該實(shí)驗(yàn)利用基于PacBio測(cè)序平臺(tái)的16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)，比較兩種密度下不同時(shí)期凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水體菌群結(jié)構(gòu)變化情況，旨在為養(yǎng)殖水體微生物多樣性的研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 水樣采集與預(yù)處理

放苗前將養(yǎng)殖池(6m×6m×1m)消毒處理，然后注入砂濾后的海水。整個(gè)養(yǎng)殖過程分兩種密度養(yǎng)殖，即100尾/m2為低密度組，200尾/m2為高密度組，每種密度下3個(gè)平行養(yǎng)殖池，養(yǎng)殖周期均為90d。各個(gè)養(yǎng)殖池的水樣采集分為4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，即第20天、40天、60天和80天，分別用字母A、B、C、D來表示。1、2、3號(hào)池為低密度組，分別用字母編號(hào)O1、O2、O3表示，4、5、6號(hào)池為高密度組，分別用字母編號(hào)T1、T2、T3表示。按照采集時(shí)間點(diǎn)和養(yǎng)殖密度將水樣分為8組，共24個(gè)樣品，即AO(AO1、AO2、AO3)、AT(AT1、AT2、AT3)、BO(BO1、BO2、BO3)、BT(BT1、BT2、BT3)、CO(CO1、CO2、CO3)、CT(CT1、CT2、CT3)、DO(DO1、DO2、DO3)、DT(DT1、DT2、DT3)。根據(jù)陳瓊[6]、吳歡歡[9]等人的取樣方法，水樣采集前所有的儀器和器皿都要采取滅菌處理，每個(gè)養(yǎng)殖池取2L水放入滅菌的三角瓶?jī)?nèi)，采取隔膜真空泵抽濾的方法，并使用醋酸纖維素濾膜(0.22μm孔徑)過濾水樣，收集水中的微生物。抽濾完畢后，將濾膜放入滅菌的密封袋中，及時(shí)轉(zhuǎn)移至-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫糜谖⑸锒鄻有苑治觥?/p>

1.2 高通量測(cè)序處理方法

樣品采集完畢后，送至百邁客生物科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序，利用 PacBio 測(cè)序平臺(tái)，采用單分子實(shí)時(shí)測(cè)序(SMRT Cell)的方法得出原始數(shù)據(jù)，在原始數(shù)據(jù)中導(dǎo)出CSS序列，進(jìn)行Barcode識(shí)別，去除嵌合體，得出Effective CCS，通過聚類，劃分OTUs(分類操作單元)，得出物種分類。

1.3 生物統(tǒng)計(jì)分析

使用Usearch軟件[10]對(duì)相似度為97%水平下的Reads聚類，得到OTUs并注釋，得出物種信息。根據(jù)物種信息，選取樣品在門、綱、目、科、屬、種6個(gè)級(jí)別中豐度水平前十的物種，通過物種分布柱狀圖及物種差異分析，統(tǒng)計(jì)所有樣品中的OTU，找出養(yǎng)殖水體中的優(yōu)勢(shì)或核心菌群[11]，并進(jìn)一步對(duì)OTUs進(jìn)行豐度、序列特征、α-多樣性和β-多樣性分析等，得出物種的數(shù)量和均勻程度等信息。在β-多樣性分析中，通過基于系統(tǒng)發(fā)生樹的微生物菌群結(jié)構(gòu)Unifrac[12]非加權(quán)主坐標(biāo)分析作圖展示，選出貢獻(xiàn)率最大的主成分組合，進(jìn)而得出存在組間差異顯著性的物種。然后再通過對(duì)各物種功能基因預(yù)測(cè)分析，得出養(yǎng)殖水體中的微生物群落結(jié)構(gòu)變化情況。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，并用Tukey法進(jìn)行組間多重比較分析，差異顯著性水平為P<0.05。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)

該實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的24個(gè)樣品通過Barcode識(shí)別后共獲得373471條CCS序列，每個(gè)樣品至少產(chǎn)生9002條CCS序列，平均產(chǎn)生15561條CCS序列。使用Usearch軟件對(duì)CCS序列在97.0%的相似度水平下進(jìn)行聚類、獲得OTU，8個(gè)樣品組AO、AT、BO、BT、CO、CT、DO、DT的平均OUT數(shù)量如表1所示。

表1 各樣品組CSS和OUT數(shù)量統(tǒng)計(jì)表

根據(jù)表1可知，各樣品組OUT數(shù)量無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 基于門、屬水平下的菌群結(jié)構(gòu)和組間差異分析

根據(jù)物種注釋，得出各樣品微生物菌群可劃分為24個(gè)門、43個(gè)綱、114個(gè)目、180個(gè)科和328個(gè)屬。

如圖1所示，在門水平上，細(xì)菌數(shù)量排名前十的菌門為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、髕骨細(xì)菌門(Patescibacteria)、扁平菌門(Planctomycetes)、依附菌門(Dependentiae)、氯曲菌門(Chloroflexi)和硝基螺旋菌門(Nitrospirae)。在低密度組(AO、BO、CO、DO)養(yǎng)殖水體中，優(yōu)勢(shì)菌門中變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和厚壁菌門的平均相對(duì)豐度分別為49.93%、37.36%、5.12%和2.63%；在高密度組(AT、BT、CT、DT)養(yǎng)殖水體中，優(yōu)勢(shì)菌門中變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和厚壁菌門的平均相對(duì)豐度分別為70.28%、21.09%、3.06%和1.21%。在屬水平上，細(xì)菌豐度排名前十的菌屬為海命菌屬(Marivita)、uncultured_bacterium_c_Alphaproteobacteria、褐指藻菌屬(Phaeodactylibacter)、uncultured_bacterium_f_Saprospiaceae、Cobetia、亞硫酸桿菌屬(Sulfitobacter)、九龍桿菌屬(Jiulongibacter)、極化桿菌屬(Polaribacter)、冷桿菌屬(Psychrobacter)和uncultured_bacterium_f_Rhodobacteraceae。在低密度組養(yǎng)殖水體中，優(yōu)勢(shì)菌屬中海命菌屬、uncultured_bacterium_c_Alphaproteobacteria、褐指藻菌屬、uncultured_bacterium_f_Saprospiaceae的平均相對(duì)豐度分別為12.59%、11.74%、11.05%和5.54%；在高密度組養(yǎng)殖水體中，優(yōu)勢(shì)菌屬中海命菌屬、uncultured_bacterium_c_Alphaproteobacteria、褐指藻菌屬、uncultured_bacterium_f_Saprospiace ae的平均相對(duì)豐度分別為16.72%、2.90%、1.63%和2.80%。綜上，低密度組和高密度組養(yǎng)殖水體中優(yōu)勢(shì)菌門均是變形菌門，其次是擬桿菌門，優(yōu)勢(shì)菌屬是海命菌屬。

圖1 門水平(左)和屬水平(右)物種分布柱狀圖

如圖2所示，在門水平下，高密度組變形菌門細(xì)菌豐度均高于低密度組，而擬桿菌門細(xì)菌豐度均低于低密度組，并且BT、CT、DT組顯著性低于BO組(P<0.05)。CO組獲得最高的疣微菌門細(xì)菌豐度并且顯著高于DO組(P<0.05)。各組放線菌門，厚壁菌門，髕骨細(xì)菌門細(xì)菌豐度沒有顯著性差異(P>0.05)。

圖2 門水平物種差異柱狀圖

圖3展示了在屬水平上相對(duì)豐度較高的六個(gè)屬，BO組褐指藻菌屬細(xì)菌豐度顯著高于其余各組(P<0.05)，其他菌屬細(xì)菌豐度在各組中無顯著性差異(P>0.05)。

圖3 屬水平物種差異柱狀圖

2.3 α-多樣性指數(shù)分析

使用QIIME2軟件對(duì)各樣品α-多樣性指數(shù)進(jìn)行計(jì)算評(píng)估，得出各個(gè)指數(shù)數(shù)值，并通過SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析，比較各樣品組的顯著性關(guān)系。

由表2可知，AO組獲得最高的Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)，分別為435.06±56.17和449.2±56.98；AT組獲得最高Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)，分別為5.32±0.37和0.95±0.02；BT組獲得最低Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)，分別為239.3±30.95、2.99±0.62和0.68±0.1；BO組獲得最低Ace指數(shù)，為263.78±88.3。AO組Chao1指數(shù)顯著高于BT組(P<0.05)，且Ace指數(shù)顯著高于BO組和DO組(P<0.05)；AO、AT、CO、CT、DT組Shannon指數(shù)顯著高于BT組(P<0.05)，且BT組Simpson指數(shù)顯著低于其他各樣品組(P<0.05)；另外，各組間的Coverage指數(shù)和PD_whole_tree指數(shù)并無顯著性差異(P>0.05)。

表2 各樣品組α-多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Each sample group α-diversity index statistics

2.4 β-多樣性分析

使用QIIME軟件對(duì)各樣品進(jìn)行β-多樣性分析，采用基于系統(tǒng)發(fā)生樹的非加權(quán)(Unweighted Unifrac)的計(jì)算方法，并結(jié)合主成分分析[13](Principal Component Analysis，PCA)和主坐標(biāo)分析法[14](Principal Coordinates Analysis，PCoA)，來比較物種的有無和組間差異。如圖4所示，基于Unifrac 非加權(quán)主坐標(biāo)分析的第一主成分貢獻(xiàn)值為19.05%，第二主成分的貢獻(xiàn)值為11.46%。根據(jù)非加權(quán)主坐標(biāo)分析圖可以看出，同時(shí)期不同密度的對(duì)蝦養(yǎng)殖池水樣存在一定交疊現(xiàn)象(AO和AT)，部分樣品呈現(xiàn)出明顯的聚類現(xiàn)象(BO和BT、CO和CT)，不同時(shí)期(A、B、C、D四個(gè)時(shí)間點(diǎn))水樣微生物構(gòu)成總體上可以分開。

圖4 基于系統(tǒng)發(fā)生樹的微生物菌群結(jié)構(gòu)Unifrac非加權(quán)主坐標(biāo)分析

2.5 功能基因預(yù)測(cè)分析

如圖5所示，基于16S rRNA基因測(cè)序，使用BugBase工具[15]預(yù)測(cè)了潛在的好氧(Aerobic)，厭氧(Anaerobic)，移動(dòng)元件含量(contains_mobile_elements)，兼性厭氧(facultatively anaerobic)，生物膜形成(Forms_Biofilms)，革蘭氏陰性(Gram Negative)，革蘭氏陽性(Gram Positive)，致病潛力(Potential_Pathogenic)，脅迫耐受(Stress_Tolerant)9種微生物表型。其中與好氧、移動(dòng)元件含量、生物膜形成、革蘭氏陰性、致病潛力、脅迫耐受等表型相關(guān)的細(xì)菌主要由變形菌門細(xì)菌構(gòu)成；與厭氧表型相關(guān)的細(xì)菌主要由擬桿菌門細(xì)菌構(gòu)成；革蘭氏陽性和兼性厭氧表型中的細(xì)菌則主要由放線菌門細(xì)菌構(gòu)成。此外，與低密度組相比，高密度組好氧細(xì)菌、移動(dòng)元件細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、致病性細(xì)菌和脅迫耐受細(xì)菌豐度較高，且高密度組有較多的生物膜形成，而厭氧細(xì)菌、兼性厭氧細(xì)菌和革蘭氏陽性細(xì)菌豐度較低。隨著養(yǎng)殖時(shí)間的增加，在低密度組下，好氧細(xì)菌、移動(dòng)元件細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌豐度降低，兼性厭氧細(xì)菌和革蘭氏陽性細(xì)菌豐度升高，厭氧細(xì)菌、生物膜形成、致病性細(xì)菌和脅迫耐受細(xì)菌豐度呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)；在高密度組下，好氧細(xì)菌、移動(dòng)元件細(xì)菌、兼性厭氧細(xì)菌、生物膜形成、革蘭氏陽性菌細(xì)菌豐度呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，厭氧細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌豐度呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)，致病性細(xì)菌、脅迫耐受細(xì)菌豐度降低。

圖5 BugBase物種柱狀圖

3 討論

3.1 基于門、屬水平下的菌群結(jié)構(gòu)和組間差異分析

根據(jù)門水平(左)的物種分布柱狀圖(圖1)和物種差異柱狀圖(圖2)可知，在整個(gè)養(yǎng)殖過程中，變形菌門和擬桿菌門為養(yǎng)殖水體中的優(yōu)勢(shì)菌，平均相對(duì)豐度占比90%以上?？赡苡捎趯?duì)蝦數(shù)量的增多，產(chǎn)生更多的代謝產(chǎn)物促進(jìn)了變形菌門細(xì)菌的滋生，從而導(dǎo)致高密度組的變形菌門細(xì)菌豐度高于低密度組；而高密度組擬桿菌門細(xì)菌豐度低于低密度組，可能由于低密度組養(yǎng)殖水體中有較多的餌料殘留，致使擬桿菌門細(xì)菌滋生。Ramon Rosselló-Mora等[16]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖環(huán)境中未被及時(shí)分解的殘留餌料會(huì)導(dǎo)致擬桿菌門細(xì)菌含量增加，然而具體實(shí)際情況還有待進(jìn)一步研究。變形菌門是海洋水體和沉積物中的主要類群[17]，其中的α-變形菌和β-變形菌能降解一部分對(duì)水體生物有害的烴類有機(jī)物[18]。擬桿菌門是海洋水體中重要的微生物類群，是溶解性有機(jī)物的主要消費(fèi)者[19]。這些大量存在的有機(jī)物降解菌群能促進(jìn)養(yǎng)殖水體中有機(jī)物降解，從而改善水生動(dòng)物的生長(zhǎng)環(huán)境。疣微菌門細(xì)菌大多都是不可培養(yǎng)的微生物，目前功能尚不明確[20]。

根據(jù)屬水平(右)的物種分布柱狀圖(圖1)和物種差異柱狀圖(圖3)可知，與門水平相比，優(yōu)勢(shì)菌發(fā)生了明顯變化。在低密度組和高密度組不同時(shí)期養(yǎng)殖水體中的優(yōu)勢(shì)菌為海命菌屬、uncultured_bacterium_c_Alphaproteobacteria、褐指藻菌屬、uncultured_bacterium_f_Saprospiac eae。uncultured_bacterium_c_Alphaproteobacteria和uncultured_bacterium_f_Saprospiaceae尚無準(zhǔn)確命名。海命菌屬下的細(xì)菌在海洋環(huán)境中大量存在，但大部分均用作微生物分類用途。褐指藻菌屬是色素的一個(gè)屬分類，隸屬于硅藻門，其屬下的三角褐指藻是許多水生生物的天然餌料。

3.2 α-多樣性指數(shù)分析

α-多樣性表明了每個(gè)樣品組的物種豐度(richness)和物種多樣性(diversity)，涵蓋了多個(gè)指數(shù)數(shù)據(jù)，具體包括Chao1、Ace、Shannon、Simpson、Coverage和PD_whole_tree指數(shù)，來分析養(yǎng)殖水體中的微生物群落的物種類型和豐富程度[21]。Chao1和Ace指數(shù)表示物種豐度(物種數(shù)量的多少)，Shannon和Simpson指數(shù)表示微生物種類的多少。在物種數(shù)量相同的情況下，菌群各個(gè)物種存在越高的均勻程度，則表明菌群的種類越多，物種豐富程度越高。Chao1和Ace數(shù)值越高，說明物種的數(shù)量越多，Shannon和Simpson數(shù)值越大，則說明物種種類越多，越豐富[22]。Coverage表示檢測(cè)物種的覆蓋率，它的數(shù)值越大，說明樣本中物種被檢出的概率越大，而沒被檢出的概率就越小。根據(jù)表2中的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析可知，在養(yǎng)殖過程中，AO組的物種豐度最高(低密度下第20天養(yǎng)殖水體中物種數(shù)量最多)，AT組的物種類型豐富程度最高(高密度下第20天養(yǎng)殖水體中物種種類最多)，BT組的物種數(shù)量和物種豐富程度最低(高密度下第40天養(yǎng)殖水體中的物種數(shù)量和物種種類最少)。通過Coverage指數(shù)反映的數(shù)據(jù)可知，各樣品組檢測(cè)物種覆蓋率均高于99%，充分反映了養(yǎng)殖水體中菌群種類和數(shù)量的實(shí)際狀況。

3.3 β-多樣性分析

β-多樣性分析用來對(duì)比不同樣品組之間的物種多樣性是否有相同特征，主要分為兩大類算法：加權(quán)(Bray-Curtis和Weighted Unifrac)與非加權(quán)(Jaccard和Unweightde Unifrac)。加權(quán)方法需要同時(shí)分析物種是否存在以及物種的數(shù)量這兩個(gè)因素，而非加權(quán)方法主要分析比對(duì)物種是否存在，如果兩個(gè)不同樣品菌群的β-多樣性越小，則表明物種類型越相似。微生物在環(huán)境中復(fù)雜多樣，呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化的趨勢(shì)，各物種的組成差異更為顯著，因此，在微生物多樣性分析中通常使用非加權(quán)方法分析。根據(jù)該實(shí)驗(yàn)的研究?jī)?nèi)容，選擇采用基于系統(tǒng)發(fā)生樹的非加權(quán)方法。由非加權(quán)主坐標(biāo)分析圖(圖4)可知，在養(yǎng)殖過程中，同一時(shí)期的養(yǎng)殖水體中物種類型相似度高，不同時(shí)期養(yǎng)殖水體中物種類型差異較大。

3.4 功能基因預(yù)測(cè)分析

BugBase是一種預(yù)測(cè)復(fù)雜微生物組內(nèi)功能途徑的生物水平覆蓋以及生物可解釋表型的方法[23-24]。該實(shí)驗(yàn)通過BugBase表型預(yù)測(cè)來揭示養(yǎng)殖水體中各個(gè)菌群的功能性狀對(duì)微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)變化的影響，結(jié)果表明，在養(yǎng)殖過程中，高密度組與低密度組相比，好氧細(xì)菌、移動(dòng)元件細(xì)菌、細(xì)菌生物膜形成、革蘭氏陰性細(xì)菌、致病性細(xì)菌和脅迫耐受細(xì)菌豐度較高，而厭氧細(xì)菌、兼性厭氧細(xì)菌和革蘭氏陽性細(xì)菌豐度較低，究其原因可能是在高密度組養(yǎng)殖水體中的變形菌門一類細(xì)菌豐度高于低密度組，而擬桿菌門細(xì)菌和放線菌門細(xì)菌豐度低于低密度組。隨著養(yǎng)殖時(shí)間的增加，低密度組部分變形菌門細(xì)菌豐度降低，放線菌門細(xì)菌豐度升高，擬桿菌門和部分變形菌門細(xì)菌豐度先降低，到養(yǎng)殖中期(養(yǎng)殖第40天后)細(xì)菌豐度升高，原因可能是在養(yǎng)殖初期，水體中對(duì)蝦代謝產(chǎn)物和殘留餌料較少，擬桿菌門和部分變形菌門細(xì)菌滋生較少，到了養(yǎng)殖中后期，隨著代謝產(chǎn)物和殘留餌料的增加，致使擬桿菌門和部分變形菌門滋生加快，厭氧和兼性厭氧型細(xì)菌豐度升高，致病性和脅迫耐受細(xì)菌豐度升高。在高密度下，部分變形菌門細(xì)菌豐度升高，到養(yǎng)殖中期(養(yǎng)殖第40天后)細(xì)菌豐度降低，好氧型和兼性厭氧型細(xì)菌豐度降低；部分放線菌門細(xì)菌豐度降低，到養(yǎng)殖中期(養(yǎng)殖第40天后)細(xì)菌豐度升高，厭氧型細(xì)菌豐度升高。另外，在高密度組下，致病性和脅迫耐受程度降低，原因可能是養(yǎng)殖水體中的有益菌含量增加，分解有機(jī)物和改善水質(zhì)的能力有所提高。

4 結(jié)論

該實(shí)驗(yàn)利用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)養(yǎng)殖水體中微生物菌群進(jìn)行多樣性分析，揭示了養(yǎng)殖環(huán)境中微生物群落多樣性以及變化情況，為凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中的水質(zhì)改善、疾病預(yù)防以及開發(fā)新的微生物物種資源提供理論依據(jù)。