李賀偉， 阮 鋒

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院， 湖北 武漢 430077)

骨肉瘤具有病情進(jìn)展快、轉(zhuǎn)移早、預(yù)后差、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，靶向治療是在特定導(dǎo)向機(jī)制作用下將藥物選擇性濃集定位于特定結(jié)構(gòu)，可提高腫瘤局部治療效果；靶向治療骨肉瘤藥物的研發(fā)及臨床應(yīng)用已經(jīng)取得一定療效，從基因角度入手找到精準(zhǔn)的靶向治療藥物是目前分子靶向治療研究的重點(diǎn)[1,2]。miRNA不僅影響骨肉瘤細(xì)胞的代謝，還參與骨肉瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，研究miRNA在骨肉瘤中的作用可為骨肉瘤的早期診斷和治療提供新的研究方向[3]。研究發(fā)現(xiàn)miR-142-3p在骨肉瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)均明顯下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-142-3p通過(guò)調(diào)控靶基因HMGA1的表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和遷移[4]。攜帶miR-142-3p的外泌體可通過(guò)抑制COX-2的表達(dá)來(lái)抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。Circular RNA Interactome在線軟件預(yù)測(cè)顯示circ_0000615和miR-142-3p有互補(bǔ)序列。circ_0000615是來(lái)源轉(zhuǎn)錄因子ZNF609的一種circRNA，位于chr15:64791491-64792365；研究報(bào)道circ-ZNF609高表達(dá)促進(jìn)腎癌細(xì)胞增殖和侵襲能力[5]。乳腺癌患者血漿中has_circ_0000615高表達(dá)，與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。circ_0000615在鼻咽癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，敲低circ_0000615抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[6]。然而circ_0000615對(duì)骨肉瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究circ_0000615可否通過(guò)調(diào)控miR-142-3p影響骨肉瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1臨床材料：選取2017年1月至2021年1月本院收治的60例骨肉瘤患者的骨肉瘤組織及瘤旁組織患者手術(shù)前未進(jìn)行過(guò)放化療，所有患者均經(jīng)病理學(xué)診斷確診為骨肉瘤，排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；全身系統(tǒng)性疾病者。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者及其家屬知情且簽署知情同意書(shū)。

1.1.2細(xì)胞與主要試劑：骨肉瘤細(xì)胞U2OS(美國(guó)ATCC)；Trizol試劑、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒(日本Takara公司)；蛋白提取試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒、四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT)比色法試劑盒(北京Solarbio公司)；Transwell小室、基質(zhì)膠(美國(guó)BD公司)；熒光素酶報(bào)告基因載體(美國(guó)Promega公司)。

1.1.3主要儀器：3550型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher)，AB7500 Real-Time PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems)。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞處理與分組：于RPMI-1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)骨肉瘤細(xì)胞U2OS，將circ_0000615干擾表達(dá)載體及陰性對(duì)照、miR-142-3p模擬物及陰性對(duì)照miR-NC轉(zhuǎn)染至U2OS細(xì)胞，記為si-circ_0000615組、si-NC組、miR-142-3p組、miR-NC組；將circ_0000615干擾表達(dá)載體分別與miR-142-3p抑制劑及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至U2OS細(xì)胞，記為si-circ_0000615+anti-miR-142-3p組、si-circ_0000615+anti-miR-NC組。

1.2.2RT-qPCR檢測(cè)circ_0000615和miR-142-3p表達(dá)：骨肉瘤組織、瘤旁組織、轉(zhuǎn)染的骨肉瘤細(xì)胞U2OS的總RNA采用Trizol試劑提取，根據(jù)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、隨后配置PCR反應(yīng)體系，檢測(cè)circ_0000615和miR-142-3p表達(dá)。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min，95℃變性15s，59℃退火15s，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。circ_0000615引物序列：F 5’-TTGGGAACTAAACCGGAGCC-3’，R 5’-GGACAACATCATTGCTTTTCAGAC-3’；GAPDH引物序列：F 5’-TATCGTGATGCTAGTCCGATG-3’，R 5’-TGCAGCTAGCTGCATCGATCGG-3’；miR-142-3p引物序列：F 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGG-3’，R 5’-CGACGTGTAGTGTTTCCTA-3’；U6引物序列：F 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，R 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.3MTT測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率：各組細(xì)胞培養(yǎng)48h，按試劑盒說(shuō)明操作，測(cè)定490nm處吸光度(OD)值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(%)。

1.2.4克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆數(shù)：將各組U2OS細(xì)胞接種于6孔板，調(diào)整細(xì)胞密度后取出相應(yīng)體積，統(tǒng)計(jì)每孔細(xì)胞數(shù)，每孔100個(gè)，培養(yǎng)2周，將甲醇、吉姆薩分別進(jìn)行固定與染色，細(xì)胞克隆數(shù)(>50個(gè)細(xì)胞)在光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計(jì)。

1.2.5Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)：遷移：U2OS用無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓24h，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，Transwell上室加入100μL上述細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24h，分別以甲醇、0.1%結(jié)晶紫進(jìn)行固定、染色，于顯微鏡下記數(shù)。侵襲：基質(zhì)膠包被Transwell上室，其余同遷移實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.6蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法：借助蛋白提取試劑盒獲得U2OS細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜，聚偏二氟乙烯膜封閉1h后，加入E-cadherin(美國(guó)Abcam)、N-cadherin(美國(guó)Abcam)和GAPDH抗體(美國(guó)Abcam)后4℃孵育12h，室溫加入二抗，孵育2h后化學(xué)發(fā)光液顯影，分析E-cadherin、N-cadherin蛋白條帶相對(duì)于GAPDH的灰度值。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)：分別將circ_0000615野生型/突變型(WT/MUT)熒光素酶載體與miR-142-3p模擬物或陰性對(duì)照miR-NC共轉(zhuǎn)染U2OS細(xì)胞，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒操作指南，測(cè)量熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1circ_0000615和miR-142-3p在骨肉瘤中的表達(dá)：骨肉瘤組織中circ_0000615表達(dá)水平高于瘤旁組織(2.06±0.33比1.00±0.18，t=21.843)，miR-142-3p表達(dá)水平低于瘤旁組織(0.44±0.10比1.06±0.13，t=27.865)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 骨肉瘤中circ_0000615和miR-142-3p表達(dá)

2.2沉默circ_0000615對(duì)U2OS增殖遷移侵襲的影響：與si-NC組相比，si-circ_0000615組circ_0000615表達(dá)水平降低，U2OS細(xì)胞抑制率升高，U2OS細(xì)胞克隆數(shù)、遷移侵襲數(shù)降低，E-cadherin表達(dá)升高，N-cadherin表達(dá)下降(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 沉默circ_0000615對(duì)U2OS增殖遷移侵襲的檢測(cè)

2.3circ_0000615靶向調(diào)控miR-142-3p：Circular RNA Interactome在線軟件預(yù)測(cè)顯示circ_0000615和miR-142-3p有互補(bǔ)序列，見(jiàn)圖3A。miR-142-3p與circ_0000615野生型報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3B；與si-NC組相比，si-circ_0000615組miR-142-3p表達(dá)水平升高(P<0.05)，見(jiàn)圖3C。

圖3 circ_0000615靶向調(diào)控miR-142-3p

2.4miR-142-3p抑制U2OS增殖遷移侵襲：與miR-NC組相比，miR-142-3p組U2OS細(xì)胞中miR-142-3p表達(dá)水平升高，細(xì)胞抑制率上升，U2OS細(xì)胞克隆數(shù)、遷移和侵襲數(shù)減少，E-cadherin表達(dá)水平升高，N-cadherin表達(dá)水平降低(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

2.5抑制miR-142-3p和circ_0000615誘導(dǎo)U2OS增殖遷移侵襲：與si-circ_0000615+anti-miR-NC組相比，si-circ_0000615+anti-miR-142-3p組U2OS細(xì)胞中miR-142-3p表達(dá)、U2OS細(xì)胞抑制率、E-cadherin表達(dá)降低，U2OS細(xì)胞克隆數(shù)、遷移侵襲數(shù)增加，N-cadherin表達(dá)升高(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

圖4 miR-142-3p對(duì)U2OS增殖遷移侵襲的檢測(cè)

圖5 抑制miR-142-3p和circ_0000615對(duì)U2OS增殖遷移侵襲的檢測(cè)

3 討 論

骨肉瘤是一種高度侵襲性的癌癥。最近，非編碼RNA在骨肉瘤中的失調(diào)引起了科學(xué)界的極大興趣。既往研究表明，circRNAs在多種癌癥中的作用，包括胃癌、結(jié)直腸癌等[7,8]。circ_0000615(circ-ZNF609)是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種circRNA，研究報(bào)道circ-ZNF609能促進(jìn)不同腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，例如宮頸癌[9]、胃癌[10]、膠質(zhì)瘤[11]。然而，circ_0000615在骨肉瘤中的表達(dá)和作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，骨肉瘤組織中circ_0000615高表達(dá)，提示circ_0000615可能與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，沉默circ_0000615后，U2OS細(xì)胞增殖和遷移侵襲能力下降，E-cadherin表達(dá)升高，N-cadherin表達(dá)降低，提示沉默circ_0000615可抑制U2OS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，與circ_0000615在鼻咽癌、宮頸癌、胃癌、膠質(zhì)瘤中的功能相吻合。

為深入研究circ_0000615在骨肉瘤中的作用機(jī)制，本研究通過(guò)在線軟件預(yù)測(cè)到miR-142-3p可能是circ_0000615的靶基因。研究報(bào)道m(xù)iR-142-3p在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和進(jìn)展有抑制作用[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-142-3p在骨肉瘤組織中低表達(dá)，且過(guò)表達(dá)miR-142-3p后，U2OS細(xì)胞增殖、遷移侵襲能力下降，N-cadherin表達(dá)降低，與前人報(bào)告吻合。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)circ_0000615靶向調(diào)控miR-142-3p；抑制miR-142-3p可減輕circ_0000615對(duì)U2OS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，提示沉默circ_0000615對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用的分子機(jī)制與靶向下調(diào)miR-142-3p表達(dá)相關(guān)。

綜上所述，沉默circ_0000615可通過(guò)靶向調(diào)控miR-142-3p抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。但關(guān)于其下游靶基因尚需下一步探究。