于 瑩王馨寧孫澤鑫蔣春姬趙新華于海秋王 婧

(沈陽農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院,遼寧 沈陽 110866)

植物組織感受到周圍環(huán)境變化時,可通過調控自身的代謝水平,維持細胞正常生理功能[1]。測定生理生化指標的變化是探討逆境下植物內(nèi)部生理特點變化的基礎,也是確定植物分子機制的關鍵。如何快速而準確地測定生理生化指標,對了解逆境下植物生理代謝變化具有重要意義,同時也可為確定植物對外界環(huán)境的響應機制提供重要信息[2-9]。課題組前期測定花生葉片和根系組織超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、丙二醛(MDA)、可溶性蛋白(SP)等抗氧化生理生化指標時,均采用傳統(tǒng)方法;而在試驗過程中發(fā)現(xiàn)該方法提取粗酶液的過程耗時、耗力,酶易失活,測定數(shù)據(jù)效率低、誤差較大。針對這些缺點,對傳統(tǒng)測定方法進行改進,例如,采用液氮凍樣,預冷組織研磨器,測定時等比例加入反應液及酶液。另外,改用酶標儀測定樣品吸光度,建立了SOD、POD、MDA、SP 等生理生化指標的快速測定方法。本文檢測了花生葉片及根系在干旱逆境處理條件下生理生化指標的變化,驗證了新方法的可行性和準確性,可在常規(guī)科研中使用。該測定方法具有節(jié)省材料、耗時短、準確率高等優(yōu)點,適合大批量花生組織的快速測定,為廣大科研工作者提供了改進方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料培養(yǎng)

試驗材料為花生,置于沈陽農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院幼苗培養(yǎng)室(光暗周期16 h/8 h,濕度60%,溫度晝28℃/夜23℃)進行培養(yǎng)。

1.2 植物組織預處理

花生幼苗培養(yǎng)至三葉一心期,用20%PEG-6000模擬干旱環(huán)境,分別在干旱脅迫后0、3、6、9、12、24 h進行取樣。

1.2.1 快速測定方法

將花生葉片和根部組織各取0.2 g剪碎,立即裝入內(nèi)有1～2粒直徑0.2 mm 鋼珠的2.0 mL離心管中,標好序號后放入-80℃超低溫冰箱中凍存。測定前將待測樣品從超低溫冰箱轉入液氮中至少0.5 h(圖1 a),裝入事先經(jīng)冷凍處理的組織研磨適配器中(48×2 mL)(圖1 b),利用高通量組織研磨器(SCIENTZ-48) 在60～70 Hz下研磨120～180 s(圖1 c)。研磨結束加入2 mL 4℃預冷的磷酸緩沖液(PBS,p H=7.8),利用旋渦震蕩儀(VETEX SHAKER QL-866)混勻(圖1 d),隨后在冷凍高速離心機(HEMA TGL-16R Refrigerated Centrifuge)13 000 r/min下離心15 min(圖1 e),上清液即為酶粗提液(圖1 f)。

圖1 快速測定方法的操作流程Fig.1 The procedure of rapid determination

1.2.2 傳統(tǒng)測定方法

將花生葉片和根部組織各取0.5 g裝入自封袋,做好標記放入-80℃超低溫冰箱中凍存。測定各項目之前,將待測樣品從超低溫冰箱中轉入4℃預冷的研缽中,加入石英砂和2 mL磷酸緩沖液(PBS,p H=7.8)于冰盒上手動研磨120 s,研磨成勻漿后倒入5 mL離心管中,并用3 mL磷酸緩沖液沖洗研缽,一同倒入離心管,利用高速落地冷凍離心機(Thermo Fisher SCIENTIFIC,LYNX4000)15 000 r/min離心20 min,上清液即為酶粗提液。

1.3 項目測定

1.3.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑(NBT)光化還原法[10]

反應液的配制和顯色反應過程,快速測定方法與傳統(tǒng)測定方法相同。

(1)測定步驟。

取50 mL小燒杯,加入顯色混合液2.95 mL,粗酶液0.05 mL,再取4個相同規(guī)格燒杯加入混合液2.95 mL和磷酸緩沖液0.05 mL,其中3個與樣品一同放入光照培養(yǎng)箱(照度6 000 lx)照光30 min,另外一個放入暗室作為對照,樣品照光30 min后取出放入暗室終止反應,以遮光的對照管作為空白調零,分別在560 nm 下測定各管吸光度值。

快速測定方法:每個樣品取0.3 mL 待測液加入酶標板,于酶標儀(Thermo SCIENTIFIC,MULTISKAN GO)中測定。

傳統(tǒng)測定方法:每個樣品取3 mL 待測液加入比色皿中,放進紫外/可見分光光度計(PerkinElmer,Lambda 365)中進行測定。

(2)兩種方法結果計算公式一致。

1.3.2 過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[10]

(1)反應液的配制。

快速測定方法:0.1 mol/L pH=6.0的磷酸緩沖液50 mL加入燒杯中,加入愈創(chuàng)木酚28μL,水浴加熱搖勻直至愈創(chuàng)木酚完全溶解,測定前加入30%的過氧化氫19μL,充分溶解后,將反應液分裝到2 mL離心管中,置于37℃溫浴器中5～8 min。

傳統(tǒng)測定方法:0.1 mol/L pH=6.0的磷酸緩沖液100 mL加入燒杯中,加入愈創(chuàng)木酚56μL,水浴加熱搖勻直至愈創(chuàng)木酚完全溶解,測定前加入30%的過氧化氫38μL,充分溶解后,置于37℃水浴鍋中待用。

(2)測定步驟。

快速測定方法:分別吸取0.005 mL酶粗提液并加入0.295 mL反應液于酶標板中,波長470 nm下,從反應0 s開始,每30 s測定一次吸光度,共計6 個數(shù)值,即測定150 s終止,記錄150 s內(nèi)ΔA470變化。以0.295 mL 反應液加0.005 mL緩沖液對照調零。

傳統(tǒng)測定方法:分別吸取0.05 mL酶粗提液并加入2.95 mL反應液于比色皿中,波長470 nm下,從反應0 s開始,每30 s測定一次吸光度,共計6 個數(shù)值,即測定150 s終止,記錄150 s內(nèi)ΔA470變化。以29.5 mL反應液加0.05 mL 緩沖液對照調零。

(3)兩種方法結果計算公式一致。

1.3.3 丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸比色法(TBA)[10]

(1)反應液的配制。

快速測定方法與傳統(tǒng)測定方法此步驟相同。

(2)測定步驟。

快速測定方法:選取新的2 mL離心管編號,分別往新離心管中加入粗提取液0.3 mL和0.5%的TBA 0.3 mL,沸水浴15 min,迅速冷卻后離心(8 000 r/min,10 min),每個樣品吸取0.3 mL上清液加到酶標板中,在波長532 nm、600 nm 下測定吸光度值。

傳統(tǒng)測定方法:選取新的5 mL離心管編號,分別往新離心管中加入粗提取液1.5 mL和0.5%的TBA 1.5 mL,沸水浴15 min,迅速冷卻后離心(8 000 r/min,10 min),上清液移至比色皿中,在波長532 nm、600 nm 下測定吸光度值。

(3)兩種方法結果計算公式一致。

1.3.4 可溶性蛋白質(SP)含量測定采用考馬斯亮藍染色法[10]

(1)反應液的配置和標準曲線配制。

快速測定方法與傳統(tǒng)測定方法此步驟相同。

(2)測定步驟。

快速測定方法:分別吸取0.29 mL 考馬斯亮藍溶液和0.01 mL 酶粗提取液加入酶標板中混勻,反應2 min,595 nm 波長下比色,以0.29 mL考馬斯亮藍溶液加0.01 mL 磷酸緩沖液(0.05 mol/L pH=7.8)對照調零。

傳統(tǒng)測定方法:分別吸取2.9 mL 考馬斯亮藍溶液和0.1 mL 酶粗提取液置于比色皿中混勻,反應2 min,595 nm 波長下比色,以2.9 mL考馬斯亮藍溶液加0.1 mL 磷酸緩沖液(0.05 mol/L pH=7.8)對照調零。

(3)兩種方法結果計算公式一致。

2 結果與分析

2.1 快速測定方法與傳統(tǒng)測定方法的測定數(shù)據(jù)對比分析

分別使用快速測定方法和傳統(tǒng)測定方法做重復性試驗,具體結果如表1、表2所示。

2.1.1 花生根系不同抗氧化指標測定數(shù)據(jù)的差異顯著性分析

對兩種測定方法在花生根系中測定的試驗數(shù)據(jù)進行t檢驗分析,判斷兩種方法得到的數(shù)據(jù)是否存在顯著性差異(表1)。數(shù)據(jù)分析表明,SOD、POD、MDA 和SP指標的t檢驗概率事件數(shù)值分別為0.98,1.00,0.88和0.08,均大于0.05,說明快速測定方法與傳統(tǒng)測定方法測定的結果差異不顯著,快速測定方法可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法測定花生組織中的抗氧化生理生化指標。

表1 兩種方法測定根系抗氧化指標的結果差異性比較Table 1 Comparison of the difference of antioxidant indexes in root with two methods

2.1.2 花生葉片不同抗氧化指標測定數(shù)據(jù)的差異顯著性分析

對兩種測定方法在花生葉片中測定的試驗數(shù)據(jù)進行t檢驗,判斷兩種方法得到的數(shù)據(jù)是否存在差異顯著性(表2)。數(shù)據(jù)分析表明,SOD、POD、MDA 和SP指標的t檢驗概率事件的數(shù)值分別為0.81,0.96,0.85和0.97,均大于0.05,說明快速測定方法與傳統(tǒng)測定方法測定的結果差異不顯著,快速測定方法可代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法測定花生組織中的抗氧化生理生化指標。

表2 兩種方法測定葉片抗氧化指標的結果差異性比較Table 2 Comparison of the difference of antioxidant index in leaves with two methods

2.2 快速測定方法與傳統(tǒng)測定方法的用時對比

表3可見,快速測定方法和傳統(tǒng)測定方法研磨樣品及測定時所需的理論時間差異,其中快速測定方法研磨70個樣品所需時間120～300 s(圖2 a),當天測定4個生理生化指標理論耗時約2.0～2.5 h;傳統(tǒng)測定方法研磨1個樣品的時間為120 s(圖2 b),研磨70個樣品所需時間約8 400 s,當天測定4個生理生化指標理論耗時約7.0～8.1 h。

圖2 快速測定方法和傳統(tǒng)測定方法研磨樣品用時及樣品數(shù)量對比Fig.2 Comparison of required ground time and sample number between rapid measurement method and traditional measurement method

表3 快速測定方法和傳統(tǒng)測定方法的理論用時對比Table 3 Comparison of theoretical required time between rapid measurement method and traditional measurement method

但在實際操作中,使用快速測定方法當天檢測4個生理生化指標時,研磨過程可在5 min內(nèi)完成,加上配制反應液等步驟,大約耗時10～12 h。

而傳統(tǒng)測定方法往往耗時更久,研磨過程主要在冰盒上完成,不僅樣品易失活而且耗費人力。當天檢測70個樣品的4個生理生化指標,需耗時24～30 h。而且在指標測定過程中,需要及時清洗比色皿,逐步進行不同項目的測定,等待軟件運行,消耗更多時間。因此,可以看出快速測定方法的用時約為傳統(tǒng)測定方法的一半;另外,快速測定方法研磨出的樣品勻漿液的均勻度高于傳統(tǒng)測定方法,可降低同一批次數(shù)據(jù)誤差 (圖3)。

圖3 快速測定方法(左)和傳統(tǒng)測定方法(右)樣品均一度對比Fig.3 Uniformity comparison of grinding sample between rapid measurement method (left)and traditional measurement method (right)

3 討論

本文介紹的花生組織抗氧化生理生化指標測定方法快速直接,與傳統(tǒng)測定方法相比具有以下優(yōu)點:

①減少樣品用量。傳統(tǒng)測定方法通常選取0.5 g樣品,設三個重復進行測定;而實際操作中往往遇到試驗材料數(shù)量有限、樣品量不足的問題?？焖贉y定方法僅需0.2 g樣品,三個重復可在24 h內(nèi)同時測定出SOD、POD、MDA、SP等多個生理生化指標的數(shù)值,測定時吸取的酶液僅為傳統(tǒng)測定方法的1/10左右,反應液用量也按比例減少,降低了樣品和反應液的使用量;相比傳統(tǒng)方法在節(jié)約樣品的同時也節(jié)省了試驗費用(圖3)。由于取樣量較常規(guī)方法減少一半,相對增加了組織特異性誤差,可在實際操作中增加樣品取樣分布點,增加生物學重復及技術性重復,平衡樣品取樣量較少的問題。

②節(jié)省研磨樣品時間。傳統(tǒng)測定方法試驗過程操作繁瑣,耗時長,僅研磨組織樣品這一環(huán)節(jié)就需花費大量時間,平均手工研磨一個樣品需要2 min。雖全程在冰盤上操作,但周圍環(huán)境溫度不穩(wěn)定,且研磨過程中產(chǎn)生的熱量可使樣品中酶的活性發(fā)生改變進而影響最終測定結果,因此傳統(tǒng)方法測定結果受外界因素影響較大。而快速方法取樣前已在離心管中加入鋼珠,采集的花生組織也在極短時間內(nèi)裝入離心管并凍存于超低溫冰箱中;研磨時將離心管直接放進預冷的適配器中,5 min即能夠完成70個樣品的研磨工作,操作簡單快捷,節(jié)省人工 (圖1,圖2,表3)。

③研磨更加徹底。傳統(tǒng)測定方法操作中采用人工研磨樣品,導致樣品間存在較大差異,且有些樣品如生育后期的根系、莖稈具有一定的韌性,不易磨碎,增加了試驗人員的操作難度,對測定結果造成很大影響;而快速檢測方法利用液氮及預冷的組織研磨儀對樣品進行冷凍研磨,每個離心管中放入相同數(shù)量及大小(0.2 mm)的鋼珠,研磨環(huán)境相同,研磨時間相同,減少了樣品間在磨樣過程中產(chǎn)生的操作誤差,且與人工研磨相比,更加均勻徹底(圖3)。通常在樣品數(shù)量大的情況下,試驗人員使用傳統(tǒng)方法檢測時需要提前一天將所有樣品研磨完畢,然后放入4℃冰箱進行保存。由于抗氧化酶系統(tǒng)的酶類物質從細胞釋放出來后對溫度比較敏感,傳統(tǒng)方法的操作流程會因為酶的活性下降而影響試驗數(shù)據(jù)的準確性。而快速檢測方法能在短時間內(nèi)解決大量樣品的研磨問題,可在當天檢測研磨出的樣品,減少試驗誤差。此外,通過對測定結果的統(tǒng)計學分析,證明了兩種方法獲得的數(shù)據(jù)差異不顯著 (表1,表2)。

手工研磨樣品,利用分光光度計測定樣品吸光度是當前植物組織生理試驗中普遍使用的方法,但該方法操作復雜,效率較低。本文對傳統(tǒng)測定方法進行了改進,在保證測定結果合理、準確的同時,優(yōu)化了樣品用量和試劑使用量,降低了科研工作者的工作強度,契合降本控費、提質增效的理念。此外,數(shù)據(jù)經(jīng)過t檢驗證明兩種方法測得的數(shù)據(jù)差異不顯著。同時該快速測定方法也可用于單雙子葉作物等微量組織的生理生化指標測定。因此,快速測定方法可代替?zhèn)鹘y(tǒng)測定方法廣泛應用于植物組織生理生化指標的測定。

致謝:感謝沈陽農(nóng)業(yè)大學大豆研究所姚興東老師在快速測定方法建立過程中提供的幫助,感謝杜琪(現(xiàn)任職河北省農(nóng)林科學院,濱海農(nóng)業(yè)研究所)博士期間對傳統(tǒng)測定方法的驗證。