趙小波閆彩霞李春娟黨彥學(xué)孫全喜王 奇邱俊蘭單世華*

(1.山東省花生研究所,山東 青島 266100;2.臨沂市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,山東 臨沂 276003;3.威海市農(nóng)業(yè)農(nóng)村事務(wù)服務(wù)中心,山東 威海 264200)

花生(ArachishypogaeaL.)是世界四大油料作物之一,在100多個(gè)國(guó)家廣泛種植,主要分布在亞洲、非洲和美洲地區(qū)。我國(guó)是世界花生生產(chǎn)大國(guó),占世界花生總產(chǎn)的40%以上,居世界第一位[1]。2021年中央1號(hào)文件明確指出發(fā)展花生等油料作物。我國(guó)鹽堿土面積占耕地總面積的6.2%,目前利用率僅20%左右[2]。通過(guò)培育耐鹽品種,充分利用鹽堿土地種植花生,擴(kuò)大花生種植面積,是提高花生總產(chǎn)的重要途徑之一。通過(guò)對(duì)花生種質(zhì)耐鹽性的評(píng)價(jià)研究表明,花生對(duì)鹽脅迫具有一定的耐受性[3],目前花生耐鹽基因利用方面的研究較少,通過(guò)分子生物學(xué)方法研究花生耐鹽機(jī)制具有重要意義。

bHLH(basic Helix-Loop-Helix)轉(zhuǎn)錄因子家族廣泛存在于真核生物,是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[4]。bHLH 結(jié)構(gòu)域可分為堿性氨基酸區(qū)(10～15個(gè)氨基酸)和α-螺旋-環(huán)-α-螺旋區(qū)(HLH 區(qū),40個(gè)氨基酸左右)[5]。越來(lái)越多的研究表明,該轉(zhuǎn)錄因子參與植物眾多的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。另外,大量的研究表明,bHLH 轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境脅迫響應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮重要作用。擬南芥轉(zhuǎn)錄因子ICE1(Inducer of CBF expression1,bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族成員)通過(guò)結(jié)合CBF啟動(dòng)子調(diào)節(jié)下游相關(guān)基因表達(dá),從而響應(yīng)低溫脅迫[6];AtbHLH92[7]、SlbHLH22[8]、bHLH122[9]等轉(zhuǎn)錄因子均通過(guò)ABA 通路調(diào)節(jié)以及提高抗氧化防護(hù)機(jī)制提高植株耐鹽性。此外,bHLH 轉(zhuǎn)錄因子參與植物鹽脅迫響應(yīng)還有其他途徑,例如ZmbHLH55通過(guò)提高抗壞血酸的生物合成提高植株耐鹽性[10]。前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)鹽脅迫時(shí),花生轉(zhuǎn)錄因子AhbHLH18是表達(dá)量顯著提高的轉(zhuǎn)錄因子之一[11]。本研究驗(yàn)證了花生轉(zhuǎn)錄因子AhbHLH18的功能,并分析了其作用機(jī)制,為深入研究花生耐鹽分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)錄因子克隆

以耐鹽花生品種花育6303為研究對(duì)象。加Hoagland氏培養(yǎng)液于28℃,濕度60%,光照強(qiáng)度500μmol/(m2·s)條件下培養(yǎng)。種子培養(yǎng)21 d后,于200 mmol/L NaCl溶液分別處理0、4、8、12、24 h后取根部組織,液氮冷凍后保存于-80℃冰箱以用于RNA 提取[12]。使用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒(TaKaRa,大連寶生物)提取根部RNA,并利用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa,大連寶生物)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,參考peanutbase(www.peanutbase.org)上的序列設(shè)計(jì)引物(表1)。反應(yīng)程序?yàn)?94℃,5 min。隨后30個(gè)循環(huán)設(shè)為:94℃,30 s;56℃,50 s;72℃,1 min。最后72℃,8 min。

1.2 目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)分析

根據(jù)擴(kuò)增得到的序列,用Beacon Designer 7.0設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異引物(表1)。以鹽脅迫處理后0、4、8、12、24 h的根部組織為樣本,以0 h樣本為對(duì)照,使用7500 FAST熒光定量PCR儀(ABI公司)分析AhbHLH18的相對(duì)表達(dá)情況。反應(yīng)條件:95℃,10 s;95℃,5 s;60℃,30 s;72℃,10 s;40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)設(shè)置3 次重復(fù)。相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCT方法[13],選擇Actin 11作為內(nèi)參基因[14],試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS12.0 分析(SPSS Inc.,Chicago,USA)。

1.3 進(jìn)化比較與生物信息學(xué)分析

AhbHLH18氨基酸序列與擬南芥基因組中已有序列信息[15]進(jìn)行比對(duì)。然后利用Clustal W軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行人工對(duì)齊排序。選擇Kimura2-parameter公式計(jì)算遺傳距離。MEGA6.0中采用鄰近法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù),自舉值Bootstrap為1000次重復(fù)。DNAMAN軟件對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析。

1.4 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

提取耐鹽品種花育6303總RNA,反轉(zhuǎn)錄成總cDNA。利用表1引物,以cDNA為模板,擴(kuò)增花生AhbHLH18基因。反應(yīng)程序?yàn)?94℃,5 min;隨后30個(gè)循環(huán)為:94℃,1 min;57℃,50 s;72℃,50 s;最后72℃,10 min。用SacI和XbaI雙酶切載體pCAMBIA2300,T4連接酶將酶切產(chǎn)物與擴(kuò)增產(chǎn)物連接至DH5α感受態(tài)細(xì)胞,篩選陽(yáng)性克隆,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101,然后利用花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥[16]。

表1 研究所用引物Table 1 Primers used in this research

1.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選與鑒定

將收獲的轉(zhuǎn)AhbHLH18轉(zhuǎn)錄因子的擬南芥T0代種子,播種于含卡那霉素50μg/mL 的MS培養(yǎng)基上,4℃黑暗放置1～2 d后,轉(zhuǎn)至光周期16 h/8 h(光照/黑暗)條件下培養(yǎng)1個(gè)月,提取其基因組DNA 與RNA,利用引物18-CDS-F、18-CDS-R 進(jìn)行PCR與RT-PCR檢測(cè)。對(duì)檢測(cè)合格的株系保種繁殖,直至獲得T3代植株。

1.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽性檢測(cè)

野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥種子放置于4℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d,進(jìn)行春化作用。隨后,種子轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)條件設(shè)置為:晝夜節(jié)律16 h/8 h,溫度22℃,光照強(qiáng)度200μmol/(m2·s),相對(duì)濕度65%。培養(yǎng)20 d 后,用400 mmol/L NaCl溶液進(jìn)行鹽脅迫處理10 d,檢測(cè)野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥鹽脅迫下POD(過(guò)氧化物酶)、SOD(過(guò)氧化物歧化酶)、CAT(過(guò)氧化氫酶)活性和MDA(丙二醛)含量[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子序列與表達(dá)分析

測(cè)序結(jié)果表明,AhbHLH18 轉(zhuǎn)錄因子的編碼區(qū)(coding sequence,CDS)為585 bp,共編碼194個(gè)氨基酸,與栽培花生基因組(www.peanutbase.org)中的arahy.5IZP5X 序列一致。該基因位于栽培花生第18號(hào)染色體,長(zhǎng)度為1 501 bp。編碼氨基酸中絲氨酸、亮氨酸、賴氨酸含量居前三位,分別為26、22和21個(gè),占比分別為11.16%、9.44%和9.01%。AhbHLH18蛋白的分子量為26.147 k D,等電點(diǎn)為10.27,圖1為其二級(jí)結(jié)構(gòu)。進(jìn)化分析顯示AhbHLH18蛋白質(zhì)與擬南芥同源基因AtbHLH18 蛋白(At2g22750)聚成一支。按照Toledo-Oritiz[15]的分類(lèi)模式,AtbHLH18蛋白屬于14 亞家族,因此AhbHLH18 也屬于bHLH 家族14亞家族 (圖2)。

圖1 AhbHLH18氨基酸序列二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.1 Secondary structure of AhbHLH18 amino acids

圖2 基于擬南芥基因組的AhbHLH18系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic analyses of AhbHLH18 protein based on bHLH domains from A rabidopsis thaliana

鹽脅迫處理后,AhbHLH18轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)有明顯變化(圖3)。12 h內(nèi),AhbHLH18轉(zhuǎn)錄因子的相對(duì)表達(dá)量處于上升階段,12 h后趨于穩(wěn)定。相比0 h,6 h的相對(duì)表達(dá)量為顯著差異(P＜0.05),12～48 h的表達(dá)量為極顯著差異(P＜0.01)。

圖3 Ahb HLH 18鹽脅迫處理后表達(dá)模式Fig.3 Expression of Ahb HLH 18 under salt stress

2.2 植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-AhbHLH18的構(gòu)建與轉(zhuǎn)基因植株的篩選與鑒定

用SacI和XbaI雙酶切載體pCAMBIA2300和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,T4 連接酶連接,構(gòu)建了植物超表達(dá)載體。利用基因特異引物進(jìn)行PCR 檢測(cè),在轉(zhuǎn)基因擬南芥株系(T3-1與T3-2)中可以擴(kuò)增到約700 bp的條帶,而在野生型擬南芥株系中未見(jiàn)對(duì)應(yīng)條帶(圖4)。RT-PCR 檢測(cè)進(jìn)一步表明,AhbHLH18 在轉(zhuǎn)基因擬南芥中已成功表達(dá) (圖5)。

圖4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR 檢測(cè)Fig.4 Detection of transgenic lines A rabidopsis thaliana by PCR

圖5 轉(zhuǎn)基因與野生型(WT)擬南芥RT-PCR 檢測(cè)Fig.5 The transcript level of AhbHLH18 overexpression in transgenic Arabidopsis and wild type(WT)plants assayed by RT-PCR

2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽性檢測(cè)

正常條件下,野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥表型無(wú)差異。鹽脅迫處理10 d后野生型擬南芥表現(xiàn)出更加明顯的萎蔫狀態(tài)(圖6)。正常條件下,野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥中的抗氧化酶、MDA 含量無(wú)顯著差異。鹽脅迫處理后,轉(zhuǎn)基因擬南芥各類(lèi)抗氧化酶如SOD、POD 和CAT 活性顯著高于野生型,野生型擬南芥的MDA 含量則顯著高于轉(zhuǎn)基因擬南芥(圖7)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,抗氧化酶活性的增長(zhǎng)在AhbHLH18基因應(yīng)答鹽脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用?；ㄉ鶤hbHLH18基因可調(diào)節(jié)植物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)以應(yīng)答鹽脅迫環(huán)境。

圖6 鹽處理轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥Fig.6 Salt-treatment assay of wild type and transgenic Arabidopsis plants

圖7 不同條件野生型擬南芥與轉(zhuǎn)基因擬南芥的生理指標(biāo)變化Fig.7 The change of physiological indexes of the wild type and transgenic Arabidopsis plants under normal and salt stress condition

3 討論與結(jié)論

bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族被認(rèn)為廣泛參與了植物非生物脅迫應(yīng)答活動(dòng),包括干旱脅迫[18-19]、鹽脅迫[22-21]以及低溫脅迫[22-23]。但在花生中,相關(guān)研究仍然缺乏。本研究克隆了花生bHLH 轉(zhuǎn)錄因子AhbHLH18。進(jìn)化分析顯示,AhbHLH18 蛋白質(zhì)與擬南芥AtbHLH18(At2g22750)具有較近的親緣關(guān)系,屬于bHLH 家族14亞族。柑橘CsbHLH18 被認(rèn)為由低溫所誘導(dǎo),過(guò)表達(dá)CsbHLH18顯著提高了柑橘的耐冷性,沉默CsbHLH18則顯著降低了柑橘的耐冷性[24]。通過(guò)植物超表達(dá)載體構(gòu)建,將花生AhbHLH18 基因轉(zhuǎn)入擬南芥中,鹽脅迫試驗(yàn)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)該基因可提高植株耐鹽性。進(jìn)一步分析,轉(zhuǎn)基因擬南芥鹽脅迫處理后,一些抗氧化酶,如POD、SOD 和CAT 活性顯著高于野生型擬南芥,同時(shí)MDA含量顯著低于野生型擬南芥。結(jié)果顯示,AhbHLH18可通過(guò)調(diào)節(jié)過(guò)氧化物酶系統(tǒng)以降低植株的活性氧(reactive oxygen species,ROS)活性,從而提高植株的耐鹽性。ROS能夠破壞植物細(xì)胞元件,植物的抗逆性很大程度上取決于ROS的產(chǎn)生與消除之間的平衡[25]。研究表明,大量的基因可通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性從而提高植株的抗逆性。Magwanga等發(fā)現(xiàn),擬南芥中超表達(dá)CYP450基因,可以提高轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性和耐鹽性,轉(zhuǎn)基因植株抗氧化酶活性顯著高于野生型擬南芥[26];通過(guò)提高過(guò)氧化酶活性,轉(zhuǎn)錄因子NtERF172能夠提高煙草抗旱性[27]。除過(guò)氧化酶系統(tǒng)外,bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族成員也可以通過(guò)其他方式影響植株的耐鹽性。AtMYC2 可調(diào)節(jié)Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NHX 的表達(dá),提高擬南芥耐鹽性[28];水稻bHLH 轉(zhuǎn)錄因子OrbHLH001 通過(guò)調(diào)節(jié)OsAKT1基因的表達(dá)以保持植株鉀離子平衡,從而提高植株的耐鹽性[29]。

現(xiàn)有研究表明,轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物分子抗逆機(jī)制是一個(gè)極其復(fù)雜的動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò),其中包括整合以及協(xié)同競(jìng)爭(zhēng)作用。下一步的工作應(yīng)該是在這個(gè)動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)中,明確不同bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族成員的精準(zhǔn)角色,從而為通過(guò)基因工程手段充分利用轉(zhuǎn)錄因子提高植物的抗逆性發(fā)揮更大作用。