邵元元 李勁峰 李 霞 葉添梅 鄒湘月 李飛鳴 何小玲 李麗蓉 米雅蘭 張 曉 顏新培

(1湖南省蠶桑科學(xué)研究所，湖南長沙 410127； 2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410128； 3植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙 410128； 4國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南長沙 410128； 5云天閣茶業(yè)有限公司，湖南益陽 413599)

桑葉是藥食同源的植物葉片。李時(shí)珍在《本草綱目》中記載，桑葉可用于治療消瘦干渴(消渴)綜合征，該病現(xiàn)已被公認(rèn)為是典型的糖尿??；在韓國和日本，糖尿病患者以食用桑葉作為抗高血糖的補(bǔ)充劑[1]。現(xiàn)代研究表明，桑葉中不僅含有蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)[2]，而且含有多糖、黃酮、生物堿、多酚、類固醇和香豆素等[3]活性成分，其中1-脫氧野尻霉素(1-Deoxynojirimycin，DNJ)為?？浦参锷Ｈ~特有的且含量較高的降糖物質(zhì)。桑葉能促進(jìn)糖代謝，改善胰島素抵抗，是治療糖尿病的有效天然產(chǎn)物之一[4-6]，同時(shí)桑葉還具有預(yù)防心血管疾病[7]，改善高血壓癥[8]，保護(hù)肝腎和胰腺[9-10]，改善腸道菌群[11]等功效，但由于桑葉青澀味較重且口感不佳，制約了桑葉作為飲品的發(fā)展。茯磚茶是安化黑茶獨(dú)特的發(fā)酵茶，其活性成分豐富，包括茶多糖、茶多酚、兒茶素、氨基酸、生物堿等[12]，具有抗肥胖和降血脂等作用，而且口感醇厚并有獨(dú)特的菌花香，廣受國內(nèi)外消費(fèi)者喜愛[13-15]，但茯磚茶降血糖作用不強(qiáng)。為了增加傳統(tǒng)茯磚茶的功能，消除桑葉的青澀味，我們將桑葉和茶葉混合制成桑葉茯磚茶，以實(shí)現(xiàn)健康飲用的目的。本文對桑葉茯磚茶的水浸出物、多酚類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)、游離氨基酸、可溶性糖、γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid，GABA)、DNJ，以及兒茶素組分、糖組分等理化品質(zhì)進(jìn)行測定和分析，確定桑葉茯磚茶的品質(zhì)特征，以期為促進(jìn)桑葉茯磚茶作為保健飲品推廣與銷售奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試毛茶 安化黑毛茶(FM)，由湖南省安化縣云天閣茶業(yè)有限公司提供；桑葉黑毛茶(SM)，由湖南省瀘溪縣南方蠶繭有限責(zé)任公司提供。

1.1.2 主要試劑 甲醇、碳酸鈉、福林酚、沒食子酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、茚三酮、氯化亞錫、谷氨酸、三氯化鋁、蒽酮、濃硫酸、無水葡萄糖、四硼酸鈉、氫氧化鈉、三水乙酸鈉、三乙胺、冰乙酸、鹽酸，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈、乙酸，色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；2，4-二硝基氟苯，98%，上海吉至生化科技有限公司產(chǎn)品；甘氨酸，分析純，卡邁舒(上海)生物科技有限公司產(chǎn)品；GABA標(biāo)準(zhǔn)品、DNJ標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 烘箱(DHG-9140)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；水浴鍋(HWS24)，北京國華醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；分析天平(AS220/C/1)，瑞士賽多利斯公司產(chǎn)品；電磁爐(C21-Simple103)，美的集團(tuán)產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)(UV2600)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；漩渦儀(XW-80A)，上海精科實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；離心機(jī)(TGL-21M)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；高效液相色譜儀(LC-20AT)，日本島津公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)試劑的配制 (1)pH=9.0四硼酸鈉緩沖液的配制。稱取4.767 9 g四硼酸鈉，用水溶解并定容到250 mL容量瓶中，配成0.05 mol/L四硼酸鈉溶液；稱取1.236 8 g硼酸，用水溶解并定容到100 mL容量瓶中，配成0.20 mol/L硼酸溶液；將0.05 mol/L四硼酸鈉溶液與0.20 mol/L硼酸溶液按4∶1混合即得pH=9.0四硼酸鈉緩沖液。(2)pH=7.0磷酸鹽緩沖液的配制。稱取4.0 g氫氧化鈉，用水溶解并定容到1 000 mL容量瓶中，配成0.10 mol/L氫氧化鈉溶液；稱取1.7 g磷酸二氫鉀，轉(zhuǎn)入500 mL容量瓶中，用約300 mL水溶解移取0.10 mol/L氫氧化鈉溶液72.75 mL加入容量瓶中，混勻，再用水稀釋至刻度線即得pH=7.0磷酸鹽緩沖液。

1.2.2 磚茶的制作工藝 茯磚茶(F)由FM制作而成；桑葉磚茶(S)由SM制作而成；桑葉茯磚茶(SF)由SM與FM按1∶3的質(zhì)量比混合加工而成。3種磚茶的加工工藝如圖1所示。

圖1 桑葉茯磚茶等3種磚茶的制作流程

1.2.3 茶葉感官審評 (1)茶葉外形審評。參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》[16]審評磚茶外形的松緊度、均勻度、表面光潔度、色澤和規(guī)格。將茶磚解散分開，審評發(fā)花情況，并檢視夾雜物和有無其他雜霉等。(2)茶葉內(nèi)質(zhì)審評。將茶磚分散開，稱取有代表性的茶樣3 g，將茶置于審評杯中，注滿100 ℃沸水，加蓋浸泡8 min。按沖泡順序依次等速將杯內(nèi)茶湯瀝入審評碗內(nèi)，從湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)系挑選5名高級評茶員參與感官評價(jià)，然后依次審評香氣、湯色、滋味和葉底。黑茶感官審評因子評分系數(shù)是外形占20%、湯色占10%、香氣占30%、滋味占35%、葉底占5%，最后計(jì)算出綜合評分(去掉1個(gè)最高分和1個(gè)最低分，其余3名高級評茶員的總分除以3)。

1.2.4 主要理化指標(biāo)檢測 (1)常規(guī)化學(xué)組分測定。水分按GB/T 8304—2013《茶 水分測定》[17]標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，水浸出物按GB/T 8305—2013《茶 水浸出物測定》[18]標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，游離氨基酸按GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測定》[19]標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，多酚按GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》[20]標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，黃酮含量按三氯化鋁比色法[21]測定，可溶性糖含量按蒽酮比色法[22]測定。(2)兒茶素和生物堿組分測定。參照王麗麗等[23]的方法進(jìn)行。(3)糖組分測定。參照張晨宇等[24]的方法進(jìn)行。(4)GABA測定。參照滕杰等[25]的方法進(jìn)行。將樣品粉碎，稱0.3 g茶粉在15 mL離心管中，加入10 mL沸水，在80 ℃條件下提取20 min，每5 min晃動1次，冷卻至室溫，3 500 r/min離心10 min，上清轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，重復(fù)前面的步驟，合并濾液，用水定容至25 mL作為待測液，取200 μL待測液，加200 μL的四硼酸鈉緩沖液，20 μL的2，4-二硝基氟苯，封口膜密封，混勻，60 ℃暗處水浴1 h，冷卻至室溫，加400 μL磷酸鹽緩沖液，過0.22 μm膜，上機(jī)檢測。(5)DNJ測定。參照KIM J W等[26]的方法進(jìn)行。將樣品粉碎，準(zhǔn)確稱量樣品1 g置于10 mL的離心管中，加入5 mL 0.05 mol/L鹽酸渦旋1 min，混勻后超聲40 min，6 000 r/min離心25 min，取上清液于10 mL容量瓶中，將沉淀重復(fù)提取1次，合并2次上清液，加0.05 mol/L鹽酸定溶至10 mL作為待測液，等待衍生，取0.1 mL待測液于5個(gè)1.5 mL離心管中，依次加入0.1 mL的0.4 mol/L硼酸鉀，0.2 mL的5 mmol/L 9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)，渦旋混勻，放入25 ℃水浴鍋中反應(yīng)20 min，取出后分別加入0.1 mL的1 mol/L甘氨酸、0.1 mL的1%冰乙酸、0.4 mL蒸餾水終止反應(yīng)，10 000 r/min離心5 min，過0.45 μm膜，上機(jī)檢測。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用SPSS 22對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，使用t檢驗(yàn)和LSD法多重比較評估組間差異。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉茯磚茶等3種磚茶的感官審評

感官審評結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，滋味：SF的湯色棕紅尚亮，菌香較濃，醇厚且桑葉味尚濃，帶甜味；F的湯色橙紅尚亮，有菌香，滋味厚尚醇；S的湯色青黑，帶青氣，滋味清甜稠滑。葉底：S的葉底稠滑，與F的軟嫩形成鮮明對比，SF具有S和F二者的優(yōu)勢。對比F和S，SF的口感更佳。桑葉與茶葉內(nèi)含物質(zhì)不一樣，制作過程中微生物進(jìn)行物質(zhì)的轉(zhuǎn)化過程與方向也會有所差別，所以三者口感差異明顯。桑葉和茶葉的葉片形狀和厚度差異明顯，所以三者的葉底差異明顯。SF與F的磚面平整，S的磚面稍松散，3個(gè)樣品金花都比較茂盛(圖2)。

表1 桑葉茯磚茶等3種磚茶感官審評情況

圖2 桑葉茯磚茶等3種磚茶的實(shí)物及茶湯

2.2 桑葉茯磚茶等3種磚茶的常規(guī)化學(xué)成分

利用紫外分光光度計(jì)測定3種磚茶的常規(guī)化學(xué)成分，結(jié)果如表2所示。SF的水浸出物、游離氨基酸、多酚和黃酮含量顯著高于S，而顯著低于F(P<0.05)；SF的可溶性糖含量顯著低于S(P<0.05)，略高于F(P>0.05)。常規(guī)化學(xué)成分含量差異是影響茶葉口感的主要因素，茶葉中多酚主要呈現(xiàn)苦澀滋味，氨基酸是形成茶湯鮮爽度的主要物質(zhì)，多酚含量與氨基酸含量比值稱酚氨比，酚氨比高苦澀味重，酚氨比低鮮爽度高，本試驗(yàn)SF的酚氨比顯著高于S，而顯著低于F(P<0.05)，說明相比F，SF的苦澀味弱?？扇苄蕴呛渴翘鹞犊诟械挠绊懸蛩刂?，SF加入桑葉后可溶性糖含量增加，所以呈現(xiàn)甜味。

表2 桑葉茯磚茶等3種磚茶常規(guī)化學(xué)物質(zhì)含量和酚氨比值

2.3 桑葉茯磚茶等3種磚茶的兒茶素及生物堿組分

利用高效液相色譜儀檢測3種磚茶的兒茶素及生物堿組分，結(jié)果如表3所示。SF的咖啡堿含量顯著低于F(P<0.05)，咖啡堿是一種中樞神經(jīng)興奮劑，SF的咖啡堿含量低，興奮作用減弱，更適合咖啡堿敏感人群。兒茶素占茶葉中多酚總量的70%以上，主要包括兒茶素(catechin，DL-C)、沒食子兒茶素(gallocatechin，GC)、表兒茶素(epicatechin，EC)、兒茶素沒食子酸酯(catechin gallate，CG)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin，EGC)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin gallate，GCG)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate，ECG)及表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)等，而桑葉中不含傳統(tǒng)茶葉的茶多酚類物質(zhì)，通過復(fù)配之后，SF的DL-C、EC、EGCG和GCG含量顯著減少(P<0.05)，EGC和ECG未檢測到，所以SF的苦澀味和刺激性味道減弱。

表3 桑葉茯磚茶等3種磚茶兒茶素及生物堿組分含量 %

2.4 桑葉茯磚茶等3種磚茶的GABA和DNJ

利用高效液相色譜儀檢測3種磚茶的GABA和DNJ，結(jié)果如表4所示。GABA被稱作“大腦的天然鎮(zhèn)靜劑”，能夠降低神經(jīng)元活性，具有安神和抗抑郁作用，還可以抑制血壓的上升，具有降血壓的作用。DNJ是糖代謝酶的抑制劑，可以緩解多糖的降解過程。從表4可以看出，SF的GABA和DNJ含量比F高100.42%和198.11%，且具有顯著差異(P<0.05)，表明混合之后SF的功能性成分GABA和DNJ的含量增加顯著。

表4 桑葉茯磚茶等3種磚茶每100 g的γ-氨基丁酸(GABA)和1-脫氧野尻霉素(DNJ)含量 mg

2.5 桑葉茯磚茶等3種磚茶的糖組分

利用高效液相色譜儀檢測3種磚茶的糖組分，結(jié)果如表5所示。從表5可以看出，SF的果糖(P<0.05)、葡糖糖、蔗糖(P<0.05)和麥芽糖含量高于F，S的果糖、葡糖糖、蔗糖和麥芽糖含量均顯著高于SF和F(P<0.05)。這也進(jìn)一步證明了SF的甜味來源于桑葉。

表5 桑葉茯磚茶等3種磚茶的糖組分含量 %

3 討論

隨著生活水平的提高，人們的飲食結(jié)構(gòu)也發(fā)生了改變，其中飲茶不再局限于飲用傳統(tǒng)的茶葉水，而是更關(guān)注飲品的保健功效。桑葉茶作為“天然保健飲料”，越來越受到大眾的歡迎，桑葉茯磚茶由茶葉和桑葉混合制作而成，結(jié)合了茶葉與桑葉的優(yōu)點(diǎn)，可以作為健康飲品拓展。

本研究通過對SF、F和S進(jìn)行感官審評，結(jié)果顯示SF的口感突出。一方面相對于F，SF的菌香更濃郁，湯色更深，口感更爽滑、甜；另一方面與S相比，SF的磚面更緊致，口感更醇和。3種磚茶原料不一樣，導(dǎo)致內(nèi)含成分有差異，而內(nèi)含成分的差異影響茶葉的感官審評。我們利用紫外分光光度計(jì)和高效液相色譜儀對SF、F和S的常規(guī)化學(xué)成分進(jìn)行測定，也發(fā)現(xiàn)常規(guī)化學(xué)成分含量的實(shí)際差異影響茶葉的口感。

傳統(tǒng)茶葉中多酚類物質(zhì)主要是兒茶素[27]，是茶葉中主要的呈味物質(zhì)，滋味苦澀，具有較強(qiáng)的刺激性；但桑葉中不存在傳統(tǒng)的茶多酚類物質(zhì)[28]，而是綠原酸、槲皮素、蘆丁、沒食子酸等，含量在7.88～13.36 mg/g之間[29]，因此二者滋味差異明顯。SF的多酚類物質(zhì)含量在F和S之間，并且SF中檢測到了C、EG、EGCG和GCG等4類兒茶素，這為SF滋味的改善提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。氨基酸是形成茶湯鮮爽度的主要物質(zhì)，也是茶葉中香氣形成的先質(zhì)[30]，氨基酸含量的差異既可以影響滋味又可以影響香氣，SF的氨基酸含量也介于F和S之間。并且茶多酚和氨基酸在茶葉滋味中具有協(xié)調(diào)作用，由酚氨比的結(jié)果可知SF與F相比苦澀味減弱同時(shí)鮮爽度提高?？扇苄蕴呛渴遣枞~中甜味物質(zhì)的主要來源，SF的可溶性糖含量高于F，并且糖組分中的果糖、葡糖糖、蔗糖和麥芽糖都高于F，因此SF比F口感更甜。咖啡堿是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮劑[31]，SF的咖啡堿含量降低，興奮作用降低，對人們睡眠的影響減少。

在茶葉和桑葉中都含有GABA，但在茶葉中含量較低[32]。肖洪等[33]測定了15個(gè)不同品種桑葉中的GABA含量，在1.480 6～3.079 3 mg/g之間；陳然等[34]對不同茶類的氨基酸組分進(jìn)行了分析，其中每100 g F的GABA含量為5 mg，比較發(fā)現(xiàn)其差異是檢測設(shè)備不同(本試驗(yàn)使用的高效液相色譜儀比氨基酸自動分析儀精確度更高)。李有貴等[35]考察了59份野生桑樹中DNJ含量為每100 g在4.6～791.1 mg之間，而茶葉中未見含有DNJ的報(bào)道，本試驗(yàn)中檢測到每100 g F的DNJ含量為12.73 mg。SF的GABA和DNJ含量也顯著高于F，GABA有抗抑郁的功效，DNJ有降血糖的功效，隨著GABA和DNJ含量的上升，SF的功能性作用也可能會優(yōu)于F，后續(xù)將對此展開研究。

雖然桑葉與茶葉常規(guī)化學(xué)組分基本相同，含量有差異，但是具體物質(zhì)的種類可能完全不同，比如多酚類物質(zhì)，茶葉中以兒茶素為主，而桑葉里不含兒茶素，后續(xù)我們將用代謝組學(xué)的方法解析桑葉茯磚茶內(nèi)含的具體化學(xué)成分。

4 結(jié)論

桑葉茯磚茶的多酚類物質(zhì)含量顯著高于桑葉磚茶，口感更醇和，糖類物質(zhì)含量高于茯磚茶，帶甜味，口感更好，咖啡因含量更低，更適合咖啡因敏感人群，GABA和DNJ含量高于茯磚茶，功能性可能更強(qiáng)。總之桑葉茯磚茶的口感和功能成分都要優(yōu)于茯磚茶和桑葉磚茶。