蘇振國(guó) 江秀均 李玲利 楊振國(guó) 柴建萍 白興榮

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101)

桑褐斑病是云南省桑園主要流行發(fā)生的2種病害(桑白粉病、桑褐斑病)之一，云南桑區(qū)的桑褐斑病主要由半知菌亞門的桑褐斑殼豐孢菌[Phloeosporamaculans(Bereng.)Allesch](無(wú)性態(tài))侵染引起[1-4]，發(fā)病時(shí)桑葉穿孔腐爛，病葉的內(nèi)含物蛋白、脂肪、纖維、糖分、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量降低，從而造成桑葉品質(zhì)下降影響家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育[5-6]，目前生產(chǎn)上在桑褐斑病發(fā)生期采用取代苯基類甲基硫菌靈和苯并咪唑類多菌靈化學(xué)藥劑多次施藥的方法防治該病害，藥劑使用量大，但防治效果不理想，且長(zhǎng)期使用易產(chǎn)生抗藥性[7-12]；對(duì)桑褐斑病病原菌的生物學(xué)和致病性研究表明，分生孢子和分生孢子形成的厚垣孢子是桑褐斑病最主要的侵染傳播源[13]，在未發(fā)病或發(fā)病初期選用對(duì)病原孢子抑制活性高兼具抑制菌絲活性的藥劑施藥可以預(yù)防該病大面積發(fā)生危害，延緩病原菌抗藥性的產(chǎn)生和減少化學(xué)藥劑的使用量。為此，我們結(jié)合前期室內(nèi)藥劑篩選試驗(yàn)，以對(duì)桑褐斑病病原菌分生孢子抑制活性高的甲氧基丙烯酸酯類(QoIs)殺菌劑嘧菌酯和菌絲抑制活性高的甾醇脫甲基抑制劑類(DMIs)殺菌劑戊唑醇通過室內(nèi)毒力測(cè)定獲得對(duì)桑樹褐斑病最優(yōu)復(fù)配配比，以減少防治桑樹褐斑病藥劑的使用量、降低對(duì)環(huán)境的污染和延緩桑樹褐斑病病菌抗藥性的產(chǎn)生。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試藥劑 98%嘧菌酯原藥，農(nóng)藥登記證號(hào)PD20140138，97%戊唑醇原藥，農(nóng)藥登記證號(hào)PD20082107，均為江蘇七洲綠色化工股份有限公司產(chǎn)品；丙酮，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；吐溫80，分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 供試菌株 試驗(yàn)菌株為桑褐斑殼豐孢菌，來(lái)源于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL，用于培養(yǎng)保存菌株和制作混藥平板。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 2種殺菌劑單劑對(duì)桑褐斑殼豐孢菌菌絲的毒力測(cè)定 采用抑制菌絲法測(cè)定2種殺菌劑對(duì)桑褐斑殼豐孢菌的毒力，具體操作如下：在無(wú)菌條件下，將供試殺菌劑溶于少量丙酮試劑中，用0.1%吐溫水溶液稀釋成6個(gè)濃度，將配好的殺菌劑藥液取2 mL加入23 mL PDA培養(yǎng)基中制成混藥平板，嘧菌酯混藥平板的嘧菌酯濃度分別為4.00 mg/L、2.00 mg/L、1.00 mg/L、0.50 mg/L、0.25 mg/L、0.13 mg/L，戊唑醇混藥平板的戊唑醇濃度分別為2.00 mg/L、1.00 mg/L，0.50 mg/L、0.25 mg/L、0.13 mg/L、0.06 mg/L，以加入等量無(wú)菌水代替藥物的平板作為對(duì)照平板，設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)。用內(nèi)徑為6 mm的打孔器在預(yù)先培養(yǎng)14 d的桑褐斑殼豐孢菌菌落邊緣打取菌餅，將菌餅放入含藥平板中央。將接菌的培養(yǎng)皿置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，定期觀察，14 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算各藥劑處理對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率并測(cè)算半抑制濃度(EC50)值。計(jì)算公式如下：抑制率(%)=(對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對(duì)照組菌落直徑-菌餅直徑)×100。

1.2.2 2種殺菌劑對(duì)桑褐斑殼豐孢菌分生孢子的毒力測(cè)定 將桑褐斑殼豐孢菌菌株在PDA平板上25 ℃培養(yǎng)14 d后，用無(wú)菌水洗下分生孢子，4層紗布過濾除去菌絲，將濾液在5 000 r/min下離心10 min，去除上清液，將分生孢子重懸于無(wú)菌水中，用血球計(jì)數(shù)板觀察計(jì)算孢子數(shù)量和濃度，用無(wú)菌水將孢子濃度調(diào)節(jié)至106個(gè)/mL，制成分生孢子懸浮液。取配制好的0.05 mL殺菌劑和0.05 mL濃度為106個(gè)/mL的分生孢子懸浮液混合均勻加入到滅菌的雙凹玻片的凹槽中，混合后嘧菌酯的濃度分別為50.00 mg/L、25.00 mg/L、12.50 mg/L、6.25 mg/L、3.13 mg/L，混合后戊唑醇的濃度分別為50.00 mg/L、25.00 mg/L、12.50 mg/L、6.25 mg/L、3.13 mg/L，加蓋保濕放入25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，以0.1%吐溫水溶液處理的分生孢子懸浮液為對(duì)照，設(shè)3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，24 h后顯微鏡下觀察記錄不同藥劑及對(duì)照的分生孢子萌發(fā)結(jié)果并測(cè)算EC50值。計(jì)算公式如下：抑制率(%)=(對(duì)照組孢子萌發(fā)率-處理組孢子萌發(fā)率)/對(duì)照組孢子萌發(fā)率×100。

1.2.3 2種殺菌劑聯(lián)合抑制桑褐斑殼豐孢菌的最佳配比篩選 以單劑嘧菌酯和戊唑醇的近似EC50分別取2.50 mg/L嘧菌酯和0.25 mg/L戊唑醇為基礎(chǔ)濃度，采用交互測(cè)定法進(jìn)行最佳配比篩選，將2種藥液按體積比10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10分別混合，配制出不同體積比的混合溶液后，測(cè)定各混合溶液對(duì)桑褐斑病病原菌處理后的抑制率，再根據(jù)以下公式計(jì)算各配比的預(yù)期抑制率和毒性比率：預(yù)期抑制率(%)=嘧菌酯EC50值劑量實(shí)際抑制率×配比中嘧菌酯EC50值劑量百分比+戊唑醇EC50值劑量實(shí)際抑制率×配比中戊唑醇EC50值劑量百分比；毒性比率=實(shí)際抑制率/預(yù)期抑制率。毒性比率大于1.25時(shí)，表現(xiàn)為增效作用；毒性比率小于0.75時(shí)，表現(xiàn)為拮抗作用；毒性比率在1左右時(shí)，為相加作用；在此基礎(chǔ)上篩選得到最佳體積配比[14]。

1.2.4 2種殺菌劑對(duì)桑褐斑殼豐孢菌最佳配比的聯(lián)合毒力測(cè)定 將確定的最佳體積配比換算為質(zhì)量配比制成2種殺菌劑的混劑，并測(cè)定混配藥液對(duì)桑褐斑殼豐孢菌的菌絲毒力，具體測(cè)定方法同1.2.1項(xiàng)的試驗(yàn)方法，混配藥液平板的藥物濃度設(shè)為5.00 mg/L、2.50 mg/L，1.25 mg/L、0.63 mg/L、0.31 mg/L等5個(gè)濃度梯度，以加入等量無(wú)菌水代替藥液的平板作為對(duì)照，設(shè)3次重復(fù)，計(jì)算各混配藥劑的EC50。以上述測(cè)定結(jié)果為基礎(chǔ)，依據(jù)共毒系數(shù)(CTC)值>120為增效作用，介于80～120之間為相加作用，CTC值<80為拮抗作用[15]進(jìn)行判斷，具體計(jì)算公式如下：毒力指數(shù)(TI)=標(biāo)準(zhǔn)藥劑的EC50/供試藥劑的EC50×100；實(shí)測(cè)混劑的毒力指數(shù)(ATI)=標(biāo)準(zhǔn)藥劑的EC50/混劑的EC50×100；混配藥劑的理論毒力指數(shù)(TTI)=TIA×PA+TIB×PB，式中TIA和TIB分別表示單劑A與B的毒力指數(shù)，PA和PB分別表示單劑A與B在混劑中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；混劑的CTC=混劑ATI/混劑TTI×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析方法

采用Excel2007軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算各處理平均菌落直徑和平均抑制率，采用DPS9.50軟件對(duì)藥劑濃度對(duì)數(shù)值及對(duì)應(yīng)的菌絲生長(zhǎng)抑制率機(jī)率值進(jìn)行回歸分析，求出各單劑及其不同配比混劑的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)和EC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種殺菌劑對(duì)桑褐斑殼豐孢菌的菌絲和分生孢子的抑制作用

測(cè)定2種殺菌劑對(duì)桑褐斑殼豐孢菌的菌絲生長(zhǎng)均具有較強(qiáng)的抑制活性，嘧菌酯對(duì)菌絲的EC50為2.27 mg/L，戊唑醇對(duì)菌絲的EC50為0.26 mg/L，嘧菌酯抑制分生孢子的EC50為12.84 mg/L，戊唑醇抑制分生孢子的EC50為20.47 mg/L(表1)。

表1 2種殺菌劑對(duì)桑褐斑殼豐孢菌菌絲和分生孢子的毒力

2.2 2種殺菌劑混配對(duì)桑褐斑殼豐孢菌的最佳配比

按照不同配比混配藥液對(duì)桑褐斑殼豐孢菌菌絲的抑制活性，以毒性比率法評(píng)價(jià)其是否具有增效作用，結(jié)果表明，在所選配比中，嘧菌酯和戊唑醇的EC50值在體積比分別為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9時(shí)對(duì)桑褐斑病病菌的毒性比率分別為1.52、1.86、1.69、1.78、1.75、1.73、1.70、1.66、1.65，其中在體積比分別為8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7(質(zhì)量比35∶1～4∶1)時(shí)的毒性比率均大于1.69，表現(xiàn)為增效作用(表2)。綜合考慮，本次試驗(yàn)劃定質(zhì)量比50∶1～5∶1作為嘧菌酯和戊唑醇2種殺菌劑混配的毒力測(cè)定范圍。

表2 2種殺菌劑不同配比混合對(duì)桑褐斑殼豐孢菌的毒性比率

2.3 2種殺菌劑不同配比對(duì)桑褐斑殼豐孢菌的毒力

以共毒系數(shù)法測(cè)定了各配比的增效情況(表3)，嘧菌酯和戊唑醇復(fù)配在質(zhì)量比為50∶1～5∶1之間共毒系數(shù)均大于120，均具有增效作用，其中嘧菌酯∶戊唑醇質(zhì)量比為25∶1時(shí)，共毒系數(shù)最高為260.91，EC50為0.67 mg/L；以后共毒系數(shù)由大到小依次為嘧菌酯∶戊唑醇的質(zhì)量比在10∶1時(shí)為250.61，EC50為0.53 mg/L；嘧菌酯∶戊唑醇的質(zhì)量比在50∶1時(shí)為205.52，EC50為0.94 mg/L；嘧菌酯∶戊唑醇的質(zhì)量比在5∶1時(shí)為198.65，EC50為0.50 mg/L。

表3 嘧菌酯和戊唑醇不同比率混劑對(duì)桑褐斑殼豐孢的聯(lián)合毒力

3 小結(jié)與討論

桑葉是家蠶飼料的唯一可靠來(lái)源，桑園用藥不僅要達(dá)到防治病害的效果，同時(shí)要確保對(duì)家蠶的安全，與傳統(tǒng)的作物用藥相比桑園用藥對(duì)安全有效的藥劑依賴性更強(qiáng)，使用周期較長(zhǎng)易使病原菌產(chǎn)生抗藥性[16]。結(jié)合桑褐斑病的病原傳播方式和我們前期的田間試驗(yàn)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期使用甲基硫菌靈作為防治藥劑的地塊其防治效果已不再理想[17]；因此，篩選新的對(duì)家蠶低毒的殺菌劑是提高桑褐斑病防效和病害抗性治理的可行途徑。試驗(yàn)中選用對(duì)分生孢子和菌絲兼具抑制性的不同作用機(jī)制殺菌劑嘧菌酯和戊唑醇混用增加殺菌劑的靶標(biāo)位點(diǎn)可以降低病原菌的抗性選擇壓力，并且2種藥劑在病原菌內(nèi)的吸收、分布、降解的時(shí)間不同，可以在病原菌各生長(zhǎng)階段發(fā)揮不同的抑菌活性。試驗(yàn)中以嘧菌酯與戊唑醇質(zhì)量比在25∶1時(shí)共毒系數(shù)最高為260.91，EC50為0.67 mg/L，按照田間施藥標(biāo)準(zhǔn)為室內(nèi)的，結(jié)合前期我們對(duì)2種藥劑的家蠶急性毒力測(cè)定表明其對(duì)家蠶屬于低風(fēng)險(xiǎn)藥劑，結(jié)合慢性毒性的報(bào)道其對(duì)非靶標(biāo)家蠶產(chǎn)生慢性毒性風(fēng)險(xiǎn)的劑量低于其防病的劑量[18-19]，雖然2種藥劑對(duì)家蠶的毒性較低且對(duì)桑褐斑病防治效果較好，但本試驗(yàn)是在室內(nèi)進(jìn)行的，進(jìn)一步的應(yīng)用還需在田間開展評(píng)價(jià)試驗(yàn)。