孫 斌, 孔凡娜, 殷吉強

(中國海洋大學海洋生命學院， 海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室， 山東 青島 266003)

條斑紫菜(Pyropiayezoensis)具有由絲狀孢子體和葉狀配子體組成的異形世代交替的生活史。配子體自然情況下生長于潮間帶的礁石上，受潮汐的影響，經(jīng)受周期性的干露失水、復水、光照、溫度等非生物因素的劇烈脅迫。復雜的生活環(huán)境賦予了條斑紫菜獨特的適應機制，使其成為研究抗逆機制的潮間帶模式物種。同時，隨著全球變暖等問題的加劇，高溫、低鹽等惡劣條件均嚴重地影響紫菜的生長[1]，因此，有必要研究條斑紫菜的抗逆機制。

熱激蛋白(Heat shock protein，HSP)，又稱為熱休克蛋白，廣泛分布于生物界中[2]，在植物抵御脅迫的過程中發(fā)揮著重要的作用。根據(jù)其分子量和功能的不同，可以將其分為6個家族：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40 和 小分子HSP(small HSP，sHSP)[3]。其中，HSP40作為HSP70的輔伴侶分子存在，具有1個高度保守的J結構域，又被稱為DnaJ，可以促進HSP70的ATP酶活性。DnaJ蛋白數(shù)量龐大且結構多樣，一般可根據(jù)含有結構域的不同分成 A、B、C 三類[4]：A類J蛋白包含J結構域、富含甘氨酸和苯丙氨酸區(qū)域(G/F結構域)和鋅指結構域；B類J蛋白包含J結構域、G/F結構域；C類僅包含 J結構域。其中，J結構域有保守組氨酸/脯氨酸/天冬氨酸三肽(His/Pro/Asp，HPD)，HPD是DnaJ蛋白與HSP70互作所必需的結構[5]。DnaJ蛋白可參與維持細胞內(nèi)蛋白的正確折疊、組裝、運輸、降解等多種生命活動進程，在生物體抵抗和適應高低溫、干旱等逆境脅迫方面發(fā)揮著重要作用[6-9]。

在藻類抵抗外界脅迫的過程中，HSP蛋白發(fā)揮著重要的作用。條斑紫菜中，高溫、低溫及低鹽脅迫均可以誘導hsp90的上調(diào)表達[10]；在滸苔(Ulvaprolifera)中，hsp70在低鹽、高鹽及紫外照射脅迫下均上調(diào)表達[11]；在壇紫菜(P.haitanensis)中，高溫可誘導hsp70的高表達[12]。隨條斑紫菜失水程度升高，hsp40表達量也逐漸升高，而且有著明顯的世代差異，在孢子體世代下的表達量顯著高于配子體世代[13]。在藍藻(Cyanobacterial)中，小分子熱激蛋白(sHSP)可以增加光系統(tǒng)Ⅱ的耐熱性[14]，壇紫菜的sHSP基因在高溫和失水脅迫誘導下的表達量均顯著上調(diào)[15]。相較于其他HSP蛋白，有關DnaJ的研究大多集中在哺乳動物、植物或者細菌上，在藻類中相對較少。因此，本研究通過生物信息學方法首次在全基因組水平對條斑紫菜DnaJ家族進行鑒定和分析，并進一步探究了PyDnaJ家族部分成員在失水、溫度脅迫處理下的表達模式，以期為解析條斑紫菜抗逆機制提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 本實驗室培養(yǎng)的條斑紫菜RZ純系。

1.1.2 試劑 RNA提取試劑盒(購自OMEGA)；DNA酶(購自OMEGA)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自TAKARA)；瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購自全式金)；快速質(zhì)粒小提試劑盒(購自天根); 2×Taq Plus Master Mix(購自南京諾唯贊)；ChamQTM SYBR Color qPCR Master Mix(購自南京諾唯贊)。

1.2 方法

1.2.1 基因家族鑒定 本研究從 Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)下載DnaJ基因家族的隱馬爾可夫模型(Hidden Markov Model，HMM)(PF00226)，利用 Hmmer3.0軟件[16]的Hmmsearch程序檢索條斑紫菜中DnaJ蛋白序列(閾值 E<10-5)；提取蛋白序列并構建物種特異的HMM模型后，再次檢索條斑紫菜中的DnaJ蛋白序列(閾值 E<10-5)；根據(jù)輸出文件提取條斑紫菜中符合條件的蛋白序列，分別上傳至Pfam數(shù)據(jù)庫和NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)確認獲得的蛋白序列是否含有DnaJ結構域，排除假陽性，最終得到PyDnaJ家族成員。通過SnapGene軟件[17]、在線網(wǎng)站Cell-PLoc2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)分別對蛋白的等電點、分子量及亞細胞定位進行分析。

1.2.2 基因結構及蛋白序列分析 使用TBtools[18]對DnaJ基因家族成員進行分析，獲得基因結構預測結果。使用MEME(https://meme-suite.org/meme/)對DnaJ家族成員的保守基序進行預測，分布模型為Any number of repetitions(ANR)，預測保守基序數(shù)量為10，motif長度設置為6～50 aa，并利用TBtools軟件實現(xiàn)motif預測結果的可視化。

1.2.3 染色體定位及基因復制分析 利用TBtools對基因家族成員進行染色體定位分析及可視化，進一步利用McScanX[19]解析基因組復制事件，并利用DnaSP6[20]計算了非同義替換率/同義替換率(Ka/Ks)值。

1.2.4DnaJ基因啟動子區(qū)域順式作用元件預測 調(diào)取PyDnaJ基因家族成員的上游序列(2 000 bp)并上傳至PlantCARE數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進行順式作用元件的分析和預測，并利用TBtools軟件進行順式元件預測結果的可視化。

1.2.5DnaJ基因家族系統(tǒng)進化分析 本研究結合條斑紫菜、壇紫菜、萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、水稻(OryzasativaL.)DnaJ家族蛋白序列信息，探究DnaJ家族的系統(tǒng)進化關系。利用本研究中基因家族鑒定方法，根據(jù)從NCBI下載的蛋白序列信息分別提取條斑紫菜、壇紫菜和萊茵衣藻中DnaJ家族成員蛋白序列，參考Luo等[21]的方法獲得水稻中的DnaJ家族蛋白序列，利用MegaX[22]對蛋白序列進行序列比對及系統(tǒng)進化樹的構建，建樹方法為最大似然法(Maximum Likelihood)，Bootstrap值設置為1 000。

1.2.6 材料的處理和收集 用本實驗室保存的條斑紫菜RZ作為實驗材料。將健康生長的孢子體和配子體材料吸干水分后，經(jīng)液氮冷凍，凍存于-80 ℃冰箱中。挑選同批培養(yǎng)的生長狀態(tài)良好且日齡為30 d的條斑紫菜葉狀體分別進行失水脅迫和溫度脅迫處理，處理方法參考Kim等[23]和Sun等[24]，每組均設置3組平行，處理見表1。

1.2.7 基因表達分析 本研究選取條斑紫菜DnaJ家族中的部分成員(PyDnaJ02、PyDnaJ09、PyDnaJ11、PyDnaJ12、PyDnaJ18、PyDnaJ19、PyDnaJ20、PyDnaJ25和PyDnaJ27)作為目的基因，引物序列如表2所示，利用qRT-PCR技術檢測分析不同成員在不同世代及失水、復水和溫度脅迫下的相對表達量的變化。每個處理設置3個生物學平行組和3個技術重復。選用PyUBC作為內(nèi)參基因[25]，用2-△△Ct法計算得到目的基因在不同脅迫下的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 基因家族的鑒定

經(jīng)過Hmmsearch檢索、CDD和Pfam結構域預測分析，在條斑紫菜中共鑒定出27個DnaJ成員，分別命名為PyDnaJ01～PyDnaJ27。cDNA序列最長為3 277 bp，最短為576 bp，編碼多肽的氨基酸數(shù)量為191～980，分子量為18.44～101.86 kDa，等電點為4.76～10.9。亞細胞定位預測結果顯示，有6個蛋白定位于高爾基體，2個蛋白定位于高爾基體/過氧化物酶體，9個定位于高爾基體/細胞核，1個定位于高爾基體/線粒體，2個定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，1個定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/細胞核，2個定位于細胞核，4個定位于線粒體(見表3)。

表1 條斑紫菜的不同處理條件

表2 qRT-PCR所用引物序列

表3 條斑紫菜DnaJ家族成員特征

續(xù)表3

2.2 基因結構和蛋白序列分析

基因結構分析表明PyDnaJ基因家族成員含有較少的內(nèi)含子，其中PyDnaJ02、PyDnaJ06、PyDnaJ07、PyDnaJ09、PyDnaJ10、PyDnaJ14、PyDnaJ18、PyDnaJ21、PyDnaJ26和PyDnaJ27均含有1個內(nèi)含子，PyDnaJ05含有2個內(nèi)含子，PyDnaJ11含有3個內(nèi)含子，其余成員均不含有內(nèi)含子(見圖1)。

圖1 PyDnaJ家族基因結構和motif結構分析

蛋白結構域分析發(fā)現(xiàn)，PyDnaJ家族成員共含有10個不同的Motif，不同成員含有Motif數(shù)量不等，全部成員均含有Motif1(見圖2B)，其為J結構域核心序列，含有穩(wěn)定的HPD結構；除PyDnaJ02和PyDnaJ07外，其余25個蛋白均含有Motif2和Motif3，Motif1與Motif3(見圖2A)、Motif2(見圖2C)組成了完整的J結構域(見圖2D)。結構域分類結果顯示，條斑紫菜DnaJ家族成員根據(jù)所含結構域可以分為三大類，其中PyDnaJ11、PyDnaJ13、PyDnaJ17、PyDnaJ25 4個成員屬于A類，除含有J結構域外，含有Motif7和Motif8。Motif7為富含甘氨酸和苯丙氨酸的G/F結構域(見圖2E)，Motif8為Cys-X-X-Cys-X-Gly-X-Gly (C-X-X-C-X-G-X-G)基序(見圖2F)，4個motif8組成完整的鋅指結構域； PyDnaJ03、PyDnaJ08、PyDnaJ20 3個成員屬于C類，僅含有J結構域；其余20個成員屬于B類，含有J結構域和G/F結構域。

(A：基序3；B：基序1；C：基序2；D：DnaJ家族J結構域的HMM標簽；E：基序7；F：基序8。A：motif3；B：motif1；C：motif2；D：HMM logo of J domain in DnaJ family；E：motif7；F：motif8.每列字母的總高度表示該位置的序列保守性(以bits為單位)，而該列中字母的高度反映了該位置相應氨基酸的相對頻率。The overall height of each stack of letters indicates the sequence conservation at that position (measured in bits), whereas the height of symbols within the stack reflects the relative frequency of the corresponding amino or nucleic acid at that position. )

2.3 染色體定位與共線性分析

染色體定位結果表明(見圖3)，11個成員分布在PY_1染色體，8個成員分布在PY_2染色體，8個成員分布在PY_3染色體。

(PY_(1～3)：條斑紫菜1～3號染色體。PY_(1～3)：P. yezoensis 1～3 chromosome.)

共線性分析發(fā)現(xiàn)，條斑紫菜DnaJ基因家族共存在2個共線基因(PyDnaJ01、PyDnaJ10)，因此被視為片段重復事件，其Ka為0.084 6，Ks為0.096 9，Ka/Ks值為0.873 07。根據(jù)Ka/Ks值估算片段重復基因的進化選擇模式，Ka/Ks>1表示正選擇，Ka/Ks< 1表示純化選擇，Ka/Ks= 1 表示中性選擇，故PyDnaJ01和PyDnaJ10的進化選擇模式為純化選擇。

2.4 DnaJ基因啟動子區(qū)域順式作用元件預測

為了更好的預測基因功能，本研究檢測了DnaJ家族成員起始密碼子上游2 000 bp的序列用于啟動子區(qū)域順式作用元件的預測及分析(見圖4)，主要檢測出兩類順式作用元件，一類是同非生物脅迫(干旱、低溫、缺氧)響應相關的元件(MBS、LTR、ARE等)，以及防御和應激反應相關的元件(TC-rich repeats)等；另一類是植物激素響應元件，包括茉莉酸甲酯響應相關元件(TGACG-motif、CGTCA-motif等)、脫落酸響應相關元件(ABRE)和生長素響應相關元件(TGA-box等)。

圖4 條斑紫菜DnaJ家族順式作用元件分布

2.5 基因家族系統(tǒng)進化分析

本研究對來自條斑紫菜(P.yezoensis，Py)、壇紫菜(Porphyrahaitanensis，Ph)、萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii,Cr)和水稻(OryzasativaL.，Os)中的共135條DnaJ家族蛋白序列構建系統(tǒng)進化樹(見圖5)，其中水稻DnaJ家族共有115個成員，隨機選出9個亞群的38個成員參與構建系統(tǒng)進化樹[16]。進化樹分析，顯示135條序列分為A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和K共11個亞群，其中，C亞群為紅藻和綠藻特有的亞群，I亞群為萊茵衣藻特有的亞群，其他亞群為紅藻和綠色植物共有的類群，說明DnaJ家族在藻類與綠色植物分歧之前就已經(jīng)形成分化，在進化過程中有的亞群在低等的綠藻和紅藻中單獨保留，有的則以直系同源的方式在不同的物種中形成。另外相對于綠色植物，條斑紫菜(27個成員)、壇紫菜(22個成員)中DnaJ成員的數(shù)量要遠少于萊茵衣藻(48個成員)和水稻(115個成員)，說明綠色植物的DnaJ在進化過程中可能發(fā)生了擴張。

圖5 PyDnaJ家族系統(tǒng)進化分析

2.6 基因表達水平檢測

利用qRT-PCR技術檢測了PyDnaJ09、PyDnaJ12、PyDnaJ18、PyDnaJ19、PyDnaJ20、PyDnaJ25和PyDnaJ27在配子體和孢子體世代下的表達模式(見圖6)，被選取的基因在孢子體世代的表達水平均極顯著高于配子體世代(P<0.01)。

(**表示差異極顯著(P<0.01)。**：Extremely significant difference(P<0.01).)

進一步通過檢測PyDnaJ02、PyDnaJ09、PyDnaJ11、PyDnaJ12、PyDnaJ18、PyDnaJ25和PyDnaJ27在失水和復水脅迫下的表達模式(見圖7)發(fā)現(xiàn)：在失水脅迫下，PyDnaJ02和PyDnaJ09在不同程度失水脅迫下的表達水平均表現(xiàn)出明顯下調(diào)；PyDnaJ11和PyDnaJ18在中、低程度失水脅迫下(失水30%、50%)表現(xiàn)出極顯著下調(diào)(P<0.01)；PyDnaJ27在低程度失水脅迫下(失水30%)表現(xiàn)出明顯下調(diào)，在其他程度失水脅迫下的表達水平變化并不明顯；而PyDnaJ12在高程度失水脅迫(失水80%)下表現(xiàn)出極顯著上調(diào)(P<0.01)；PyDnaJ25在中、高程度失水條件下(失水50%、80%)的表達水平極顯著上調(diào)(P<0.01)。在復水脅迫下，PyDnaJ02、PyDnaJ09、PyDnaJ11、PyDnaJ12、PyDnaJ18、PyDnaJ25和PyDnaJ27均表現(xiàn)出極顯著下調(diào)(P<0.01)。

最后通過檢測PyDnaJ02、PyDnaJ09、PyDnaJ11、PyDnaJ12和PyDnaJ25在不同的溫度脅迫下的表達模式(見圖8)發(fā)現(xiàn)：在高溫脅迫(24 ℃)下(見圖8A)，PyDnaJ02、PyDnaJ11和PyDnaJ12的表達水平明顯下調(diào)，PyDnaJ09和PyDnaJ25的表達水平明顯上調(diào)；在0 ℃下(見圖8B)，PyDnaJ02和PyDnaJ09的表達水平明顯下調(diào)，PyDnaJ12和PyDnaJ25極顯著上調(diào)(P<0.01)，PyDnaJ11的表達水平變化不明顯；在-8 ℃下(見圖8C)，PyDnaJ11的表達水平極顯著下調(diào)(P<0.01)，PyDnaJ02、PyDnaJ12和PyDnaJ25的表達水平極顯著上調(diào)(P<0.01)，PyDnaJ09的表達水平變化不明顯。

(A：失水組；B：復水組。30%：失水30%處理組；50%：失水50%處理組；80%：失水80%處理組；80%-30 min：失水80%后復水30 min處理組。*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。A：Dehydration group；B：Rehydration group. 30%：30% dehydration group；50%：50% dehydration group；80%：80% dehydration group；80%-30 min：30 min rehydration after 80% dehydration group. *：Significant difference(P<0.05)，**：Extremely significant difference(P<0.01).)

(A：24 ℃處理組；B：0 ℃處理組；C：-8 ℃處理組；10 ℃：對照組。*表示與對照組差異顯著(P<0.05)，**表示與對照組差異極顯著(P<0.01)。A：24 ℃ group；B：0 ℃ group；C：-8 ℃ group；10℃：Control group. *：Significant difference(P<0.05)，**：Extremely significant difference(P<0.01).)

3 討論

DnaJ家族在生物體中有著重要的作用，但目前在高等植物、哺乳動物和細菌中關于DnaJ家族的研究較多，在紅藻中的研究相對較少。高等植物中一般存在著較多的DnaJ家族成員，其中：擬南芥中有120個成員[26]；高粱中有113個[27]成員；水稻中有115個[21]成員；甘藍(Brassicaoleracea)中有129個成員[28]；辣椒(CapsicumannuumL.)中有76個[29]成員。而本研究利用生物信息學方法在大型紅藻條斑紫菜中共鑒定出27個DnaJ家族成員，在壇紫菜中鑒定出22個成員，說明紫菜中DnaJ家族成員的數(shù)量明顯少于高等植物。結構域分析顯示，與綠色植物中的DnaJ家族類似，其27個成員中均含有保守三肽HPD，PyDnaJ11、PyDnaJ13、PyDnaJ17、PyDnaJ254個成員中均存在3個結構域，PyDnaJ03、PyDnaJ08、PyDnaJ203個成員中均僅存在J結構域，其余20個成員則是均含有J結構域和G/F結構域。DnaJ蛋白所含結構域的不同通常作為蛋白分類的依據(jù)，且A和B類的功能類似，C類的功能不同于A和B類[30]，水稻和大豆中的DnaJ家族成員均可分成3類，其中最多的是C類[9, 31]；黃瓜中的DnaJ家族只有2類，缺少A類，最多的同樣是C類[32]。條斑紫菜中的DnaJ家族可分成3類，最多的是B類，條斑紫菜與高等植物在不同類別DnaJ蛋白數(shù)量上的差異可能反映了不同物種應對外界脅迫的差異。DnaJ蛋白的功能與其亞細胞定位有一定的關系[26]，因此本研究對條斑紫菜DnaJ蛋白家族成員進行了亞細胞定位預測，發(fā)現(xiàn)不同的成員分別定位于細胞核、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物酶體等不同的亞細胞位置，其中有18個成員定位到高爾基體，11個定位到細胞核；而在高等植物如擬南芥[33]中，發(fā)現(xiàn)有DnaJ蛋白定位到葉綠體中，并在葉綠體的發(fā)育、抗逆等過程中起到重要作用。之前也有研究發(fā)現(xiàn)萊茵衣藻中存在定位于葉綠體中的DnaJ蛋白[34]，但是在本研究中沒有發(fā)現(xiàn)定位到葉綠體的DnaJ蛋白，具體原因需要進一步的探索。

高等植物中研究表明，DnaJ在溫度、干旱等逆境脅迫下，可以在植物體內(nèi)大量積累，從而增強植物的耐受性[21,35]，本研究進一步對條斑紫菜部分PyDnaJ基因在不同脅迫條件下的表達模式進行了分析，研究結果表明，失水、溫度脅迫均可誘導PyDnaJ基因作出響應，而且不同成員在同一脅迫條件下、同一成員在不同脅迫下具有不同的表達模式，這種多樣化的應對表達模式豐富了條斑紫菜對復雜生境的適應機制，如PyDnaJ02在不同的失水脅迫下的相對表達量明顯下調(diào)，而在-8 ℃下表現(xiàn)出明顯上調(diào)，這可能說明PyDnaJ02對失水脅迫不敏感，對低溫脅迫敏感；PyDnaJ12在失水80%的條件下相對表達量明顯上調(diào)，在24 ℃下明顯下調(diào)，在0和-8 ℃下明顯上調(diào)，這說明PyDnaJ12對高度失水、低溫脅迫比較敏感；值得注意的是，PyDnaJ25在不同失水和溫度脅迫下均表現(xiàn)出了很高的敏感性，可能該基因在條斑紫菜響應逆境脅迫過程中有著重要作用，該研究結果與劉嬌等[13]的研究相似。同時順式元件分析表明，PyDnaJ家族的基因上游調(diào)控區(qū)也包含脅迫響應元件和激素響應元件。如：MBS(MYB binding site，MYB結合位點)在玉米中參與到干旱脅迫響應過程[36]，GC-motif在玉米中參與到缺氧脅迫誘導過程中[37]；TGACG-motif和CGTCA-motif參與到茉莉酸甲酯的響應過程，茉莉酸甲酯可以作為植物響應損傷、高溫等脅迫過程的信號分子[38-40]；ABRE(Abscisic acid response element，脫落酸響應元件)參與脫落酸的響應過程，并在擬南芥響應干旱、高鹽等過程中發(fā)揮作用[41]。這進一步表明，PyDnaJ家族在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平均參與了應答環(huán)境脅迫。

4 結語

本研究利用生物信息學方法對條斑紫菜DnaJ基因家族成員的組成、蛋白特性、基因結構和進化特點等方面進行了研究，并利用qRT-PCR技術對家族成員在不同脅迫條件下的表達模式進行了分析，為進一步解析條斑紫菜抗逆機制奠定了前期工作基礎。