何 龍，師尚禮，康文娟，劉旵旵，王文娟，武 蓓

(甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

植物內(nèi)生菌是一類能在植物組織中定殖、運轉(zhuǎn)和生存，但不引起宿主植物病害癥狀的微生物[1]。研究表明，內(nèi)生菌廣泛存在于玉米(ZeamaysL.)[2]、水稻(OryzasativaL.)[3]、煙草(NicotianatabacumL.)[4]、苜蓿(MedicagosativaL.)[5]等多種植物的根、莖、葉組織和種子內(nèi)[6]。苜蓿是優(yōu)質(zhì)的豆科牧草，蛋白含量高，與根瘤菌形成根瘤后可將大氣中的無機氮轉(zhuǎn)化為有機氮，供給植物營養(yǎng)[7]。苜蓿-根瘤菌共生體系的固氮作用不僅具有巨大的經(jīng)濟效益，同時在提高作物和牧草產(chǎn)量與質(zhì)量、改善生態(tài)環(huán)境和土壤肥力等方面具有重要作用[8]。但在構建共生固氮體系的過程中，萌發(fā)的種子胚根首先接觸內(nèi)生根瘤菌，然后才能接觸到外源接種的根瘤菌，內(nèi)生根瘤菌對于外源根瘤菌接種效果產(chǎn)生干擾[9]。因此，種子內(nèi)生根瘤菌的有效滅除對外源接種根瘤菌的高效固氮及促生效應研究具有重要意義。

在根瘤菌接種過程中，菌類污染是常見且必須高度重視的問題，其污染來源一般可分為材料帶菌、接種過程污染和生長過程污染等方面[10]。接種過程和生長過程中的菌類污染可以通過無菌操作來避免，但材料帶菌只能通過滅菌來消除[11]，對材料進行滅菌處理時還要兼顧滅菌方法對種子發(fā)芽率、幼苗生長和操作人員的安全等的影響[12]。目前對苜蓿種子的滅菌主要采用0.1%升汞、98%濃硫酸、10%次氯酸鈉和碘伏溶液等[12-16]其中一種或幾種溶液進行漂洗，其中低濃度的Hg2+可與帶負電荷的蛋白質(zhì)結合，使細菌蛋白變性、酶失活，是一種劇毒的重金屬鹽殺菌劑，對操作人員健康和環(huán)境安全存在很大隱患[17]；濃硫酸的強酸性能夠腐蝕種皮，打破柵欄組織屏障，使種殼變薄并消除珠孔等部位的堵塞物，增大種皮透性，促進吸水萌發(fā)[18]，但處理時間較難控制易造成酸害，廢棄液存在安全隱患[19]。因此，研發(fā)高效安全的紫花苜蓿種子內(nèi)生根瘤菌滅菌處理方法是苜蓿與根瘤菌精準匹配高效固氮效應研究的必要條件。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試苜蓿種子 ‘甘農(nóng)9號’紫花苜蓿(M.sativa‘Gannong No.9’)由甘肅農(nóng)業(yè)大學教育部草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)重點實驗室提供。

1.1.2培養(yǎng)基 酵母甘露瓊脂(Yeast mannitol agar，YMA)剛果紅培養(yǎng)基：甘露醇10.0 g·L-1,NaCl 0.1 g·L-1,MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1、酵母粉1.0 g·L-1,K2HPO40.5 g·L-1、瓊脂15 g·L-1、0.5%剛果紅液4 mL·L-1、蒸餾水1 000 mL·L-1，pH值7.0±0.1。

1.1.3滅菌試劑 碘伏(聚乙烯吡咯烷酮碘)消毒液：有效碘含量為0.45%～0.55% W/V(德州億康消毒制品有限公司)。

氯化鈉-吐溫溶液(Sodium chloride-Tween solution，ST液)：0.9%無菌氯化鈉溶液，0.5%吐溫80(天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司)。

10%次氯酸鈉溶液：購自天津市北辰方正試劑廠。

3%次氯酸鈉溶液：將濃度為10%的次氯酸鈉加入蒸餾水稀釋至3%。

1.2 試驗方法

1.2.1種子滅菌

(1)種子解剖

選取籽粒飽滿、無病蟲害[20]的‘甘農(nóng)9號’種子1 200粒，其中150粒在無菌解剖鏡(MOTIC體視顯微鏡SMZ-171)下，用無菌手術刀及解剖針將種子的種皮剖開，分離為種皮、胚、子葉、子葉+胚、子葉-胚連接處5個部位放置備用。

(2)滅菌處理

DF處理：碘伏浸泡6 min→無菌水沖洗。

DS處理：碘伏浸泡5 min→無菌水沖洗→ST液浸泡1 min→無菌水沖洗。

SH3處理：3%次氯酸鈉浸泡6 min→無菌水沖洗。

SH10處理：10%次氯酸鈉浸泡6 min→無菌水沖洗。

CK處理：無菌水浸泡6 min。

1.2.2種子內(nèi)生根瘤菌數(shù)量測定 將挑選的種子10粒為一組，置于5個無菌三角瓶中，分別進行DF，DS，SH3，SH10和CK處理，備用。另取種皮、胚、子葉、子葉+胚、子葉-胚連接處5個部位，處理方法同上，備用。取上述備用材料，以10粒種子或種子部位為單位，將消毒后的種子加入無菌研缽中，加2 mL無菌水充分研磨后倒入2 mL離心管中，離心(4 000 r·min-1，10 min，4℃)后，配制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5濃度稀釋液，每一濃度梯度3次重復，取上清液0.2 mL用涂抹法分別接種在YMA剛果紅固體培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱(HHWS-II-400，上海躍進醫(yī)療器械有限公司)中培養(yǎng)48 h，參照霍平慧[21]的方法鑒別并記錄每個培養(yǎng)皿中的根瘤菌數(shù)，以每平板30～300個菌落的稀釋度計算1 mL稀釋菌液的根瘤菌數(shù)[22]，單位為個·粒-1。計算公式為：1 mL稀釋液含菌數(shù)=菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×5。

1.2.3滅菌種子萌發(fā)能力檢測 將挑選的種子以100粒為一組，置于5個無菌三角瓶中，分別進行DF，DS，SH3，SH10和CK處理滅菌后備用。另取500粒種子在無菌解剖鏡下，用無菌手術刀及解剖針將種子的種皮剖開，以100粒為一組，置于5個無菌三角瓶中，對去皮種子分別進行DF，DS，SH3，SH10和CK處理滅菌。

在培養(yǎng)皿(直徑90 mm)內(nèi)放置兩層濾紙并加入2 mL蒸餾水潤濕，每個培養(yǎng)皿內(nèi)均勻放置25粒滅菌后的完整種子或去皮種子，重復4次。置于25℃、日光照12 h的光照培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)一周，并記錄發(fā)芽種子數(shù)、胚芽長、胚根長和幼苗長，并計算發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。

1.2.4指標測定 種子萌發(fā)的標準為胚根突破種皮，長出0.3 cm左右長的白色種根。

幼苗長度(Seedling length)(cm)=胚芽長+胚根長，隨機從各處理中選取10株紫花苜蓿幼苗，測量幼苗從根基部到胚芽最高部位的絕對長度為胚芽長；測量根基部到根尖的長度為胚根長。

幼苗鮮重(Fresh weight)的測定：隨機從各處理中選10株紫花苜蓿幼苗，濾紙吸干表面水分后稱其鮮重。

活力指數(shù)(Vitality index)=S×Gi(S為幼苗平均長度)

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019軟件進行數(shù)據(jù)整理并用Prism 8軟件作圖；運用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行LSD法比較分析種子部位和滅菌處理及二者交互作用對內(nèi)生根瘤菌數(shù)量的影響，及不同處理對種子發(fā)芽及幼苗生長的影響。

2 結果與分析

2.1 不同滅菌處理對種子不同部位根瘤菌數(shù)量的影響

不同滅菌處理均降低了種子內(nèi)生根瘤菌數(shù)量，DS處理可全面滅除種子內(nèi)生根瘤菌。如圖1所示，所有的部位在不同滅菌處理的內(nèi)生根瘤菌數(shù)量均顯著低于CK(P<0.05)。在4種滅菌處理間，種皮和子葉中，DF處理的內(nèi)生根瘤菌數(shù)量顯著高于其余處理(P<0.05)；胚中，SH10處理的內(nèi)生根瘤菌數(shù)量著高于其余處理(P<0.05)；子葉+胚中，SH10處理的內(nèi)生根瘤菌數(shù)量著低于DF，SH3處理(P<0.05)；種子中，DS處理的內(nèi)生根瘤菌數(shù)量顯著低于其余處理(P<0.05)，其余部位中滅菌處理間的內(nèi)生根瘤菌數(shù)量差異不顯著。

圖1 種子不同部位在不同滅菌處理后的內(nèi)生根瘤菌數(shù)量

在DF，DS，SH3和CK中，子葉+胚的內(nèi)生根瘤菌數(shù)量顯著高于其他部位(P<0.05)；在DF和CK中，胚的內(nèi)生根瘤菌數(shù)量顯著低于其他部位；SH10中，種子的內(nèi)生根瘤菌數(shù)量顯著高于其他部位(P<0.05)，其余處理中各部位間的內(nèi)生根瘤菌數(shù)量差異不顯著。

2.2 不同滅菌處理對種子發(fā)芽能力的影響

如圖2所示，與CK相比，各滅菌處理均不同程度影響了紫花苜蓿種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢。不同滅菌處理下，完整種子處理間的發(fā)芽率和發(fā)芽勢差異不顯著；去皮種子中，DS，SH3，SH10處理的發(fā)芽率顯著高于CK(P<0.05)，同比增長124%，136%，244%，DF，DS，SH3，SH10處理的發(fā)芽勢顯著高于CK(P<0.05)，同比增長163%，300%，163%，655%。同一滅菌處理中，DF，DS，SH3和CK處理下完整種子的發(fā)芽率顯著高于去皮種子(P<0.05)，同比增長188%，70%，61%，288%；DF，DS，SH3和CK處理下完整種子的發(fā)芽勢顯著高于去皮種子(P<0.05)，同比增長217%，109%，228%，763%。

圖2 完整種子和去皮種子在不同滅菌處理下的發(fā)芽率、發(fā)芽勢

如圖3所示，與CK相比，各滅菌處理均不同程度影響了紫花苜蓿種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。不同滅菌處理下，完整種子中，DF，DS和SH10處理的活力指數(shù)顯著低于CK(P<0.05)，同比減少21.14%，15.17%，18.52%；去皮種子中，DS，SH3和SH10處理的發(fā)芽指數(shù)顯著高于CK(P<0.05)，同比增長165.96%，116.20%，302.96%，SH10處理的活力指數(shù)顯著高于CK(P<0.05)，同比增長77.8%。同一滅菌處理中，各處理完整種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著高于去皮種子(P<0.05)。

圖3 完整種子和去皮種子在不同滅菌處理下的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)

2.3 不同滅菌處理對幼苗長度的影響

如圖4所示，與CK相比，各滅菌處理均不同程度影響了紫花苜蓿種子的胚芽長、胚根長和幼苗長。不同滅菌處理下，完整種子處理間的胚芽長、胚根長和幼苗長差異均不顯著；去皮種子中，SH3處理的胚芽、胚根和幼苗長均顯著低于CK(P<0.05)，分別同比減少50.39%，89.68%，77.98%，說明SH3滅菌處理對幼苗伸長的抑制效果最明顯。同一滅菌處理中，各處理完整種子的胚芽長顯著高于去皮種子(P<0.05)；DF，DS，SH3和SH10處理完整種子的胚根長和幼苗長顯著高于去皮種子(P<0.05)。

圖4 完整種子和去皮種子在不同滅菌處理下的胚芽長、胚根長和幼苗長

2.4 不同滅菌處理對幼苗生物量的影響

如圖5所示，與CK相比，各滅菌處理均不同程度影響了紫花苜蓿種子的幼苗鮮重。不同滅菌處理下，完整種子中，DF處理的幼苗鮮重顯著低于CK(P<0.05)，同比減少21.74%；去皮種子中，DF，SH3處理的幼苗鮮重顯著低于CK(P<0.05)，分別同比減少38.06%，40.20%。同一滅菌處理中，SH3處理完整種子的幼苗鮮重顯著高于去皮種子(P<0.05)，其余處理間差異不顯著。

圖5 完整種子和去皮種子在不同滅菌處理下的幼苗鮮重

3 討論

3.1 苜蓿種子內(nèi)生根瘤菌分布及不同滅菌方法對種子內(nèi)生菌數(shù)量的影響

種皮、子葉、胚、子葉-胚連接處的內(nèi)生根瘤菌分別占種子內(nèi)生根瘤菌總量的23.47%，14.18%，6.11%，56.23%，與李劍峰[6]、張淑卿[23]等人的研究結果一致，即內(nèi)生根瘤菌在苜蓿種子中主要存在于種皮及其空隙處，在子葉、胚中只有少量分布，研究進一步將內(nèi)生根瘤菌定位至子葉-胚連接處。根瘤菌可以隨苜蓿的生長被運送到營養(yǎng)器官或繁殖器官中[23]，種子作為繁殖器官是下一代新苜蓿內(nèi)生根瘤菌的重要來源，苜蓿種子內(nèi)生根瘤菌可為苜蓿-根瘤菌共生體系提供物質(zhì)基礎[24]。在種子內(nèi)生根瘤菌滅菌，接種根瘤菌，構建高效共生固氮體系方面，子葉-胚連接處是滅菌的靶向部位，在紫花苜蓿根瘤菌的傳代方面，子葉-胚連接處微環(huán)境適宜，是目的根瘤菌的最佳儲存部位，但需要進一步利用標記菌株進行示蹤試驗。

紫花苜蓿種子在不同滅菌處理下的滅菌效果不同，其中紫花苜蓿種子的內(nèi)生根瘤菌數(shù)量低于子葉+胚中的原因可能是種皮中的一些酚類化合物具有較高的抑菌活性[25]，可以抑制內(nèi)生根瘤菌的繁殖，吸水后這些酚類化合物被釋放出來降低了種子內(nèi)生根瘤菌數(shù)量。在4種滅菌方法中，DF，DS滅菌效果比SH3，SH10好的的原因可能是碘伏和次氯酸鈉的消毒原理不同，碘伏引起細菌芽孢發(fā)生腫脹、變形、凹陷或局部破核，使殼質(zhì)層與皮質(zhì)層的通透屏障破壞[26]，當溶液與種子接觸時，能形成一層極薄的水溶性殺菌膜逐漸解聚釋放出游離碘，從而達到持續(xù)滅菌的目的[27]；次氯酸鈉通過水解形成次氯酸后又分解成新生態(tài)氧，新生態(tài)氧將菌體和病毒上的蛋白質(zhì)氧化后變性從而殺死病原微生物[28]，在相同的滅菌時間中，碘伏可持續(xù)滅菌，擁有更好的滅菌效果。DS比DF滅菌效果更好可能是吐溫-80本身具有一定的抑菌作用[29]，且ST液可提高消毒液的表面活性，增強消毒效果[23]，與碘伏搭配使用可以更好的達到滅菌目的。

3.2 不同滅菌方法對紫花苜蓿種子發(fā)芽及幼苗生長的影響

好的消毒方法需要滿足兩個條件：消滅種子內(nèi)生根瘤菌和減少消毒試劑對種子的傷害。從整體上看，完整種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、胚芽長、胚根長、幼苗長和幼苗鮮重明顯高于去皮種子。其原因可能是豆類植物種皮含有豐富的化合物，如黃酮、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、生物堿、類萜及類固醇等，這些化合物被種皮吸水釋放后，能調(diào)控種胚的液態(tài)、氣態(tài)微環(huán)境[30]，對種子有保護作用，能降低滅菌試劑對種子的傷害。在4種滅菌方法中，DF，DS滅菌處理的完整種子發(fā)芽及幼苗生長效果好于SH3，SH10滅菌處理，其原因可能是碘伏溶液是一種含碘的表面活性劑[31]，化學成分隨載體的不同而變化[32]，可以刺激種子生長。DS處理的完整種子發(fā)芽及幼苗生長效果好于DF處理，其原因可能是ST液中吐溫-80可以提高細胞通透性[33]，低濃度的氯化鈉溶液可調(diào)節(jié)滲透壓，促進種子吸水[34]，刺激發(fā)芽。在完整種子的不同滅菌處理中，種子發(fā)芽率均大于90%，除DF處理的胚芽長小于CK外，其余處理的胚芽長均大于CK，而所有處理胚根長均小于CK，說明吐溫-80和次氯酸鈉可以抑制胚根的生長，促進胚芽的生長。

4 結論

紫花苜蓿種子內(nèi)生根瘤菌主要存在于子葉-胚連接處，當前研究表明相同處理時間下四種滅菌方式的滅菌效果不同，其中碘伏與ST液的聯(lián)合滅菌效果優(yōu)于單獨使用碘伏或次氯酸鈉，紫花苜蓿種子的最佳滅菌方式為碘伏浸泡5 min→無菌水沖洗→ST液浸泡1 min→無菌水沖洗。以后可通過控制滅菌時間開展紫花苜蓿種子內(nèi)生根瘤菌滅菌效果研究，篩選最高效的滅菌方式。