毛積鵬， 高 柱,， 盧玉鵬， 陳 璐， 張小麗， 王小玲*

(1.江西省科學(xué)院 生物資源研究所， 江西 南昌 330096； 2.井岡山生物技術(shù)研究院， 江西 吉安 343016)

0 引言

獼猴桃(Actinidia spp.)是20世紀(jì)由野生到人工商業(yè)化栽培馴化最為成功的果樹種類之一，富含維生素、礦物質(zhì)、氨基酸、有機(jī)酸等對(duì)人體健康有益的代謝產(chǎn)物，因其獨(dú)特的風(fēng)味，已成為世界上最受歡迎的水果之一[1-4].中國是獼猴桃的原產(chǎn)國，同時(shí)也是全球最大的獼猴桃種植國家，種植區(qū)主要分布在陜西、四川、云南、貴州、江西等地，是適種地區(qū)農(nóng)民脫貧致富的支柱產(chǎn)業(yè)[5].雖然全球范圍內(nèi)中國獼猴桃的產(chǎn)量穩(wěn)居第一，年產(chǎn)量300萬噸以上，但表觀消費(fèi)量均值僅230萬噸左右，加工比例僅10%，貯藏比例不足20%.采后腐爛率高達(dá)20%～30%，商品化率小于60%，即買即食率10%以下[6].究其原因，主要是我國獼猴桃產(chǎn)業(yè)采后保鮮和品質(zhì)提升技術(shù)落后、重采前輕采后等產(chǎn)業(yè)問題突出，從而影響了消費(fèi)者口碑和市場競爭力[7].

可溶性糖作為水果風(fēng)味的重要組成部分，在果實(shí)品質(zhì)形成中扮演著重要的角色.果實(shí)中可溶性糖主要為蔗糖、果糖和葡萄糖，不同園藝作物或不同發(fā)育和成熟階段果實(shí)的優(yōu)勢(shì)糖組分差異顯著[8].例如，柑橘主要糖組分是蔗糖[9]，蘋果主要糖組分是果糖[10].有機(jī)酸也是決定水果風(fēng)味的主要成分之一，在維持水果品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值方面起著重要的作用.水果中含有多種有機(jī)酸，但大多數(shù)水果只以其中一種或幾種為主.例如，柑橘、草莓和菠蘿等水果中的主要有機(jī)酸為檸檬酸；蘋果、枇杷和梨等水果中的主要有機(jī)酸為蘋果酸；獼猴桃中的主要有機(jī)酸則為奎寧酸和檸檬酸[11-13].

不同種類的獼猴桃在口感和營養(yǎng)品質(zhì)方面存在較大的差異[14-16].本研究以我國選育的世界首個(gè)紅肉品種“紅陽”獼猴桃、首個(gè)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化栽培的種間雜交品種“金艷”獼猴桃和新西蘭“金果”獼猴桃三種風(fēng)味差異較大的中華獼猴桃果實(shí)為研究材料，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)方法對(duì)三種獼猴桃果實(shí)的可溶性糖和有機(jī)酸酸組分及其含量進(jìn)行測定與分析.旨在為中華獼猴桃品種品質(zhì)的評(píng)價(jià)及采后品質(zhì)提升技術(shù)的開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

分別于2021年的8月、9月和10月從江西省奉新縣江西省科學(xué)院博士獼猴桃基地(E 114°45′，N 28°34′)采取供試的“紅陽”、“金果”和“金艷”獼猴桃果實(shí).每個(gè)品種隨機(jī)選取30個(gè)大小均一的健康果實(shí)，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后選取15個(gè)果實(shí)去皮、去籽，冷凍干燥磨粉后于-80 ℃保存?zhèn)溆?，其?5個(gè)室溫放置軟熟后(硬度0.8～1 kg/cm2)進(jìn)行取樣.每5個(gè)果實(shí)混合為一份樣本，共3個(gè)生物學(xué)重復(fù).

色譜級(jí)甲醇，異丙醇，乙腈，Merc公司；色譜級(jí)正己烷，標(biāo)準(zhǔn)品，德國CNW公司；色譜級(jí)甲酸，99%純度的甲氧胺鹽，吡啶和N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA),Sigma公司.

1.2 主要儀器

LC-MS/MS(OTRAP6500+)美國SCIEX公司；GC-MS(7890-5975C)美國Agilent公司；離心機(jī)(5424R)德國Eppendorf公司；球磨儀(MM400)德國Retsch公司；冷凍干燥機(jī)(Centri Vap)美國Labconco公司；多管渦旋振蕩器(Mix-200)上海凈信科技有限公司；超聲清洗儀(KQ5200E)昆山舒美超聲儀器公司；氮吹儀(XD-DCY-24Y)上海析達(dá)儀器有限公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 可溶性糖組分測定

樣本制備參考Sun等[17]的方法進(jìn)行改進(jìn)，具體操作步驟如下:稱取20 mg粉末樣本于2 mL離心管中，加入500 μL提取液(甲醇∶異丙醇∶水，3∶3∶2)，渦旋3 min， 冰水中超聲30 min，4 ℃，14 000 r/min離心5 min；轉(zhuǎn)移50 μL上清液至另一個(gè)干凈的1.5 mL離心管中，并加入20 μL濃度為100 μg/mL的核糖醇內(nèi)標(biāo)溶液，氮吹并冷凍干燥后加入100 μL濃度為15 mg/mL的甲氧銨鹽吡啶，37 ℃孵育2 h；隨后加入100 μL的BSTFA，37 ℃孵育30 min得到衍生化溶液，取50 μL的衍生化溶液用正己烷稀釋至1 mL，保存于棕色進(jìn)樣瓶中，用于GC-MS分析.

色譜主要條件：色譜柱為HP-5MS(30 m×0.25 mm × 0.25 μm),載氣為氦氣，不分流.程序升溫條件：70 ℃ 保持1 min， 隨后以30 ℃/min升溫至112 ℃，再分別以15 ℃/min升溫至175 ℃，3 ℃/min升溫至190 ℃，35 ℃/min升溫至240 ℃，10 ℃/min升溫至280 ℃，傳輸線溫度240 ℃，進(jìn)樣量為2 μL.質(zhì)譜主要條件：溶劑切割時(shí)間為5.5 min離子源溫度為230 ℃，電離電壓為70 eV，以分辨率70 000進(jìn)行全掃描，掃描范圍為81～1 000 m/z，掃描周期為0.2 s

1.3.2 有機(jī)酸組分測定

稱取50 mg粉末樣本于2 mL離心管中，立即加入500 μL提前-20 ℃預(yù)冷的甲醇提取液，渦旋3 min.4 ℃條件下，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液300 μL于1.5 mL離心管中，-20 ℃靜置30 min，4 ℃條件下，再12 000 r/min離心10 min，取上清液200 μL于進(jìn)樣瓶中-20 ℃保存用于UPLC-MS/MS分析.

液相主要條件：色譜柱為ACQUITY HSS T3 (1.8 μm,100 mm×2.1 mm )，流動(dòng)相A相，超純水(0.05%甲酸)，B相，乙腈(0.05%甲酸).梯度洗脫程序?yàn)? min A/B為95∶5(V∶V),8～9.5 min A/B為5∶95，9.6～12 min A/B為95∶5，流速為0.35 ml/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量2 μL.質(zhì)譜主要條件為：電噴霧離子源溫度550 ℃，正離子模式下質(zhì)譜電壓5 500 V,負(fù)離子模式下質(zhì)譜電壓-4 500 V，氣簾氣為35 psi.

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過 Proteowizard 軟件(V.3.0.8789)將獲得的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成 mzXML 格式，隨后利用 R(V.3.3.2)的 XCMS 程序包進(jìn)行峰識(shí)別、峰過濾和峰對(duì)齊分析，利用Aglient Masshunte軟件進(jìn)行積分峰匹配.采用MultiQuant 3.0.3軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)，參考標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間與峰型信息進(jìn)行積分校正與定性分析，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)檢出目標(biāo)物進(jìn)行定量分析.t檢驗(yàn)用于含量差異顯著性分析，采用Z-Score法進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化處理并利用MeV 4.8.1軟件進(jìn)行聚類分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 總離子流色譜圖分析

獼猴桃果實(shí)可溶性糖和有機(jī)酸檢測樣本的總離子流色譜圖分別如圖1和圖2所示.結(jié)果表明，可溶性糖和有機(jī)酸檢測總離子流的曲線重疊性高，保留時(shí)間和峰強(qiáng)度高度一致，儀器穩(wěn)定性高，檢測結(jié)果可靠.可溶糖的出峰時(shí)間在11～25 min之間，有機(jī)酸的出峰時(shí)間0.5～5.0 min之間.可溶性糖和有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程相關(guān)系數(shù)分別介于0.992～0.999和0.991～0.999之間(線性方程數(shù)據(jù)未列出).表明在設(shè)定的高效液相色譜條件下各種可溶性糖和有機(jī)酸組分的峰面積與其含量有較好的線性相關(guān)性.

圖1 基于GC-MS分析的獼猴桃可溶性糖總離子流色譜圖

圖2 基于UPLC-MS/MS分析的獼猴桃有機(jī)酸總離子流色譜圖

2.2 可溶性糖組分及含量差異分析

通過標(biāo)樣驗(yàn)證在3種獼猴桃果實(shí)中共鑒定到12種可溶性糖，主要為蔗糖、果糖和葡萄糖(如表1所示)，這和其它果實(shí)中的主要可溶性糖組分基本一致[9,10,18].蔗糖、果糖和葡萄糖在3種獼猴桃軟熟期的含量均極顯著高于采收期(如表1所示).

表1 不同獼猴桃品種果實(shí)采收和軟熟期可溶性糖組分及平均含量 (mg/g)

在采收期，蔗糖在“紅陽”中含量略高于“金果”和“金艷”，葡萄糖在“金果”中的含量略高于“金艷”，而極顯著高于“紅陽”(p<0.001).果糖在“金果”和“金艷”中的含量無明顯差異，但均高于“紅陽”.在相應(yīng)獼猴桃的軟熟期，蔗糖在“金艷”中的含量高于“紅陽”和“金果”，葡萄糖在“金果”中的含量高于“紅陽”和“金艷”，這與采收期的結(jié)果一致；果糖在“金果”中的含量最高，但在“紅陽”和“金艷”中的含量無明顯差異(p>0.05).初步表明“紅陽”果糖的積累可能主要發(fā)生在采后軟熟過程中，采收期果糖含量只有17.623 mg/g，到而軟熟期果糖含量高達(dá) 72.454 mg/g，其含量增加了4.11倍.

肌醇在3種獼猴桃軟熟期的含量均低于采收期.海藻糖、阿拉伯糖和山梨醇在3種獼猴桃軟熟期的含量均略高于采收期，與3種主要可溶性糖含量的變化結(jié)果一致.麥芽糖、半乳糖和鼠李糖在“紅陽”和“金艷”軟熟期的含量均高于采收期(如表1所示)，在“金果”軟熟期的含量則低于采收期.巖藻糖和木糖醇分別只在“紅陽”和“金果”獼猴桃的軟熟期被檢測到.一種可能是巖藻糖和木糖醇分別在“紅陽”和“金果”獼猴桃果實(shí)軟化過程中才開始被逐漸合成.另一種可能則是這兩種糖在對(duì)應(yīng)獼猴桃果實(shí)采收期的含量低于GC-MS的檢測下限.

2.3 有機(jī)酸組分及含量差異分析

在三種獼猴桃果實(shí)中共鑒定到31種有機(jī)酸，主要為奎寧酸、檸檬酸和蘋果酸，其次是順式-烏頭酸、丙酮酸和泛酸(如表2所示).這與其它獼猴桃品種果實(shí)中有機(jī)酸的主要成分基本一致[15].“紅陽”和“金果”中含量最高的是奎寧酸，其次是檸檬酸和蘋果酸，而“金艷”采收期含量最高的是檸檬酸，軟熟期含量最高的是奎寧酸.奎寧酸的含量在3種獼猴桃的采收期和軟熟期無明顯差異(p>0.05)；檸檬酸在3種獼猴桃軟熟期的含量均顯著高于采收期(如表2所示)；蘋果酸在“紅陽”軟熟期的含量低于采收期，在“金果”軟熟期的含量高于采收期，在“金艷”軟熟期和采收期的含量則基本一致.這初步表明，檸檬酸降解可能是這三種獼猴桃果實(shí)采后酸度下降的主要因素.

表2 不同獼猴桃品種果實(shí)采收期和軟熟期有機(jī)酸組分及平均含量 (μg/g)

順式-烏頭酸和泛酸在“紅陽”軟熟期和采收期的含量無顯著差異，在“金果”軟熟期和含量顯著低于采收期，在“金艷”軟熟期的含量則顯著高于采收期(如表2所示).反式-烏頭酸在“紅陽”軟熟期和采收期的含量無明顯差異，在“金果”和“金艷”獼猴桃軟熟期的含量則顯著低于采收期(如表2所示).隱綠原酸和新綠原酸在“紅陽”和“金艷”軟熟期的含量高于采收期，在“金果”獼猴桃軟熟期的含量則低于采收期.齊墩果酸在“紅陽”軟熟期的含量顯著低于采收期，在“金果”和“金艷”軟熟期的含量顯著高于采收期.琥珀酸在“紅陽”獼猴桃軟熟期的含量顯著高于采收期.酒石酸在“金果”和“金艷”軟熟期的含量顯著高于采收期，在“紅陽”軟熟期的含量顯著低于采收期.戊二酸、沒食子酸、甲基丁二酸、壬二酸、葵二酸和辛二酸在“紅陽”和“金果”軟熟期的含量均低于采收期，而在“金艷”軟熟期的含量則均高于采收期.

肉桂酸只在“金艷”的軟熟期被檢測到，含量為148.865 μg/g.阿魏酸則只在“金果”的軟熟期和“金艷”的采收期被檢測到，其含量分別為0.039 μg/g和0.029 μg/g.丙酮酸、苯甲酸、水楊酸、莽草酸和?；撬嵩?種獼猴桃軟熟期和采收期的含量無明顯差異.以上初步表明，不同品種獼猴桃果實(shí)有機(jī)酸組分基本一致，但各組分的含量有明顯差異.

2.4 糖酸比與聚類分析

除糖酸組分外，糖酸比(總糖/總酸)在很大程度上決定了果實(shí)風(fēng)味.由表1和表2分析可得，軟熟期“紅陽”、“金果”和“金艷”獼猴桃的糖酸比值分別為11.36、9.7和10.9，雖然“金果”獼猴桃的總糖含量最高，但受有機(jī)酸含量的影響，其甜度最低.

對(duì)12種可溶性糖和含量較高的19種有機(jī)酸的含量數(shù)據(jù)歸一化處理后分別進(jìn)行聚類分析.結(jié)果表明：“紅陽”、“金果”和“金艷”三種獼猴桃的可溶性糖和有機(jī)酸含量分別在采收期和軟熟期被直觀地聚類為兩組(如圖3所示).綜合表明，三個(gè)品種的獼猴桃果實(shí)在采后軟熟過程中的可溶性糖和有機(jī)酸的變化趨勢(shì)是基本一致的.

圖3 三種獼猴桃可溶性糖和有機(jī)酸含量的聚類熱圖分析( JY、JG和HY分別表示“金艷”、“金果”和“紅陽”；1、2分別表示采收期和軟熟期)

3 結(jié)論

本研究利用基于GC-MS和UPLC-MS/MS技術(shù)平臺(tái)的代謝組學(xué)方法對(duì)“紅陽”、“金果”和“金艷”三個(gè)品種獼猴桃果實(shí)采收期和軟熟期的可溶性糖和有機(jī)酸組分進(jìn)行測定與分析，結(jié)果共鑒定到12種可溶性糖和31種有機(jī)酸.采收期三種獼猴桃果實(shí)的蔗糖、果糖和葡萄糖含量無明顯差異，軟熟期則以葡萄糖和果糖為主.“紅陽”和“金果”獼猴桃采收期和軟熟期的有機(jī)酸均以奎寧酸為主，“金艷”獼猴桃采收期以檸檬酸為主，軟熟期以奎寧酸為主.奎寧酸和蘋果酸在三種獼猴桃果實(shí)軟熟期和采收期的含量差異不顯著，檸檬酸是影響獼猴桃果實(shí)采后酸度的重要因素.糖酸比分析結(jié)果表明“紅陽”最甜，“金艷”適中，“金果”風(fēng)味較淡.聚類分析結(jié)果表明三種獼猴桃的糖酸組分及采后的變化趨勢(shì)基本一致，但各組分的含量差異明顯.