魏 婷， 李 紅， 楊代忠， 張亞文， 張春平

(1.陜西科技大學 環(huán)境科學與工程學院， 陜西 西安 710021； 2.中國建筑材料工業(yè)建設(shè)西安工程有限公司， 陜西 西安 710000)

0 引言

土壤是一個國家最重要的自然資源，它是農(nóng)業(yè)發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，但環(huán)境中約90%的污染物存在于土壤中，其中主要以無機污染物為主[1].城市化建設(shè)、固體廢棄物堆積、農(nóng)藥施用、污水灌溉、污泥農(nóng)用等人類活動均可使土壤重金屬含量增加，污染加重.鎘(Cadmium,Cd)是我國土壤重金屬污染的主要元素之一，毒性極強，易被植物吸收，不僅對植物的生長發(fā)育有抑制作用，還會通過食物鏈進入人體并在人體內(nèi)累積，具有致病、致癌和致突變作用[2].2014年全國土壤污染狀況調(diào)查公報顯示，我國土壤重金屬總超標率達到16.1%，其中，Cd的點位超標率高達7%[3].因此，土壤Cd污染已經(jīng)成為了影響生態(tài)環(huán)境、耕地質(zhì)量以及制約經(jīng)濟發(fā)展的重要因素.

當植物受到重金屬脅迫時，會導致植物細胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)積累并引起膜脂過氧化.丙二醛(Malonyldialdehyde,MDA)作為膜脂過氧化產(chǎn)生的一種有毒物質(zhì)，是衡量植物細胞膜受到的氧化損傷程度的重要指標[4]，研究表明，Cd脅迫會使得植物體內(nèi)MDA含量升高[5,6].另一方面，ROS能和植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子反應(yīng)從而破壞其結(jié)構(gòu)和功能[7].植物體在未受到生物或非生物脅迫時，ROS的含量處在一個動態(tài)平衡的水平，一旦受到脅迫，便會產(chǎn)生過量的ROS，對植物體的正常生長造成影響.但是，植物細胞可通過自身具有的抗氧化系統(tǒng)維持植物體內(nèi)ROS的動態(tài)平衡，該系統(tǒng)包括抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)，抗氧化酶系統(tǒng)由超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、過氧化物酶(Peroxidase,POD)、抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)等組成[8].其中，SOD是植物細胞內(nèi)的第一道氧化防線，它可以催化ROS中的O2-發(fā)生歧化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為H2O2和H2O，接著POD和CAT將反應(yīng)生成的H2O2和細胞膜脂過氧化累積的H2O2催化分解為H2O和O2，同時，APX對清除植物體內(nèi)的H2O2有重要的作用，可將其還原為H2O[9]，這些抗氧化酶共同協(xié)作，共同抵御ROS對植物細胞的傷害.張茂等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，黑麥草中SOD和POD活性均隨著Pb2+，Zn2+和Cd2+脅迫濃度的增加呈現(xiàn)先增加后減少趨勢.Hediji等[11]的研究也發(fā)現(xiàn)，在Cd脅迫下，豆子中SOD、POD和APX活性都升高.

茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,MeJA)是受外界刺激后反應(yīng)最快的信號分子之一，作為內(nèi)源性植物生長調(diào)節(jié)劑，在植物應(yīng)激反應(yīng)和生長調(diào)節(jié)過程中具有廣泛作用[12,13].研究發(fā)現(xiàn)，MeJA對于提高植物重金屬抗性和調(diào)控植物重金屬累積具有重要意義[14].Yan等[15]通過對觀賞辣椒外源施用MeJA發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫下可增加觀賞辣椒的干重和葉綠素含量.有研究發(fā)現(xiàn)[16]，MeJA可有效抑制Cd從秋茄地下部向地上部運輸，減輕地上部Cd累積.

植物根際土壤中存在著數(shù)量和種類驚人的微生物種群，定殖在植物根際通過產(chǎn)生植物生長激素、固氮、溶解無機磷酸鹽、拮抗植物病源菌等方式，促進宿主植物生長發(fā)育，這類細菌被稱為植物根際促生菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria,PGPR)[17].一方面，PGPR通過分泌各種植物激素直接影響其根系發(fā)育，另一方面則通過分泌多種信號物質(zhì)調(diào)控植物根系的內(nèi)源激素途徑而影響根系構(gòu)型，以達到活化根際養(yǎng)分和促進根系發(fā)育提高養(yǎng)分的利用效率，緩解重金屬、干旱、鹽分等環(huán)境因子脅迫，促進植物的生長的目的[18,19].此外，根際促生菌與植物根系以及土壤形成特殊的微環(huán)境，影響植物重金屬抗性、吸收轉(zhuǎn)運以及在植物可食用部分的累積，是一種理想的植物逆境脅迫生物調(diào)控措施.研究表明[20]，接根際促生菌可顯著增加小麥根部和地上部干重，降低根部和地上部Cd含量.

番茄是世界范圍內(nèi)重要的蔬菜作物，也是植物學研究的經(jīng)典模式植物，我國番茄栽培面積和總產(chǎn)量均居世界首位.但由于我國番茄產(chǎn)地的土壤Cd污染較普遍，對番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)安全造成了嚴重影響[21].本研究通過水培試驗，研究了MeJA與根際促生菌單獨或聯(lián)合施用對Cd脅迫下番茄幼苗Cd抗性和Cd累積的影響，旨在為利用MeJA和根際促生菌緩解番茄重金屬脅迫提供理論依據(jù)和實踐指導.

1 實驗部分

1.1 供試材料

本試驗的番茄種子購自新疆石河子蔬菜研究所.MeJA購自國藥集團化學試劑有限責任公司.試驗所用細菌是前期從重金屬污染的土壤中分離出的具有耐Cd性的鞘氨醇單胞菌D36菌株，其GenBank登錄號為：MN540917.1.

1.2 實驗設(shè)計

挑選籽粒飽滿的番茄種子用3%的次氯酸鈉溶液將其浸泡約15 min，再用去離子水將種子沖至無色無味后均勻放置于裝有蛭石的穴盤表面，在種子表面撒一層薄蛭石避光發(fā)芽，并移至人工氣候室繼續(xù)培養(yǎng).人工氣候室的晝夜溫度為26 ℃/20 ℃，時間為16 h/8 h，相對濕度60%.待幼苗長至“兩葉一心”時，將其轉(zhuǎn)移至裝有10 L營養(yǎng)液的周轉(zhuǎn)箱，先用1/4濃度的Hoagland培養(yǎng)液培養(yǎng)兩周，一周更換一次培養(yǎng)液，第三周選取長勢一致的幼苗轉(zhuǎn)移至水培罐內(nèi)用1/2濃度的Hoagland培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng).幼苗在1/2培養(yǎng)液中培養(yǎng)一周后，對番茄幼苗進行處理.24 h后進行Cd(CdCl2·2.5H2O)脅迫處理.

處理組如下：CK、Cd、MeJA、D36、Cd+MeJA、Cd+D36和Cd+MeJA+D36，其中，CK為對照，Cd的處理濃度為3 mg L-1，MeJA處理濃度為2.5 μmol L-1，D36接菌處理將菌液(OD600=1.0)浸根90 min.MeJA用酒精溶解后稀釋到工作濃度，使用噴壺均勻地噴施在番茄幼苗葉面上，噴至葉面全濕，有液滴低落為止.在24 h后對番茄幼苗進行Cd(CdCl2·2.5H2O)脅迫處理，樣品于Cd處理7天后采樣進行檢測.

1.2.1 根長株高的測定

選取8株番茄幼苗，水平放置在吸水紙上，用刻度尺分別量取根長與株高.

1.2.2 鮮重與干重的測定

選取8株番茄幼苗，用去離子水沖去根部殘留的營養(yǎng)液，并用濾紙吸干表面水分，用分析天平稱取鮮重并記錄，再將其放置在105 ℃烘箱中殺青半小時后，于80 ℃烘箱烘干至恒重并稱重記錄，即為干重.

1.2.3 番茄幼苗對Cd的抗性指數(shù)的計算

按下式計算番茄幼苗對Cd的抗性指數(shù)[22,23]：

抗性指數(shù)(%)=(m1/m2)×100

其中：m1指經(jīng)處理后番茄幼苗的干重；m2指未經(jīng)處理番茄幼苗的干重.

1.2.4 番茄幼苗光合色素含量的測定[24]

稱取葉片鮮重0.2 g，用2～3 mL 95%乙醇研磨成勻漿，加95%的乙醇至10 mL，繼續(xù)研磨至組織變白，靜置2～3 min.在波長665 nm、649 nm、470 nm下，以95%乙醇為空白，測定葉綠體色素提取液的吸光度.

1.2.5 番茄幼苗丙二醛(MDA)含量的測定

取不同處理的番茄幼苗0.2 g，在冰浴中用5 mL 0.05 mol L-1磷酸緩沖液研磨成勻漿，加入5 mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液搖勻，將試管放入沸水浴中煮沸10 min(自試管出現(xiàn)小氣泡時開始計時)，冷卻后，離心，并以硫代巴比妥酸溶液為空白測532 nm、600 nm和450 nm處的吸光度.

1.2.6 番茄幼苗抗氧化酶活性的測定

取不同處理的番茄幼苗0.2 g，用0.1 mol L-1磷酸緩沖液(pH 7.0)在冰浴研磨成勻漿，即為酶提取液[25].POD和SOD均采用魏婷等[26]的方法.POD活性采用愈創(chuàng)木酚氧化法測定.酶活性測定體系含有：磷酸緩沖液、愈創(chuàng)木酚溶液、H2O2溶液和酶提取液.迅速混合啟動反應(yīng)，同時立即開始計時.于470 nm下測定30 s和90 s之間的變化值.SOD活性測定采用四唑氮藍法.酶活性測定體系含有：磷酸緩沖液，甲硫氨酸溶液，四唑氮藍溶液，核黃素溶液，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)溶液、酶粗液和蒸餾水.在避光條件下加入全部試劑，搖勻，將試管至于4 000×熒光燈下顯色15～20 min，溫度控制在25 ℃～35 ℃之間，反應(yīng)結(jié)束后避光終止反應(yīng)，在560 nm下測定反應(yīng)液的吸光度.測定時除樣品管外，需添加光下和黑暗對照各4管.

抗壞血酸過氧化物酶(APX)參考盧倩倩[27]的方法.酶活性測定體系含有：APX反應(yīng)液，酶提取液和H2O2反應(yīng)液，并于290 nm下測定1 min內(nèi)的吸光度變化值.

1.2.7 番茄幼苗的Cd含量

分別收集番茄幼苗的根、莖和葉，將幼苗的根在5 mmol L-1EDTA-Na2溶液中浸泡15 min以去除根部表面吸附的Cd，然后用去離子水沖洗數(shù)次.將樣品在110 ℃殺青后，在70 ℃烘干至恒重.將植物干樣分別稱取0.1 g于消解管中，每個處理做四個平行，并貼好標簽，加入10 mL HNO3加蓋浸泡10 h后進行消解，消解條件為：80 ℃消解1.5 h，120 ℃消解1.5 h，150 ℃消解3 h，升至175 ℃時開蓋趕酸至1 mL，用2% HNO3定容至10 mL，過濾，然后使用原子吸收光譜儀進行Cd含量的測定.

1.3 數(shù)據(jù)分析

本實驗采用Excel 2010統(tǒng)計數(shù)據(jù)，采用SPSS 20.0進行單因素方差分析和多重比較(p<0.05)，用Origin Pro8軟件進行繪圖，所有數(shù)據(jù)均為三次實驗平均值.

2 結(jié)果與討論

2.1 MeJA和D36處理對Cd脅迫下番茄幼苗根長和株高的影響

Cd是一種植物非必需的重金屬元素，對植物的生長具有毒害作用，會抑制其正常的生長發(fā)育.如圖1所示，在Cd脅迫下，番茄幼苗植株的根長和株高受到明顯抑制(p<0.05)，相比于CK，Cd處理使得番茄幼苗的根長降低了14.52%，而MeJA和D36能在一定程度上緩解Cd脅迫引起的番茄生長抑制，其中，相比于單獨Cd處理，Cd+MeJA處理使番茄根長和株高分別提高了5.24%和14.32%，Cd+D36處理使番茄幼苗株高提高16.39%.Cd+MeJA+D36處理與單獨Cd處理相比可顯著提高番茄幼苗的根長和株高，分別提高了11.37%和14.76%.由此可知，在Cd脅迫下，外源MeJA和D36處理可緩解Cd脅迫引起的番茄生長抑制.

圖1 不同處理對番茄幼苗根長和株高的影響

2.2 MeJA和D36處理對Cd脅迫下番茄幼苗鮮重和干重的影響

植物的生物量是研究植物的生長狀況時選取的主要指標.由圖2可知，在Cd脅迫下，番茄幼苗的生物量明顯受到抑制.番茄地上部和地下部鮮重分別降低了24.44%和26.05%，干重分別降低了23.53%和11.13%.Cd+MeJA，Cd+D36，Cd+MeJA+D36處理均顯著提高了Cd脅迫下番茄的生物量.其中，Cd+MeJA+D36處理效果最為顯著，使得番茄地上部和地下部的鮮重分別增加了14.13%和30.59%，干重分別增加了35.54%和44.62%.這可能是因為MeJA作為一種植物生長調(diào)節(jié)劑，可以調(diào)控植物體內(nèi)其他內(nèi)源激素(如乙烯、赤霉素、生長素等)的含量，對植物的生長發(fā)育和抗逆生理反應(yīng)起著重要作用，從而直接或間接的使番茄幼苗的生物量升高[28,29].此外，D36菌株具有產(chǎn)IAA的能力[30]，IAA已被證明對細胞增大、分裂以及組織分化等一些物理過程會產(chǎn)生積極影響，從而刺激植物生長和發(fā)育[31].

圖2 不同處理對番茄幼苗生物量的影響

2.3 不同處理對番茄幼苗Cd的抗性指數(shù)的影響

由圖3可知，與CK對照組相比，Cd處理使番茄幼苗對Cd的抗性顯著降低了24.94%.與單獨的Cd處理相比，Cd+MeJA+D36處理使得番茄幼苗對Cd的抗性增加了42.33%(p<0.05).其原因可能是MeJA具有誘導番茄幼苗系統(tǒng)抗性和抗氧化反應(yīng)的能力，可緩解Cd脅迫引起的生長發(fā)育抑制.此外，根際促生菌可以通過固氮、溶解磷酸鹽和產(chǎn)鐵載體來提高植物的營養(yǎng)水平[32].另一方面根際促生菌可以刺激植物生長和發(fā)育，因為它們能夠產(chǎn)生植物激素和分泌次生代謝物[33]，誘導植物產(chǎn)生一系列生理生化變化，從而直接或間接調(diào)節(jié)植物對重金屬的吸收和植物毒性.

圖3 不同處理對番茄幼苗Cd抗性指數(shù)的影響

2.4 MeJA和D36處理對Cd脅迫下番茄幼苗光合色素含量的影響

葉綠素是植物光合作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，其含量是衡量葉片衰老的重要生理指標，各種環(huán)境脅迫均可導致葉綠素的破壞與降解[34].如圖4所示，與Cd處理相比，Cd+MeJA+D36處理提高了番茄幼苗葉片中葉綠素a和類胡蘿卜素的含量，葉綠素b含量無顯著變化(p<0.05).接種根際促生菌對葉綠素累積具有促進作用，這可能是因為根際促生菌可以通過釋放有助于合成光合色素的物質(zhì)來增加植物對的養(yǎng)分吸收，從而提高光合色素含量[35].此外，有研究表明，適當濃度的MeJA對有毒金屬脅迫下光合色素的積累有積極作用[36,37].同時，MeJA可以提高光合色素合成相關(guān)關(guān)鍵酶的基因表達從而提高植物葉片中的色素含量[38].

圖4 不同處理對番茄幼苗光合色素含量的影響

2.5 MeJA和D36處理對Cd脅迫下番茄幼苗MDA含量的影響

MDA是由于膜脂過氧化而產(chǎn)生的一種有毒物質(zhì)，大量積累會導致植物細胞過氧化程度升高，破壞細胞結(jié)構(gòu)甚至導致細胞致死[39].由圖5可知，與CK相比，Cd處理使得番茄幼苗地上部和地下部的MDA含量分別增加了46.33%和22.51%(p<0.05).這可能是因為Cd與植物體內(nèi)的其他陽離子存在競爭，其與巰基(-SH)結(jié)合后會破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，從而打破自由基產(chǎn)生和清除之間的平衡，使得MDA累積增加[40].另外，受Cd脅迫的番茄幼苗細胞膜中存在的不飽和脂肪，由于活性氧自由基對細胞膜的破壞作用，促進了丙二醛的合成[41].與單獨Cd處理相比，Cd+MeJA，Cd+D36，Cd+MeJA+D36顯著降低了番茄體內(nèi)的MDA含量，其中，Cd+MeJA+D36處理使番茄幼苗地上部和地下部的MDA含量降低了28.63%和45.84%，這可能是由于外源添加MeJA和植物促生菌后，番茄幼苗中抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量升高，加速了Cd脅迫誘導產(chǎn)生的過量MDA降解，減少Cd脅迫下MDA的累積，從而減輕番茄幼苗的氧化損傷.

圖5 不同處理對番茄幼苗的MDA含量的影響

2.6 MeJA和D36處理對Cd脅迫下番茄幼苗SOD活性的影響

SOD是活性氧清除反應(yīng)過程具有重要作用的抗氧化物酶之一，在抗氧化酶類中處于核心地位.SOD對于清除氧自由基，避免細胞受氧自由基的氧化損傷，保護細胞正常的組成、結(jié)構(gòu)和功能具有十分重要的意義[42].由圖6可知，與CK相比，Cd處理后番茄幼苗地上部SOD活性升高5.38%，地下部的SOD活性無明顯變化(p<0.05).與單獨Cd處理相比，Cd+MeJA，Cd+D36，Cd+MeJA+D36處理提高了SOD活性，其中，Cd+MeJA+D36處理效果最為顯著，使得地上部和地下部SOD活性分別增加了10.53%和28.17%，說明MeJA和D36在一定程度上可以提高SOD的活性，減輕番茄幼苗受到的氧化損傷.

圖6 不同處理對番茄幼苗的SOD活性的影響

2.7 MeJA和D36處理對Cd脅迫下番茄幼苗POD活性的影響

植物體在POD的催化作用下，可將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O，減輕植株的氧化損傷.由圖7可知，與CK相比，Cd處理使番茄幼苗地上部POD活性上升了35.41%(p<0.05)，Cd+MeJA+D36處理相比于單獨的Cd處理，地上部POD活性增加了25.58%，表明MeJA和D36會升高番茄幼苗POD活性，提高處理過的番茄幼苗的抗氧化水平.研究顯示，MeJA和根際促生菌影響了抗氧化酶合成相關(guān)基因的表達，提高番茄幼苗對Cd的耐受性，從而減輕Cd對番茄幼苗的脅迫[30].Farooq等[43]的研究發(fā)現(xiàn)，重金屬脅迫可以誘導抗氧化酶的基因的表達，而外源MeJA處理進一步增強了這些基因在相應(yīng)處理條件下的表達.

圖7 不同處理對番茄幼苗的POD活性的影響

2.8 MeJA和D36處理對Cd脅迫下番茄幼苗APX活性的影響

APX對植物細胞內(nèi)H2O2的清除有著舉足輕重的作用，可將其還原為H2O.如圖8所示，與CK對照組相比，Cd處理后番茄幼苗APX活性無顯著變化(p<0.05).與單獨Cd處理相比，Cd+MeJA+D36處理后，番茄幼苗地下部APX的活性顯著提升44.89%，表明抗氧化酶對于清除由Cd脅迫引起的ROS累積具有重要作用，抗氧化酶活性的提高可能是番茄幼苗的重金屬解毒機制之一[44].

圖8 不同處理對番茄幼苗的APX活性的影響

抗氧化酶活性受脅迫植物的種類、生長條件、培養(yǎng)方式和脅迫因子的暴露時間和劑量不同也會影響抗氧化酶的活性[45].在脅迫條件下，茉莉酸甲酯和植物根際促生菌處理植株后SOD、APX、POD活性均高于單獨脅迫處理的植株，這也在其它研究[25,46,47]中被證明，說明施用外源植物激素和根際促生菌可以提高SOD、POD、APX這些常規(guī)抗氧化酶的活性，通過減少細胞膜脂過氧化，保持細胞膜完整性進而有效降低脅迫對植株造成的傷害.

2.9 MeJA和D36處理對Cd脅迫下番茄幼苗Cd含量的影響

不同處理對番茄幼苗Cd含量的影響如圖9所示，與Cd處理相比，Cd+MeJA、Cd+D36和Cd+MeJA+D36處理使得根部Cd含量分別降低了5.57%、9.31%和18.57%，莖部Cd含量分別降低了9.42%、12.42%和15.49%，葉部Cd含量分別降低了44.80%、2.66%和44.80%.表明在Cd脅迫下，MeJA或D36均可使番茄幼苗各組織的Cd含量降低，其中，Cd+MeJA+D36處理效果最為顯著(p<0.05).研究顯示，根際促生菌分泌的鐵載體可通過抑制鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運體的表達而增加植物對鐵的獲取從而減少對Cd的吸收[48].研究顯示，MeJA可通過降低番茄幼苗根部Cd2+的內(nèi)流速率，從而抑制番茄幼苗對Cd的吸收[49]，此外，MeJA能夠調(diào)節(jié)重金屬轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達，從而干擾Cd在植物體內(nèi)的吸收和運轉(zhuǎn).

圖9 不同處理對番茄幼苗的Cd含量的影響

3 結(jié)論

(1) MeJA和D36處理可有效緩解Cd脅迫引發(fā)的番茄幼苗生長抑制，增加Cd脅迫下番茄幼苗的生物量，提高番茄幼苗對Cd的抗性提高.

(2) Cd脅迫造成番茄幼苗細胞膜氧化損傷，而MeJA和D36菌株聯(lián)合施用可誘導番茄幼苗的抗氧化系統(tǒng)發(fā)生響應(yīng)，提高抗氧化酶活性，減輕膜脂過氧化的程度，緩解Cd脅迫對番茄幼苗的毒害.

(3) MeJA和D36單獨或共同處理對番茄幼苗根、莖和葉中的Cd累積都具有調(diào)控作用，減少了Cd在番茄幼苗內(nèi)的累積.