王雨薇， 尹成泰， 劉婷婷， 江 凌*，3

（1.南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211816；2.南京工業(yè)大學(xué) 海外教育學(xué)院，江蘇 南京 211816；3.南京工業(yè)大學(xué) 材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211816）

固定化酶技術(shù)是將酶用人工方法固定在特定載體上，進(jìn)行催化生產(chǎn)，具有穩(wěn)定性好、易于純化和可連續(xù)化反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)[1]。該技術(shù)是生物催化的核心技術(shù)，其較高的重復(fù)可利用率減少了多余的下游后續(xù)處理和純化過(guò)程[2]，提高了生物催化過(guò)程的經(jīng)濟(jì)性，已成為酶工程研究的重要方向。

目前，利用金屬-有機(jī)骨架 （metal-organic frameworks，MOFs）作為酶固定化的載體材料[3]受到越來(lái)越多的關(guān)注，MOFs作為一種具有周期性骨架結(jié)構(gòu)的新型多孔材料，擁有較好的生物兼容性、易于調(diào)節(jié)的孔徑、巨大的比表面積、易于修飾的金屬結(jié)構(gòu)和配體，以及溫和的合成條件[4]，這些都為其作為固定化載體材料提供了有力的支持[5]。沸石咪唑酯骨架（zinc zeolitic imidazolate frameworks，ZIFs）作為一種重要的MOFs材料也兼具以上特點(diǎn)。研究證明，將酶嵌入MOFs（ZIFs）中構(gòu)建固定化酶體系為改善酶固有的脆弱性提供了新的可能，同時(shí)也為MOFs賦予了新的生物功能[6-7]。目前已有一些利用MOFs固定細(xì)胞方面的報(bào)道，Liang等設(shè)計(jì)了一種具有生物活性的多孔合成殼，用β-半乳糖苷酶包裹酵母，來(lái)提高其在貧瘠營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中的存活率[8]。Ji等將Morella theracetica細(xì)胞包裹在均質(zhì)MOFs單層中，以實(shí)現(xiàn)對(duì)氧化應(yīng)激的保護(hù)[9]。

丁酸（CH3CH2CH2COOH）作為一種重要的四碳短鏈有機(jī)酸，被廣泛應(yīng)用于食品[10-11]、醫(yī)藥[12-14]、農(nóng)業(yè)[15]、動(dòng)物飼料[16]等領(lǐng)域。例如在食品工業(yè)中，丁酸能夠增強(qiáng)食品中的奶油風(fēng)味，其酯類因具有水果香氣，可作為添加劑用于糖果、飲料、冰淇淋等食品中。酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum，Ct）是國(guó)內(nèi)外研究聚焦最多的產(chǎn)丁酸菌株，因其丁酸產(chǎn)量大、得率高、穩(wěn)定性好，被認(rèn)為是生物法制備丁酸的最優(yōu)勢(shì)菌株[17-18]。但在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，酪丁酸梭菌對(duì)小麥秸稈、軟木[19]和玉米芯[20]等廉價(jià)的生物質(zhì)原料無(wú)法直接利用，且由于環(huán)境復(fù)雜性導(dǎo)致的脅迫因素的存在，會(huì)影響丁酸產(chǎn)量的進(jìn)一步提升。

作者基于仿生礦化法原位合成ZIF-8納米材料，分隔包覆纖維素酶和酪丁酸梭菌，構(gòu)建ZIF-8@纖維素酶-Clostridium tyrobutyricum（ZIF-8@纖維素酶-Ct）共固定化體系。其中，利用ZIF-8@固定纖維素酶用于水解玉米芯制備可發(fā)酵性糖，進(jìn)一步將固定纖維素酶的ZIF-8作為保護(hù)性外骨骼結(jié)晶于細(xì)胞表面，形成包覆層以增強(qiáng)細(xì)胞穩(wěn)定性，增強(qiáng)Ct抗脅迫性能的同時(shí)，提高Ct細(xì)胞原料利用率，從而開(kāi)發(fā)廉價(jià)生物質(zhì)資源的同步酶解發(fā)酵合成丁酸的新工藝路線。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪丁酸梭菌Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755于作者所在實(shí)驗(yàn)室-80℃低溫凍藏柜中保藏。

強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基 （reinforced clostridium medium，RCM）：1 L體系中含有10 g胰蛋白胨、10 g牛肉浸粉、3 g酵母粉、5 g葡萄糖、1 g可溶性淀粉、5 g氯化鈉、3 g無(wú)水乙酸鈉、0.5 g L-半胱氨酸鹽酸鹽；pH 6.8±0.2；固體培養(yǎng)基需再加入15 g瓊脂。

發(fā)酵中用的RCM（G-）培養(yǎng)基為不添加葡萄糖的RCM培養(yǎng)基。

所用的纖維素酶為Cellic?CTec2諾維信纖維素酶，購(gòu)于諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司。在Cellic?CTec2中，纖維素酶提供了關(guān)鍵酶活性，水解纖維素中的（1，4）-β-D-葡萄糖苷鍵和其他β-D-葡聚糖。其質(zhì)量濃度近似值為1.15 g/mL。

1.2 酪丁酸梭菌菌種活化及擴(kuò)大培養(yǎng)

取出保藏的菌種劃線于RCM瓊脂平板表面生長(zhǎng)，挑取單菌落，接種于RCM培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置過(guò)夜培養(yǎng)12～16 h。

1.3 Ct菌泥制備

取2 mL菌液離心（12 000 r/min、4℃、2 min），加去離子水洗滌2～3次，得到菌泥，使用冷凍干燥機(jī)對(duì)菌泥進(jìn)行凍干處理為后續(xù)FT-IR、XRD、UVVis表征使用。

在菌泥中加入體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛（1 mL）固定，充分混勻，過(guò)夜固定后離心（12 000 r/min、4℃、2 min），倒去上清液，依次加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇（10%、30%、50%、70%、100%）洗脫，開(kāi)蓋過(guò)夜晾干，用于后續(xù)SEM表征使用。

1.4 ZIF-8@纖維素酶-Ct共固定化體系的合成與制備

將Ct菌液離心（10 000 r/min、4℃、3 min），加

去離子水洗滌2～3次，再依次加入去離子水（30 mL）、0.5 mol/L硝酸鋅溶液（200 μL）、1 mol/L 2-甲基咪唑（1 mL），充分混勻，置于37℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)

6～8 h。再取20 mg包覆ZIF-8的Ct細(xì)胞與10 mL

纖維素酶溶液（50 mmol/L乙酸緩沖液、pH 4.8）混合，在30℃、180 r/min振蕩50 min后離心（10 000 r/min、4℃、3 min），加去離子水洗滌2次沖洗掉多余材料。利用1.3中的方法得到ZIF-8@纖維素酶-Ct菌泥，戊二醛處理以備后續(xù)表征使用。

1.5 結(jié)構(gòu)表征

1.5.1 SEM形態(tài)表征使用Sigma HD掃描電鏡觀察Ct和ZIF-8@纖維素酶-Ct的形貌和結(jié)構(gòu)。

1.5.2 傅里葉變化紅外光譜（FT-IR）分析使用Nicolet IS 10傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定包覆著菌的ZIF-8@纖維素酶-Ct樣品和純ZIF-8樣品的紅外光譜。將這兩種不同樣品分別與固體KBr粉末混合，利用研缽研磨細(xì)碎同時(shí)注意干燥處理，取適量混合物粉末，均勻淺鋪一層在壓片模具中，在一定壓力下制成薄片，進(jìn)行FT-IR分光光度測(cè)定。在500～4 000 cm-1的波數(shù)下記錄透射率。

1.5.3 X射線粉末衍射（XRD）測(cè)定使用X’Pert PRO MPD X射線粉末衍射儀分析ZIF-8和ZIF-8@纖維素酶-Ct樣品的結(jié)晶形態(tài)及結(jié)晶度。樣品烘干利用研缽研磨細(xì)碎后加入到玻璃樣品架的凹槽中間，利用X射線粉末衍射儀在0～90°（測(cè)量角度2θ）掃描范圍內(nèi)測(cè)定。

1.6 分析方法

1.6.1 比生長(zhǎng)率測(cè)定使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定在600 nm處的不同pH條件下Ct和ZIF-8@纖維素酶-Ct菌液的OD值，再除以相應(yīng)的生長(zhǎng)時(shí)間得到比生長(zhǎng)率。從10 mL樣品管中各取100 μL樣品置于96孔酶標(biāo)板中，通過(guò)全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定。

1.6.2 細(xì)胞活力測(cè)定使用二乙酸熒光素（FDA）檢測(cè)不同pH條件下Ct和ZIF-8@纖維素酶-Ct菌液的細(xì)胞活力，該試劑可以代謝活躍的細(xì)胞被水解成明亮的熒光素。從10 mL樣品管中各取100 μL置于96孔酶標(biāo)板中，再在每孔加入2 μL的FDA母液（5 mg FDA粉末溶于1 mL丙酮），置于30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀分別在490 nm激發(fā)波長(zhǎng)、526 nm發(fā)射波長(zhǎng)下，實(shí)時(shí)檢測(cè)兩個(gè)樣品的吸光度。相對(duì)細(xì)胞活力是以同實(shí)驗(yàn)組的最高的吸光度為100%進(jìn)行標(biāo)化，得到各個(gè)條件下的相對(duì)細(xì)胞活力。

1.6.3 相對(duì)活性氧（ROS）水平測(cè)定使用熒光探針2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）對(duì)不同pH條件下Ct和ZIF-8@纖維素酶-Ct進(jìn)行活性氧檢測(cè)。DCFH-DA本身沒(méi)有熒光，可以自由地穿過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，可被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以通過(guò)氧化無(wú)熒光的DCFH生成有熒光的DCF（2’，7’-二氯熒光素），檢測(cè)DCF的熒光從而得到細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平[21-22]。用N，N-二甲基甲酰胺（DMF）稀釋得到DCFH-DA（10 μmol/L），取1 mL菌液和1 μL DCFH-DA于2 mL棕色離心管，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和菌液充分接觸。用去離子水洗滌2～3次，以充分除去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)、525 nm發(fā)射波長(zhǎng)下，實(shí)時(shí)檢測(cè)刺激前后熒光的強(qiáng)弱。

1.6.4 纖維素酶酶活力測(cè)定纖維素酶酶活力的測(cè)定采用DNS法，首先根據(jù)試劑盒配制標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于計(jì)算水解出的葡萄糖。接著加入l00 μL質(zhì)量濃度為1 g/L的待測(cè)液和900 μL DNS顯色液，搖勻后放入100℃沸水浴中，10 min后立即取出，流水冷卻至室溫，稀釋相應(yīng)倍數(shù)后于540 nm處測(cè)OD值，再?gòu)臉?biāo)準(zhǔn)曲線中查出對(duì)應(yīng)的葡萄糖的物質(zhì)的量。酶活力定義為在50℃、pH 7.0條件下，每分鐘催化纖維素水解成1 μmol的葡萄糖稱為1 U。

1.7 玉米芯水解物的預(yù)處理制備

玉米芯的水解液按文獻(xiàn)報(bào)道的方法制備[23]。首先，使用研磨機(jī)將玉米芯研磨成直徑小于5 mm的生物質(zhì)細(xì)粉，用0.02 mol/L H2SO4進(jìn)行預(yù)處理，固液質(zhì)量體積比為10 g∶100 mL，在121℃下處理30 min。將商品化的纖維素酶Cellic?CTec2按照2%（體積分?jǐn)?shù)）的比例加入到pH為5.5的稀酸水解液中，在50℃、180 r/min的條件下水解3 d。用多層紗布過(guò)濾出不溶性固體殘留物，剩余溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至總糖質(zhì)量濃度為60 g/L。

將獲得的玉米芯懸浮液，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至4.5。此外，在丁酸發(fā)酵的對(duì)照組中，在預(yù)處理后的玉米芯中添加2%（體積分?jǐn)?shù)）的游離商品纖維素酶，在50℃、180 r/min的條件下水解纖維素為葡萄糖。

1.8 同步糖化發(fā)酵法（simultaneous saccharification and fermentation，SSF）生產(chǎn)丁酸

以玉米芯酶解釋放的葡萄糖為碳源，對(duì)丁酸進(jìn)行分批發(fā)酵。厭氧瓶中培養(yǎng)6～8 h的細(xì)胞懸浮液接種于預(yù)處理的稻草懸浮液中進(jìn)行SSF（40℃、pH 4.5），并同時(shí)補(bǔ)充RCM（G-）培養(yǎng)基。

2 結(jié)果與討論

2.1 ZIF-8@纖維素酶-Ct細(xì)胞的表征分析

2.1.1 SEM分析Ct和ZIF-8@纖維素酶-Ct的SEM分析結(jié)果如圖1所示。從圖1（a）中可以看出，沒(méi)有ZIF-8包覆的細(xì)胞表面較為光滑，而圖1（b）中顯示，基于仿生礦化的方法成功使硝酸鋅和2-甲基咪唑水溶液合成了ZIF-8，并包覆在了Ct的表面，且顆粒分布均勻。

圖1 Ct和ZIF-8@纖維素酶-Ct的SEM圖Fig.1 SEM images of Ct and ZIF-8@cellulase-Ct

2.1.2 FT-IR分析采用FT-IR對(duì)ZIF-8和ZIF-8@纖維素酶-Ct進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖2所示。單一 的ZIF-8在2 925.62 cm-1和3 137.05 cm-1處 的吸收峰分別歸屬于其組分2-甲基咪唑上的不對(duì)稱脂肪族和芳香族的C—H鍵的伸縮振動(dòng)。ZIF-8@纖維素酶-Ct與ZIF-8相比除了具有上述位置附近的吸收峰，還在1 241 cm-1處有C＝O伸縮振動(dòng)吸收峰，表明存在蛋白質(zhì)[24]，主要?dú)w因于添加的纖維素酶；在1 078 cm-1處有醚鍵伸縮振動(dòng)吸收峰，這些可歸因于Ct。總而言之，這些結(jié)果證實(shí)了ZIF-8、纖維素酶和Ct成功耦合在一起，且所有峰的位置均未發(fā)生明顯變化，即ZIF-8的結(jié)構(gòu)在包覆的過(guò)程中也沒(méi)有被破壞。

圖2 ZIF-8和ZIF-8@纖維素酶-Ct的FT-IR圖Fig.2 FT-IR spectra of ZIF-8 and ZIF-8@cellulase-Ct

2.1.3 XRD分析對(duì)單一的ZIF-8和ZIF-8@纖維素酶-Ct進(jìn)行了XRD分析，結(jié)果如圖3所示。對(duì)于純的ZIF-8而言，在2θ為7.02°、10.39°、12.70°、18.14°處有4個(gè)明顯的衍射峰，分別歸因（011）、（002）、（112）和（222）空間群[24]，在XRD圖譜中的對(duì)應(yīng)位置也可以找到響應(yīng)的特征峰。ZIF-8@纖維素酶-Ct在相同的散射角下表現(xiàn)出的峰位與純ZIF-8基本一致，表明通過(guò)纖維素酶固定化后ZIF-8納米粒子的物化性質(zhì)不變。

圖3 ZIF-8和ZIF-8@纖維素酶-Ct的XRD圖Fig.3 XRD spectra of ZIF-8 and ZIF-8@cellulase-Ct

2.2 共固定化體系的酶解性能研究

2.2.1 ZIF-8-SSF最佳酶解條件的確定為了最大限度提高酶活性，對(duì)酶解的兩個(gè)重要參數(shù)pH和溫度進(jìn)行優(yōu)化。但最佳酶解條件的確定，還需要在被包覆的Ct細(xì)胞的存活率和固定化纖維素酶的酶活力之間折中。一般來(lái)說(shuō)，纖維素酶在二氧化硅[25]、（聚）離子液體[26]和磁性納米粒子[27]等不同載體上的固定化有利于提高其相對(duì)活性和穩(wěn)定性。MOFs也被證明是一種很好的固定化載體[28]。就酶活力而言，兩種情況下游離纖維素酶和固定化纖維素酶的最適溫度均為50℃（見(jiàn)表1）。在較低溫度（30～40℃）下，游離纖維素酶的活力略高于固定化纖維素酶。當(dāng)溫度超過(guò)最適溫度時(shí)，游離纖維素酶的活力急劇下降，在80℃時(shí)損失81.06%，與之前的報(bào)道一致[29]。ZIF-8固定化纖維素酶具有較高的熱穩(wěn)定性，在80℃下仍能保持約50%的殘余酶活力。這種穩(wěn)定性的提高可能和酶與載體的多點(diǎn)連接從而限制了構(gòu)象的流動(dòng)性和靈活性有關(guān)[29]。除相同的最適溫度外，游離纖維素酶和固定化纖維素酶的最適pH也均為4.5（見(jiàn)表1）。與游離纖維素酶相比，固定化纖維素酶在較寬的pH范圍內(nèi)（4.0～7.0）表現(xiàn)出相對(duì)較高的活性。在pH為7.0時(shí)，游離纖維素酶的活力僅為最適條件的36.23%，而固定化纖維素酶的活力仍能保持59.72%。固定化纖維素酶的pH耐受性增強(qiáng)可能是由于其對(duì)不利環(huán)境引起的構(gòu)象變化的敏感性減弱所致。

表1 不同溫度和pH下游離纖維素酶和固定化纖維素酶的相對(duì)活性Table 1 Relative activity of free cellulase and immobilized cellulase under different temperature and pH

研究了不同pH和溫度條件下無(wú)包覆的和被包覆的Ct細(xì)胞的活力。如表2所示，無(wú)包覆的Ct細(xì)胞對(duì)溫度變化非常敏感，在50℃時(shí)只有11.73%的細(xì)胞活力，在60℃時(shí)死亡率為100%。相比之下，ZIF-8外骨骼賦予細(xì)胞更高的高溫耐力，并能夠在50℃下保持超過(guò)50%的細(xì)胞存活率，這與最近的一項(xiàng)研究結(jié)果一致，即可以在微生物細(xì)胞上涂上MOFs以提高其在熱應(yīng)激下的生存能力[30]。無(wú)包覆的和被包覆的Ct細(xì)胞在40℃下都表現(xiàn)出最佳的存活率。從pH 4.0到7.0，細(xì)胞存活率增加（見(jiàn)表2）。當(dāng)pH設(shè)置為4.5時(shí)，無(wú)包覆的Ct相較于被包覆的細(xì)胞存活率明顯下降，僅有47.15%的熒光被檢測(cè)到。而ZIF-8包覆的Ct保持了76.31%的活力，表明了ZIF-8在低pH條件下提供了耐酸潛力。然而，當(dāng)pH從4.5到5.0時(shí)，被包覆的Ct細(xì)胞的存活率僅提高了約3%，而固定化纖維素酶的活力卻有所下降（見(jiàn)表1）。在此基礎(chǔ)上，確定pH為4.5，溫度為40℃為SSF的最佳條件。

表2 不同溫度和pH條件下無(wú)包覆的和被包覆的Ct的相對(duì)細(xì)胞活力Table 2 Relative cell viability of naked Ct and coated Ct under different tempreature and pH

2.2.2包覆的Ct對(duì)預(yù)處理的玉米芯的水解和轉(zhuǎn)化為了評(píng)價(jià)游離纖維素酶和固定化纖維素酶的性質(zhì)，研究了在pH 4.5時(shí)，在不同溫度（30、40、50、60℃）下纖維素水解率和葡萄糖轉(zhuǎn)化率。將預(yù)處理后的玉米芯懸浮液分為游離纖維素酶和無(wú)包覆的Ct組（對(duì)照組），以及ZIF-8@纖維素酶包覆的Ct組（處理組），預(yù)處理后的玉米芯經(jīng)酶解后，纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖，在50℃時(shí)超過(guò)67%的預(yù)處理玉米芯被水解成葡萄糖（見(jiàn)表3）達(dá)到最大轉(zhuǎn)化率。與固定化纖維素酶相比，游離纖維素酶表現(xiàn)出更高的纖維素水解率，這與Ingle等報(bào)道的結(jié)果基本一致[31]。與游離纖維素酶相比，在40℃下固定化纖維素酶的水解率僅略有下降，56.02%的纖維素被水解。同時(shí)，溫度對(duì)無(wú)包覆的和被包覆的Ct細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)化率也有很大影響（見(jiàn)表3）。在40℃時(shí)，葡萄糖轉(zhuǎn)化率最高，二者均可達(dá)85%以上，這與之前獲得的最適溫度（40℃）非常吻合。此外，無(wú)包覆的Ct細(xì)胞在高溫下對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)化能力顯著降低，50℃時(shí)葡萄糖轉(zhuǎn)化率僅為34.58%，60℃時(shí)僅為2.16%，表明固有敏感的Ct細(xì)胞對(duì)熱應(yīng)激敏感。

表3 不同溫度下游離纖維素酶和無(wú)包覆的Ct組（對(duì)照組）、ZIF-8@纖維素酶包覆的Ct組（處理組）的纖維素水解率和葡萄糖轉(zhuǎn)化率Table 3 Cellulose hydrolysis rates and glucose conversion percentages of free cellulase and naked Ct group（control group），ZIF-8@cellulase coated Ct group（treatment group）at different temperature

2.3 共固定化體系的發(fā)酵性能研究

2.3.1 耐酸性能研究pH對(duì)微生物的發(fā)酵過(guò)程有著重要的影響，通過(guò)改變發(fā)酵培養(yǎng)基的pH可以影響細(xì)胞內(nèi)代謝過(guò)程中關(guān)鍵酶的活性[32]，從而影響菌體的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)物合成。在Ct中，pH的高低不僅會(huì)影響丁酸和乙酸合成途徑中的關(guān)鍵酶的活性，還可以影響到酶的表達(dá)水平[33]。因此在微生物發(fā)酵過(guò)程中，pH對(duì)菌體代謝具有重要影響，是判斷ZIF-8保護(hù)作用的重要指標(biāo)。

將置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，在不同pH條件（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）的RCM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)8 h的Ct和ZIF-8@纖維素酶-Ct取出，測(cè)定比生長(zhǎng)率、相對(duì)細(xì)胞活力和相對(duì)活性氧（ROS）水平，結(jié)果如圖4所示。在較低pH時(shí)，Ct的生長(zhǎng)受到較大的抑制，pH為4.5時(shí)抑制效果最為明顯。在pH 7.0的條件下，Ct和ZIF-8@纖維素酶-Ct的生長(zhǎng)效果最好，可視為生長(zhǎng)最適pH，且被包覆的Ct的細(xì)胞生長(zhǎng)情況均優(yōu)于無(wú)包覆的，其中，在pH 6.0時(shí)保護(hù)效果最為顯著，相較于無(wú)包覆的菌株，ZIF-8@纖維素酶-Ct的比生長(zhǎng)率提高了11.48%，相對(duì)活性氧水平則降低了24.92%，提高了Ct耐酸性。

圖4 不同pH條件下Ct和ZIF-8@纖維素酶-Ct的比生長(zhǎng)率、相對(duì)細(xì)胞活力及相對(duì)活性氧水平Fig.4 Specific growth rate，relative cell viability and relative reactive oxygen levels of Ct and ZIF-8@cellulase-Ct under different pH conditions

2.3.2 耐氧性能研究Ct作為專性厭氧菌，缺乏好氧菌所具有的超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶，所以在有氧的環(huán)境中會(huì)受到超氧根負(fù)離子和過(guò)氧化氫的毒害，因此只能進(jìn)行嚴(yán)格的無(wú)氧代謝[34]。但是營(yíng)造嚴(yán)苛的無(wú)氧條件較為困難，對(duì)于Ct，生長(zhǎng)環(huán)境中存在氧氣會(huì)對(duì)其正常生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的影響，因此提高其耐氧水平，對(duì)于其生產(chǎn)具有一定的輔助意義。

將置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，在不同氧氣體積分?jǐn)?shù)（0、10%、21%）的RCM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)10 h的Ct和ZIF-8@纖維素酶-Ct取出，測(cè)定比生長(zhǎng)率、相對(duì)細(xì)胞活力和相對(duì)活性氧（ROS）水平，結(jié)果如圖5所示。可以看出，在嚴(yán)格厭氧的條件下，即氧氣體積分?jǐn)?shù)為0時(shí)，Ct和ZIF-8@纖維素酶-Ct的生長(zhǎng)效果最好，符合Ct專性厭氧的生長(zhǎng)特性，同時(shí)在此氧氣體積分?jǐn)?shù)條件下可以看出有無(wú)包覆對(duì)于其生長(zhǎng)指標(biāo)的影響不是特別顯著，在氧氣體積分?jǐn)?shù)為10%的條件下保護(hù)效果能夠凸顯，有ZIF-8和纖維素酶包覆的Ct的細(xì)胞生長(zhǎng)情況仍然是總體優(yōu)于無(wú)外骨骼包覆的，但在未除氧的培養(yǎng)基中的Ct和ZIF-8@纖維素酶-Ct生長(zhǎng)情況均不佳，說(shuō)明添加了包覆對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用也在一定的限度范圍內(nèi)。

圖5 不同氧氣體積分?jǐn)?shù)下Ct和ZIF-8@纖維素酶-Ct的比生長(zhǎng)率、相對(duì)細(xì)胞活力及相對(duì)活性氧水平Fig.5 Specific growth rate，relative cell viability and relative reactive oxygen levels of Ct and ZIF-8@cellulase-Ct under different O2 volume ratio

2.4 ZIF-8@纖維素酶-Ct與Ct發(fā)酵產(chǎn)丁酸的對(duì)比研究

各種木質(zhì)纖維素原料水解所得的葡萄糖濃度一般不能直接用于丁酸發(fā)酵。因此，水解液必須通過(guò)蒸發(fā)濃縮到所需的葡萄糖濃度[35]。這一耗時(shí)耗力的生產(chǎn)過(guò)程不利于丁酸工業(yè)化發(fā)酵的推進(jìn)。作者提出了一種新的丁酸發(fā)酵工藝MOFs（ZIF-8）介導(dǎo)的同步糖化發(fā)酵法（ZIF-8-SSF），選擇玉米芯作為模式基質(zhì)。木質(zhì)纖維素原料水解24 h后，加入營(yíng)養(yǎng)充足的RCM（G-）培養(yǎng)基加速被釋放的葡萄糖的利用。煩瑣的蒸發(fā)濃縮步驟可以消除，但葡萄糖濃度的降低可能會(huì)導(dǎo)致丁酸終濃度的降低。但固定化纖維素酶的pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性增強(qiáng)，表明ZIF-8-SSF工藝可能具有提高丁酸產(chǎn)量的潛力。如表4所示，由于預(yù)處理玉米芯釋放的葡萄糖可以溫和地維持細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝，所以依然可以在沒(méi)有RCM（G-）培養(yǎng)基的情況下產(chǎn)生少量的丁酸；加入RCM（G-）培養(yǎng)基后，葡萄糖開(kāi)始大量消耗，32 h后幾乎不再轉(zhuǎn)化為丁酸，被纖維素酶和ZIF-8包覆的Ct細(xì)胞產(chǎn)生更多的丁酸，32 h最終質(zhì)量濃度達(dá)到6.74 g/L，比無(wú)包覆Ct細(xì)胞高12.52%。

表4 血清瓶中游離纖維素酶和無(wú)包覆的Ct與ZIF-8-SSF的丁酸發(fā)酵情況Table 4 Butyric acid fermentation of free cellulase and naked Ct versus ZIF-8-SSF in serum bottles

3 結(jié)語(yǔ)

作者使用仿生礦化的方法將硝酸鋅溶液和2-甲基咪唑溶液制備ZIF-8，再分隔包覆纖維素酶和Ct，獲得ZIF-8@纖維素酶-Ct共固定化體系。采用SEM、FT-IR、XRD等方式進(jìn)行表征分析，其中SEM結(jié)果顯示，成功制備出ZIF-8顆粒，并均勻包覆在Ct細(xì)胞表面。FT-IR結(jié)果顯示，ZIF-8@纖維素酶-Ct具有ZIF-8和Ct兩者的吸收峰，且載體包覆細(xì)胞并沒(méi)有改變載體的結(jié)構(gòu)。XRD結(jié)果顯示，ZIF-8和纖維素酶在Ct細(xì)胞表面附著后物化性質(zhì)不變。在SSF過(guò)程中，保持細(xì)胞活力和酶活力的最適條件為40℃、pH 4.5。在此優(yōu)化條件下，玉米芯的水解率可達(dá)56.02%，葡萄糖轉(zhuǎn)化率為85.61%。通過(guò)對(duì)比在不同pH和氧氣體積分?jǐn)?shù)下Ct和ZIF-8@纖維素酶-Ct的生長(zhǎng)情況，可以看出ZIF-8@纖維素酶-Ct的生長(zhǎng)狀態(tài)總體較無(wú)包覆的Ct具有更高、更穩(wěn)定的比生長(zhǎng)率、相對(duì)細(xì)胞活力和較低的相對(duì)活性氧水平，相較于其他固定化體系，ZIF-8@纖維素酶-Ct共固定化體系具有操作簡(jiǎn)易，便于放大過(guò)程，且具有良好的保護(hù)效果。發(fā)酵結(jié)果表明，ZIF-8-SSF丁酸產(chǎn)量32 h內(nèi)最終質(zhì)量濃度達(dá)到6.74 g/L，比無(wú)包覆的Ct提高了12.52%。