周杰， 薛寸， 張青， 陳思穎， 陳藝， 黃靜， 李月婷， 黃勇， 鄭林， 鞏仔鵬

(貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550004)

對(duì)于藥物靶點(diǎn)和關(guān)鍵藥物代謝酶位于細(xì)胞內(nèi)的藥物而言，測(cè)定藥物在細(xì)胞中濃度較其血漿中的藥物濃度更有意義。當(dāng)藥物進(jìn)入到細(xì)胞后，如何準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)胞內(nèi)藥物的含量，是開(kāi)展藥物在細(xì)胞內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)的前提。因此，建立快速測(cè)量和預(yù)測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離藥物濃度對(duì)研究藥物在細(xì)胞內(nèi)的吸收、分布和代謝過(guò)程顯得尤為重要[1]。雖然多成分協(xié)同發(fā)揮作用是中藥民族藥治療疾病的特點(diǎn)，但因其所含化學(xué)成分眾多，給其含量成分的測(cè)定帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀(ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)技術(shù)具有分析速度快、分離能力強(qiáng)、靈敏度高和自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，對(duì)于中藥民族藥多組分的同時(shí)測(cè)定及細(xì)胞樣本中微量藥物含量的定量分析均具有很大的優(yōu)勢(shì)[2]。

羊耳菊為菊科旋覆花屬植物羊耳菊Inulacappa(Buch. -Ham. ex D. Don) DC.的新鮮或干燥全草，又名白牛膽、大力王、葉下白，是貴州云南等地少數(shù)民族常用藥材，對(duì)于感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、風(fēng)濕疼痛、癰瘡疔毒、乳癰等癥狀有獨(dú)特療效[3]。近年來(lái)對(duì)羊耳菊的化學(xué)成分研究報(bào)道較多，其主要成分有酚酸類(lèi)、萜類(lèi)、黃酮類(lèi)和揮發(fā)油等[4-7]，研究發(fā)現(xiàn)，從羊耳菊藥材中分離得到的木犀草苷(luteolin,LUT)、綠原酸(chlorogenic acid,CA)、新綠原酸(neochlorogenic acid,NCA)、隱綠原酸(cryptochlorogenic acid,CCA)、3,4-二咖啡?；鼘幩?3,4-dicaffeoylquinic acid,3,4-DCQA)、3,5-二咖啡?；鼘幩?3,5-dicaffeoylquinic acid,3,5-DCQA)、4,5-二咖啡?；鼘幩?4,5-dicaffeoylquinic acid,4,5-DCQA)具有抗炎活性[8-9]。羊耳菊的化學(xué)成分眾多且復(fù)雜，而目前關(guān)于同時(shí)測(cè)定細(xì)胞中羊耳菊抗炎活性成分含量的方法學(xué)研究未見(jiàn)報(bào)道，限制了其細(xì)胞藥代動(dòng)力學(xué)的研究。因此，本文以小鼠巨噬細(xì)胞Raw 264.7為研究對(duì)象，采用超高液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS/MS)建立同時(shí)測(cè)定Raw 264.7細(xì)胞中LUT、CA、NCA、CCA、3,4-DCQA、3,5-DCQA、4,5-DCQA等7個(gè)成分含量的方法學(xué)，包括專(zhuān)屬性、線性、基質(zhì)效應(yīng)、回收率、準(zhǔn)確度、精密度和穩(wěn)定性等，為后續(xù)進(jìn)一步研究苗藥羊耳菊抗炎活性成分的細(xì)胞藥代動(dòng)力學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 UPLC Xevo TQ-S型超高效液相三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(ACQUITY UPLC I-Class系統(tǒng)，MassLynx質(zhì)譜工作站，美國(guó)沃特世公司)；CO2培養(yǎng)箱、超低溫冰箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司)；Model 680酶標(biāo)儀(伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)；TS-100 F倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；超凈工作臺(tái)、Allegra 32 R臺(tái)式冷凍離心機(jī)、Allegra X-30 R低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；高壓蒸汽滅菌鍋、電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；KQ-500 DE 數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；VX-Ⅲ多管渦旋振蕩器(藤錦(北京)醫(yī)藥科技有限公司)；XYN-15LP氮吹儀氮?dú)獍l(fā)生器(上海析友分析儀器有限公司)；EL204萬(wàn)分之一電子天平(上海Mettler Toledo公司)；單通道微量、多通道微量移液槍(德國(guó)Eppendorf公司)；電動(dòng)移液槍(德國(guó)Sartorius公司)；Water purifier實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)用超純水機(jī)(四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司)；25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板6孔板、96孔板(無(wú)錫耐思生物科技有限公司)；10、25 mL移液管(清風(fēng)生化科技有限公司)。

1.1.2 試劑與藥品 澳洲胎牛血清、DMEM、雙抗、胰酶消化液均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；PBS、BCA 蛋白定量試劑盒，均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；MTS購(gòu)于普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司；質(zhì)譜級(jí)甲醇、乙腈(德國(guó)Merck 公司)；質(zhì)譜級(jí)甲酸(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)；屈臣氏飲用水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

對(duì)照品：葛根素(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110752-201514，純度≥95.5%)；綠原酸(成都埃法生物科技有限公司，批號(hào)AF8112791，純度≥98%)；隱綠原酸(成都埃法生物科技有限公司，批號(hào)AF20032707，純度≥98%)；新綠原酸(成都埃法生物科技有限公司，批號(hào)AF20030804，純度≥98%)；木犀草苷(四川維克奇生物科技有限公司，批號(hào)wkq20031803，純度≥98%)；3,4-二咖啡酰基奎寧酸(成都埃法生物科技有限公司，批號(hào)AF9060515，純度≥98%)；3,5-二咖啡?；鼘幩?成都埃法生物科技有限公司，批號(hào)AF20020302，純度≥98%)；4,5-二咖啡?；鼘幩?成都埃法生物科技有限公司，批號(hào)AF0011701，純度≥98%)。

1.1.3 藥材來(lái)源 羊耳菊藥材Inulacappa(產(chǎn)地為廣西桂林)經(jīng)過(guò)貴州醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教研室劉春花副教授鑒定為菊科旋覆花屬植物羊耳菊的干燥全草。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 本實(shí)驗(yàn)所用小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株購(gòu)于武漢普諾生命科技有限公司(批號(hào)CL-0190)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羊耳菊提取物的制備方法 稱(chēng)取羊耳菊藥材約20 kg，加10倍量60%乙醇浸泡過(guò)夜，回流提取3次，時(shí)間每次1 h，3次回流完成后，合并3次濾液，減壓濃縮，得濃縮液約10 L，濃縮液經(jīng)D101型大孔樹(shù)脂吸附，徑高比1 ∶4，吸附充分后，加水洗脫至流出液無(wú)顏色后，換60%乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干，得浸膏樣提取物，后續(xù)采用微波真空干燥，即得。計(jì)算得膏率為3.15%，經(jīng)UPLC-MS/MS含量測(cè)定，羊耳菊提取物中木犀草苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、3,4二咖啡?；鼘幩?、3,5二咖啡酰基奎寧酸和4,5二咖啡酰基奎寧酸的含量分別為0.18%、0.26%、0.25%、0.30%、4.52%、2.78%、4.36%。

1.2.2 細(xì)胞用羊耳菊提取物儲(chǔ)備液的制備 稱(chēng)取羊耳菊提取物5 g，加入適量DMSO超聲溶解后，加入PBS定容至25 mL，即濃度為200 mg/mL的提取物母液(DMSO最終濃度為20%)，0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾后分裝保存至-20 ℃，臨用前用完全培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇 紫外照射超凈臺(tái)15～30 min，棉花用75%乙醇噴濕后，擦拭超凈工作臺(tái)，從-80 ℃冰箱將凍存的Raw264.7細(xì)胞迅速取出，將凍存管置于37 ℃水浴鍋中，在1 min內(nèi)迅速解凍，不停震搖的同時(shí)直至細(xì)胞液體完全溶解，75%乙醇噴濕凍存管后，拿入超凈臺(tái)內(nèi)，酒精燈烤瓶蓋周?chē)瑢龃婀軆?nèi)的液體轉(zhuǎn)入10 mL離心管，加入3 mL含10% FBS的DMEM，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入5 mL完全培養(yǎng)基吹打均勻后轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶中，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3.2 細(xì)胞傳代 待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至90%后，棄掉瓶中培養(yǎng)基，PBS清洗2遍，然后加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化液，消化3～5 min后，用1～2 mL含10% FBS 的DMEM終止反應(yīng)，沿瓶壁將細(xì)胞輕輕吹打下來(lái)，轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，1 000 r/min，5 min離心，按1 ∶6傳代至新的培養(yǎng)瓶中，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h后，穩(wěn)定傳代幾次后，進(jìn)行接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.3 細(xì)胞凍存 待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定，棄掉瓶中培養(yǎng)基，PBS緩沖液清洗兩遍，然后加入1 mL 0.2%胰蛋白酶消化液，消化3～5 min后，用1～2 mL 含10% FBS的DMEM終止反應(yīng)，沿瓶壁將細(xì)胞輕輕吹打下來(lái)，轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，1 000 r/min，5 min離心，加入1 mL凍存液(FBS ∶DMSO=9 ∶1)，梯度凍存細(xì)胞，即4 ℃冰箱放置30 min，-20 ℃放置2 h，轉(zhuǎn)入-80 ℃長(zhǎng)期凍存。

1.2.4 溶液配制

1.2.4.1 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱(chēng)取葛根素5.7 mg，加甲醇定容至5 mL棕色容量瓶中，得1.14 g/mL的葛根素儲(chǔ)備液，后續(xù)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將其制備成實(shí)驗(yàn)所需濃度，存放至-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱(chēng)取木犀草苷5.07 mg、綠原酸10.13 mg、新綠原酸11.16 mg、隱綠原酸10.28 mg、3,4-二咖啡?；鼘幩?5.21 mg、3,5-二咖啡酰基奎寧酸15.33 mg, 4,5-二咖啡?；鼘幩?5.17 mg，加甲醇分別定容至5 mL，分別得到濃度為1.01、2.01、2.22、2.05、3.02、3.03、3.01 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，保存在-20 ℃?zhèn)溆?；臨用前逐步將儲(chǔ)備液稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(木犀草苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、3,4-二咖啡酰基奎寧酸、3,5-二咖啡?；鼘幩?、3,4-二咖啡酰基奎寧酸濃度分別為61.76、124.18、124.24、124.41、491.25、249.08、496.60 ng/mL)，再按倍數(shù)稀釋至表1中的系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

表1 木犀草苷等7個(gè)活性指標(biāo)成分系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度 ng/mL

1.2.4.3 PBS配制 將規(guī)格為2 L每袋的PBS，加入超純水溶解后，補(bǔ)至2 L，分裝在蜀牛瓶中后，高壓蒸汽滅菌后4 ℃存儲(chǔ)使用。

1.2.5 細(xì)胞樣品處理方法 取800 μL經(jīng)過(guò)3次凍融的細(xì)胞懸液，加50 μL葛根素溶液(15 ng/mL)，短暫渦混后加160 μL 20%甲酸水溶液和800 μL甲醇，渦混5 min，超聲10 min，在4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，上清液使用氮吹儀吹干，150 μL 50%甲醇復(fù)溶殘?jiān)糠?，渦混5 min，超聲10 min，在4 ℃條件下14 000 r/min離心10 min，上清液進(jìn)樣分析。

1.2.6 UPLC-MS/MS分析方法的建立

1.2.6.1 液相條件 色譜柱：Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)柱；保護(hù)柱：Waters Van Guard BEH C18(2.1 mm× 5 mm，1.7 μm)；流速為0.35 mL/min；柱溫為40 ℃；流動(dòng)相：0.2%甲酸水(A)-0.2%甲酸乙腈(B)；進(jìn)樣體積為3 μL。梯度洗脫條件見(jiàn)表2。

表2 木犀草苷等7個(gè)活性指標(biāo)成分的色譜條件

1.2.6.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI)，毛細(xì)管電離電壓為3 kV，離子源溫度為150 ℃，噴霧氣與反吹氣是N2，去溶劑氣流速為1 000 L/h，去溶劑氣溫度為600 ℃，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)，質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及處理軟件為MassLynx V4.1工作站。木犀草苷等7種成分及內(nèi)標(biāo)用于定量分析的監(jiān)測(cè)離子見(jiàn)表3。

表3 木犀草苷等7個(gè)活性指標(biāo)成分及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜條件

1.2.7 分析方法的確證

1.2.7.1 專(zhuān)屬性 取800 μL空白細(xì)胞懸液按“1.2.5 細(xì)胞樣品處理方法”項(xiàng)下方法操作(不加內(nèi)標(biāo))，得空白圖譜A；將一定濃度對(duì)照品溶液和葛根素內(nèi)標(biāo)溶液加入空白細(xì)胞懸液，按“1.2.5”方法操作獲得對(duì)照品圖譜B；取給藥后的細(xì)胞懸液，按“1.2.5”方法操作得含藥譜圖C。

1.2.7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備和LOD、LOQ 取800 μL空白細(xì)胞懸液，依次加入含有木犀草苷等7種成分的混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，按“1.2.5細(xì)胞樣品處理方法”項(xiàng)下操作。以待測(cè)成分與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(A/Ai)為縱坐標(biāo)Y，各成分質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)X進(jìn)行線性回歸。木犀草苷等7種成分的最低定量限(LOQ)定義為S/N=10，最低檢測(cè)限(LOD)定義為S/N=3。

1.2.7.3 準(zhǔn)確度和精密度 取800 μL空白細(xì)胞懸液，分別配制木犀草苷等7種成分的低、中、高三個(gè)濃度的QC樣品(n=5)，取50 μL加入后，其余均按“1.2.5”方法操作，低、中、高三個(gè)濃度同一天連續(xù)進(jìn)樣2次，連續(xù)測(cè)定3 d，分別算出日內(nèi)精密度和日間精密度。

1.2.7.4 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng) 分別配制A、B、C三種樣品，取800 μL空白細(xì)胞懸液，配制木犀草苷等7種成分的空白細(xì)胞懸液中濃度的QC樣品，平行進(jìn)行5樣本分析，取50 μL加入后，其余按“1.2.5”方法操作，此操作得到的樣品為A；另取一份800 μL空白細(xì)胞懸液，不加混合對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)外，甲酸和甲醇按“1.2.5”項(xiàng)下操作，離心后，取上清液，上清液中加入與A樣品中相對(duì)應(yīng)濃度的對(duì)照品，每種濃度進(jìn)行5樣本分析，吹干后，150 μL 50%甲醇復(fù)溶，此樣品為B；C樣品中不加入空白細(xì)胞，取上述中相應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液加入，按“1.2.5”項(xiàng)下操作。結(jié)果計(jì)算時(shí)，7種成分的提取回收率為樣品A峰面積與樣品B峰面積之比，基質(zhì)效應(yīng)為樣品B峰面積與樣品C峰面積之比。

1.2.7.5 穩(wěn)定性 取800 μL空白細(xì)胞懸液，分別配制木犀草苷7種成分低、中、高濃度的QC樣品，取50 μL加入后，其余按“1.2.5”項(xiàng)下操作，分別觀察樣品在自動(dòng)進(jìn)樣器中分別放置12 h，-20 ℃下冷藏24 h后的穩(wěn)定性，以每一濃度5樣本分析。

1.2.8 含藥細(xì)胞懸液的制備 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液的濃度調(diào)整至1×105個(gè)/孔，接種至96孔板，每孔加100 μL細(xì)胞懸液，混勻后放置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，棄掉培養(yǎng)基，加入PBS輕輕清洗2次，加入100 μL含600 μg/mL羊耳菊提取物藥液的10% FBS的DMEM，設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，放置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 h，棄藥液，加入PBS輕輕清洗3次，收集細(xì)胞，然后細(xì)胞用2 mL預(yù)冷的PBS快速洗滌2次，然后向每個(gè)孔中加入2 mL超純水，并將樣品儲(chǔ)存在-80 ℃，經(jīng)過(guò)3次冷凍和解凍后，獲得含藥細(xì)胞懸液。

2 結(jié)果

2.1 專(zhuān)屬性

在選定的色譜和質(zhì)譜條件下，木犀草苷等7種成分在細(xì)胞懸液中的分離良好，且無(wú)雜質(zhì)干擾?？瞻准?xì)胞懸液、空白細(xì)胞懸液加入混合對(duì)照品溶液及葛根素內(nèi)標(biāo)和給藥后細(xì)胞懸液樣品色譜見(jiàn)圖1。

1： 新綠原酸； 2： 綠原酸； 3： 隱綠原酸； 4： 葛根素(內(nèi)標(biāo))； 5： 木犀草苷；6： 3,4-二咖啡酰基奎寧酸； 7： 3,5-二咖啡?；鼘幩?； 8： 4,5-二咖啡酰基奎寧酸

2.2 線性范圍與LOQ、LOD

細(xì)胞懸液中木犀草苷等7種成分在濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99，細(xì)胞懸液標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及最低定量限(LOQ)、最低檢測(cè)限(LOD)見(jiàn)表4。

表4 木犀草苷等7種成分在細(xì)胞懸液中的線性回歸方程

2.3 準(zhǔn)確度和精密度

對(duì)低、中、高三個(gè)濃度的細(xì)胞懸液的日內(nèi)精密度和日間精密度進(jìn)行了考察，結(jié)果表明木犀草苷等7種成分日內(nèi)精密度和日間精密度RSD均小于15%，低、中、高濃度的準(zhǔn)確度范圍為90.78%～113.99%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 木犀草苷等7種成分在細(xì)胞懸液中的準(zhǔn)確度與精密度

2.4 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)

對(duì)木犀草苷等7種成分線性范圍內(nèi)低、中、高濃度的細(xì)胞懸液樣品提取回收率進(jìn)行了考察，結(jié)果表明在濃度范圍內(nèi)7種成分的回收率及基質(zhì)效應(yīng)符合生物樣品分析方法要求。具體結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 木犀草苷等7種成分在細(xì)胞懸液中的提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)

2.5 穩(wěn)定性

對(duì)木犀草苷等7種成分低、中、高濃度細(xì)胞懸液樣品在進(jìn)樣器放置12 h，冷藏(-20 ℃)24 h的穩(wěn)定性(n=5)進(jìn)行了考察，結(jié)果表明7種成分在細(xì)胞懸液中經(jīng)過(guò)上述過(guò)程后均穩(wěn)定，具體結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 木犀草苷等7種成分在細(xì)胞懸液中的穩(wěn)定性

3 討 論

3.1 細(xì)胞破碎方法的選擇

細(xì)胞常用的破碎方法有物理裂解方法和化學(xué)裂解方法，其中化學(xué)裂解方法是使用裂解液裂解細(xì)胞，比如RIPA裂解液[10]、IP細(xì)胞裂解、NP-40裂解液、SDS裂解液等，由于此類(lèi)型的細(xì)胞裂解液中大部分成分是鹽類(lèi)，使用后會(huì)在UPLC-MS/MS儀器管路中產(chǎn)生鹽析，堵塞儀器，影響儀器使用壽命；物理裂解方法主要有超聲裂解[11]和反復(fù)凍融[12-13]方式，超聲裂解儀可以充分將細(xì)胞破裂，但該方法耗時(shí)，不適合大批量處理細(xì)胞，且實(shí)驗(yàn)前期進(jìn)行過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩種破碎方式進(jìn)樣測(cè)定后細(xì)胞中藥物含量差別不大。因此，本實(shí)驗(yàn)選用簡(jiǎn)便，可批量處理的反復(fù)凍融方式進(jìn)行破碎細(xì)胞。

3.2 樣品蛋白沉淀方法選擇

常見(jiàn)的樣品蛋白沉淀方法有液-液萃取法、固相萃取[14]、蛋白沉淀等多種樣品處理方法，課題組前期已建立了羊耳菊提取物中活性成分體內(nèi)含量測(cè)定的超高效液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜的方法[15-17]，考慮到細(xì)胞樣品中藥物濃度過(guò)低、基質(zhì)不同等問(wèn)題，進(jìn)行了優(yōu)化并驗(yàn)證，建立了快速精準(zhǔn)的測(cè)定細(xì)胞內(nèi)咖啡酸類(lèi)含量的分析方法，又加之樣品處理數(shù)量大，選擇萃取方法操作復(fù)雜，耗時(shí)耗力，故在此基礎(chǔ)上選擇了方法簡(jiǎn)便的甲醇沉淀蛋白。

3.3 細(xì)胞中咖啡酸類(lèi)成分提取方法選擇

羊耳菊抗炎有效部位中待測(cè)成分主要為咖啡酸類(lèi)等化合物，在進(jìn)行細(xì)胞處理時(shí)，需要用甲酸酸化樣品，預(yù)實(shí)驗(yàn)中考察了1%、5%、10%、20%濃度的甲酸對(duì)細(xì)胞樣品中咖啡酸類(lèi)提取，發(fā)現(xiàn)20%濃度甲酸可以明顯增加樣品中綠原酸等7個(gè)活性指標(biāo)成分的含量，提高檢測(cè)靈敏度。

綜上，本文建立了快速、準(zhǔn)確的同時(shí)測(cè)定Raw264.7細(xì)胞中羊耳菊提取物所含的7個(gè)指標(biāo)成分(LUT、CA、NCA、CCA、3,4-DCQA、3,5-DCQA、4,5-DCQA)含量的UPLC-MS/MS分析方法。同時(shí)，本次實(shí)驗(yàn)中，對(duì)細(xì)胞樣品的專(zhuān)屬性、線性、準(zhǔn)確度、精密度、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)該分析方法符合細(xì)胞樣品的測(cè)定，為開(kāi)展羊耳菊提取物的細(xì)胞藥代動(dòng)力學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。