龔心琰，朱凌波，鄭娟慶，龔劍萍

(浙江省義烏市中心醫(yī)院心內(nèi)一科 322000)

心腦血管疾病是目前中老年群體的常見病及多發(fā)病，多基于動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發(fā)生，機制較為復(fù)雜[1]。在AS形成的過程中，氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)可以損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，使脂質(zhì)及炎性細(xì)胞等在損傷區(qū)浸潤，形成粥樣斑塊[2-3]。因此，目前研究認(rèn)為減輕ox-LDL 引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是干預(yù)AS的有效靶點之一[4]。本研究選用的自組裝短肽(self-assembling peptide，SAP)Sciobio-Ⅱ，是由16個氨基酸殘基構(gòu)成的一種可以仿細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular ma-trix，ECM)功能的生物支架納米材料，能夠模仿ECM與細(xì)胞因子、生長因子之間的相互作用，進(jìn)一步影響細(xì)胞的增殖與分化[5]。目前，Sciobio-Ⅱ?qū)x-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是否具有保護(hù)作用，以及其可能的相互作用機制未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。因此，本研究采用臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞( human umbilical vein endothelial cells，HUVEC) 作為實驗對象，通過體外實驗，驗證和探究Sciobio-Ⅱ 對ox-LDL 誘導(dǎo)HUVEC損傷的實驗效應(yīng)及其相關(guān)分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

自組裝短肽Sciobio-Ⅱ(序列：RLEVKADARLEVKADA-NH2)由成都賽恩貝生物科技有限公司贈送；ox-LDL(Cat號：20605ES05)、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Alexa Fluor 640，Cat號：40308ES20)、Annexin V/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Cat號：40305ES20)、鼠抗二抗抗體(批號：33201ES60)均購自上海翊圣生物科技有限公司；細(xì)胞活力檢測試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(Cat號：C0043)；HUVEC購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫；血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)/Notch 信號通路抑制劑 LY450139(Cat號：425386-60-3)購自美國MCE 公司。PBS(Cat號： SH30256.01)購自美國HyClone公司；DMEM高糖培養(yǎng)基(REF：12430047)購自美國Gibco 公司；RNA提取試劑(Cat號：79306)購自上海凱杰公司；血管內(nèi)皮生長因子受體 2 (vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2,批號：ab237634)、Notch1(批號：ab52627)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2，批號：ab32124)、Bax(批號：ab32503)一抗抗體購自英國 Abcam公司；β-肌動蛋白(β-actin)一抗抗體(批 號：A5441)購自美國 Sigma 公司；Bax、Bcl-2、VEGF-2、Notch1引物由上海生工生物公司合成，引物序列見表 1；qPCR(SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ)試劑盒(Cat號：RR820A)、PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Cat號：RR047A)購自日本TaKaRa公司；PCR擴增儀(型號Life ECO)購自杭州博日公司；熒光定量PCR儀(型號ABI7500)購自美國ABI公司；Western blot電泳系統(tǒng)購自美國 Bio-Rad 公司；凝膠成像系統(tǒng)(型號：e-Blot 100)購自德國易勃特生物科技有限公司。見表1。

表1 各基因引物序列

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組

HUVEC用含有10% 胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)(CO2濃度為5%)，待細(xì)胞融合度為90%時(細(xì)胞計數(shù)約為2×107個)，移除培養(yǎng)基，傳代后繼續(xù)培養(yǎng)擴增，得到足夠數(shù)量的細(xì)胞后(本實驗傳至第3代)接種在不同規(guī)格的培養(yǎng)板內(nèi)并進(jìn)行相應(yīng)的分組處理。設(shè)置不同濃度(0、10、20、50、100、150、200、250、300 mg/L)的Sciobio-Ⅱ，分組處理細(xì)胞，篩選出最佳濃度進(jìn)一步行后續(xù)實驗，經(jīng)預(yù)實驗結(jié)果顯示，Sciobio-Ⅱ濃度為150 mg/L時各組表型均較為顯著。再根據(jù)給予含不同試劑的DMEM 完全培養(yǎng)基將細(xì)胞分5組：control組(PBS)、ox-LDL組(200 mg/L ox-LDL)、Sciobio-Ⅱ組(150 mg/L Sciobio-Ⅱ)、ALL組(200 mg/L ox-LDL+150 mg/L Sciobio-Ⅱ)、LY組(200 mg/L ox-LDL+150 mg/L Sciobio-Ⅱ+25 μmol/L VEGF/Notch信號通路抑制劑 LY450139)。

1.2.2剛果紅染色

用PBS配制150 mg/L Sciobio-Ⅱ溶液，在25 ℃適宜條件下自組裝24 h，分別于0、8、12、24 h時取5～10 μL前述溶液，滴于載玻片上，用配好的剛果紅染液染色30 s，置于光鏡下觀察，分別拍照留存。

1.2.3細(xì)胞增殖能力的檢測

HUVEC接種在96 孔培養(yǎng)板內(nèi)(最外側(cè)36個孔加入空白培養(yǎng)基)，每孔約3 000個細(xì)胞，每組6孔，8 h后鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況，確認(rèn)貼壁良好后，加入ox-LDL、Sciobio-Ⅱ等試劑，分別在0、24、48、72 h時加入CCK-8試劑盒的檢測液，10微升/孔，按照CCK-8試劑盒說明書操作，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使用多功能酶標(biāo)儀于450 nm波長測定吸光度(A450)值，繪制曲線圖。

1.2.4細(xì)胞凋亡的檢測

1.2.4.1末端DNA轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測

HUVEC培養(yǎng)后接種在24孔培養(yǎng)板上，每孔3×104個細(xì)胞，8 h后鏡下確認(rèn)細(xì)胞貼壁，加入ox-LDL、Sciobio-Ⅱ、LY450139等試劑，處理48 h后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基并用PBS洗滌2次，加入TUNEL 試劑盒中的固定液(4%多聚甲醛)，固定20 min，加入PI，每孔50 μL，置于CO2培養(yǎng)箱中避光孵育60 min，PBS洗滌3次后封片，使用共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行觀察(激發(fā)波長為550 nm，發(fā)射波長為570 nm)，分別拍照留存，計算凋亡率。

1.2.4.2Annexin V/PI雙染法檢測

HUVEC培養(yǎng)后接種在6孔培養(yǎng)板上，每孔4×105個細(xì)胞，8 h后鏡下確認(rèn)細(xì)胞貼壁良好，加入ox-LDL、Sciobio-Ⅱ、LY450139等試劑，干預(yù)48 h后，移除細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，加入250 μL 0.25%無乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化細(xì)胞(37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱孵育3 min)，離心(1 000×g，5 min)后棄上清液，加入195 μL Annexin V/PI結(jié)合液，輕輕重懸細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V/PI結(jié)合液和10 μL PI，混合均勻，在室溫下避光孵育15 min，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光)，分析數(shù)據(jù)，計算凋亡率。

1.2.5蛋白免疫印跡(Western blot)試驗

HUVEC接種、貼壁且融合度為 60%后，加入ox-LDL、Sciobio-Ⅱ、LY450139等試劑處理 48 h；加入 250 mL 含 1 mmol/L 苯甲基磺酰氟的蛋白裂解液，使用 BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量[稀釋 10 倍，使用酶標(biāo)儀測定562 nm處吸光度(A562 nm)值]；采用 70～120 V 的恒壓進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，待目的條帶電泳至分離膠中間。300 mA 恒電流進(jìn)行聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)印，轉(zhuǎn)印結(jié)束后做好標(biāo)記；加入Bcl-2、Bax、VEGFR-2、Notch1、β-actin一抗4 ℃孵育過夜；次日回收一抗，加入各自對應(yīng)的二抗；回收二抗，洗膜后每張膜加入配好的化學(xué)發(fā)光液，在凝膠成像儀中曝光得到蛋白條帶(壓片式)。使用 Image-J 軟件掃描各條帶灰度值，根據(jù)灰度值計算蛋白表達(dá)水平。

1.2.6實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

HUVEC培養(yǎng)后接種在6 孔培養(yǎng)板，每孔4×105個細(xì)胞，8 h鏡下確認(rèn)細(xì)胞貼壁后，加入ox-LDL、Sciobio-Ⅱ、LY450139等試劑處理48 h，PBS洗滌2遍，提取總RNA(具體按試劑盒說明操作)，瓊脂糖電泳檢測RNA完整性，并確認(rèn)各標(biāo)本RNA合格后，取1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，制備cDNA，再進(jìn)行RT-qPCR檢測(SYBR法)，檢測基因包括Bcl-2、Bax、VEGFR-2、Notch1，以 β-actin 為內(nèi)參，使用2-ΔΔct法計算各基因的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 自組裝短肽形成結(jié)果

剛果紅染色結(jié)果觀察到Sciobio-Ⅱ動態(tài)的宏觀自組裝過程，開始自組裝2 h時，鏡下可見短肽形成多層疏松薄膜(圖1A)；自組裝 4 h后，層片狀的薄膜形成片狀松散狀(圖1B)；自組裝12 h 后，片狀薄膜的厚度較前增加，同時薄膜之間開始相互連接(圖1C)；自組裝24 h 后，較為致密的單層膜狀結(jié)構(gòu)已經(jīng)形成(圖1D)。

2.2 細(xì)胞增殖情況的比較

與control組比較，ox-LDL 組的A450值明顯下降(P<0.05)；與ox-LDL組比較，Sciobio-Ⅱ組、ALL組的A450值升高，Sciobio-Ⅱ組明顯高于ALL組(P<0.05)。見圖2。

A：疏松薄膜(自組裝2 h)；B：片狀松散薄膜(自組裝4 h)；C:薄膜相互連接(自組裝12 h)；D：單層膜(自組裝24 h)。

圖2 各實驗組細(xì)胞增殖情況

2.3 細(xì)胞凋亡率的比較

TUNEL法與Annexin V/PI雙染法均發(fā)現(xiàn)，與control組比較，ox-LDL組的細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05)；與ox-LDL組比較，Sciobio-Ⅱ組和ALL組的細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.05)，Sciobio-Ⅱ組明顯低于ALL組(P<0.05)。見圖3。

2.4 各組Bcl-2、VEGFR-2、Bax、Notch1基因水平的表達(dá)

與control組比較，ox-LDL組細(xì)胞中Bax、Notch1的基因表達(dá)水平升高，Bcl-2、VEGFR-2的基因表達(dá)水平降低(P<0.05)；與ox-LDL組比較，ALL組細(xì)胞中Bax、Notch1的基因表達(dá)水平降低，Bcl-2、VEGFR-2的基因表達(dá)水平升高(P<0.05)；與ALL組比較，LY組Bax、Notch1的基因表達(dá)水平升高，Bcl-2、VEGFR-2的基因表達(dá)水平降低(P<0.05)。見圖4。

A:TUNEL實驗及定量分析(箭頭所示為凋亡細(xì)胞)；B：Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞實驗及定量分析。

2.5 各組Bcl-2、VEGFR-2、Bax、Notch1蛋白表達(dá)水平的比較

與control組比較，ox-LDL組細(xì)胞中Bax、Notch1的蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2、VEGFR-2的蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；與ox-LDL組比較，ALL組細(xì)胞Bax、Notch1的蛋白表達(dá)水平降低，Bcl-2、VEGFR-2的蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與ALL組比較，LY組Bax、Notch1的蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2、VEGFR-2的蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見圖5。

A：Bax、Bcl-2；B：Notch1、VEGFR-2。

A：Western blot;B:Western blot定量分析。

3 討 論

自組裝短肽是近年新興的一種多功能生物材料，其形成的納米纖維支架可以模仿體內(nèi)細(xì)胞生長的微環(huán)境，控制釋放生長因子，從組織、細(xì)胞到信號因子，蛋白表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞和組織的原位修復(fù)和再生，具有高生物活性與高生物相容性，因而被廣泛應(yīng)用[5-7]。HUVEC已證實可通過多種途徑在炎性細(xì)胞的黏附和遷移，以及新生血管的形成等病理生理過程中發(fā)揮作用，且結(jié)構(gòu)和功能與動脈內(nèi)皮細(xì)胞相似[8-9]。而ox-LDL可以增加血管內(nèi)皮細(xì)胞對某些生長因子、細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌，促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成，抑制內(nèi)皮依賴性血管松弛，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死，是內(nèi)皮功能損傷的危險因素[10-11]。低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)通過氧化應(yīng)激作用形成ox-LDL，ox-LDL可以與內(nèi)皮細(xì)胞表面受體(LOX-1)特異性結(jié)合，引起內(nèi)皮功能失調(diào)、損傷，是促進(jìn)斑塊形成的重要機制[2,12]。

為了明確Sciobio-Ⅱ 在ox-LDL 誘導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷中的作用，本實驗以ox-LDL 刺激HUVEC 作為體外細(xì)胞模型，通過檢測細(xì)胞增殖情況及細(xì)胞凋亡，可觀察到ox-LDL刺激后HUVEC的增殖明顯下降、細(xì)胞凋亡率則明顯增加，說明ox-LDL 能夠誘導(dǎo)HUVEC 發(fā)生損傷。在ox-LDL 刺激的基礎(chǔ)上引入Sciobio-Ⅱ 后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖較ox-LDL組能明顯恢復(fù)，細(xì)胞凋亡率下降，說明Sciobio-Ⅱ能夠改善ox-LDL引起的HUVEC損傷,結(jié)合本實驗研究結(jié)果表明其具體作用機制可能與Bax/Bcl-2通路有關(guān)。結(jié)合本課題組現(xiàn)有的研究結(jié)果，篩選探索Bax/Bcl-2相關(guān)信號通路，認(rèn)為這一恢復(fù)作用的分子介導(dǎo)機制可能與VEGF/Notch信號通路相關(guān)。VEGF是已證實的能夠在血管損傷及再生過程中發(fā)揮作用的一種生長因子，可以介導(dǎo)Notch信號通路，刺激信號通路中的Bax、Bcl-2基因，使Bcl-2基因表達(dá)水平增多，Bax基因表達(dá)水平減少，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、黏附及微血管網(wǎng)絡(luò)的生成，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[13-15]。本實驗結(jié)果顯示在引入VEGF/Notch信號通路抑制劑后，Bax和Notch1的蛋白及基因表達(dá)水平升高，Bcl-2和VEGFR-2的蛋白及基因表達(dá)水平降低，說明Sciobio-Ⅱ是可以通過被激活的VEGF/Notch信號通路來減輕ox-LDL引起的HUVEC凋亡。

綜上所述，自組裝短肽Sciobio-Ⅱ通過激活 VEGF/Notch信號通路減輕 ox-LDL 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，這也可能是Sciobio-Ⅱ發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用的機制與作用途徑，今后可進(jìn)一步開展體內(nèi)實驗來驗證，并進(jìn)一步研究其對動脈粥樣硬化的預(yù)防或延緩作用，為臨床治療提供新的思路。