潘成武，張新鑫，張晨嵩，李 雷，謝 波，李 靖，馬家馳，馮振中

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院：1.腫瘤外科；2.病理科，安徽蚌埠 233000)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是最常見的消化道腫瘤。近年來，由于人們生活方式及飲食習(xí)慣的改變。CRC在我國的發(fā)病率明顯升高，已成為影響我國公民身體健康的重要疾病之一[1]。Twist1是一種在進(jìn)化上高度保守的螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)轉(zhuǎn)錄因子，不僅在胚胎發(fā)育、形成過程中具有重要作用，也是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)并促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控因子[2]。Twist1已被證實(shí)是一種在多種腫瘤中過表達(dá)的新型致癌基因，可賦予腫瘤細(xì)胞更多浸潤性表型特性[3]。血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)是腫瘤細(xì)胞為滿足自身血供需求，通過自身形變及細(xì)胞外基質(zhì)的重塑，形成類似血管樣的血運(yùn)通道。血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏連蛋白(VE-cadherin)是其重要的分子。研究表明，VM可以促進(jìn)多種腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。然而，Twist1對CRC VM的影響尚不清楚。本研究通過對CRC患者臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析Twist1對CRC侵襲、遷移的影響，探究其對VM的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取本院2011年1月至2014年12月經(jīng)手術(shù)切除CRC，隨訪資料完整并經(jīng)病理醫(yī)生診斷為CRC(術(shù)前未行放、化療)的患者124例，取其CRC組織標(biāo)本，并取30例患者的正常結(jié)直腸黏膜標(biāo)本。患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前經(jīng)腸鏡活檢確診為原發(fā)性CRC；(2)無化療、放療史等其他方法治療史；(3)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他組織起源的惡性腫瘤;(2)死于除CRC以外的其他原因。通過電子病歷系統(tǒng)采集患者臨床資料信息。患者的臨床資料包括年齡、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯、臨床分期等。隨訪至2019年12月或患者死亡。本研究已經(jīng)通過本院倫理委員會批準(zhǔn)并取得患者知情同意。

1.2 主要試劑與材料

HT-29、HCT116、SW480、LOVO直腸癌細(xì)胞和HCO正常腸上皮細(xì)胞購自上海中科院生物化學(xué)研究所。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司，胎牛血清(FBS)購自浙江天杭生物科技股份有限公司，小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成,LipofectaminTM2000購自美國Thermo Scientific公司。Transwell小室、基質(zhì)膠購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司；Twist1、VE-cadherin、神經(jīng)型鈣黏連蛋白(N-cadherin)、Snail、人甘油醛-3 -磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔/鼠二抗均購于英國Abcam公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

將組織置于4%多聚甲醛中固定4 h，加熱溶解脫水后放入機(jī)器組織槽中，隨后3次浸蠟。選取模具，使用機(jī)器滴蠟包埋組織。切片機(jī)調(diào)整切片厚度后均勻切片，隨后將切片置于40 ℃水槽中。切片烤干，于二甲苯溶液及梯度乙醇中脫蠟至水。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)步驟參照實(shí)驗(yàn)說明書進(jìn)行，抗體：Twist1、VE-cadherin(1∶200)。采用已知陽性切片作對照，以PBS代替一抗作為空白對照。由3位病理學(xué)醫(yī)師采用雙盲法在顯微鏡下觀察組織切片上每個小塊的所有區(qū)域，判定染色強(qiáng)度和染色陽性率。判定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)染色強(qiáng)度和染色范圍進(jìn)行判定。其中染色強(qiáng)度根據(jù)顏色分為無染色(0分)，淡黃色(1分)，棕黃色(2分)，深棕色(3分)；染色范圍為0分(0～10%)、1分(11%～25%)、2分(26%～50%)、3分(51%～75%)和4分(76%～100%)。用染色強(qiáng)度得分和染色范圍得分的乘積判斷表達(dá)結(jié)果，積分0～<4分為陰性，4～12分為陽性。

1.4 雙重染色法

CD34免疫組織化學(xué)染色，然后將切片置于0.5%高碘酸溶液中氧化5～8 min。流水沖洗2 min，再用蒸餾水洗1次，于暗處置于Schiff液中染色10～20 min，然后用0.5%偏重亞硫酸鈉液滴洗2次，每次1 min，依次蘇木素染色細(xì)胞核、鹽酸乙醇分化、返藍(lán)、脫水透明及中性樹膠封片。通過CD34與高碘酸-希夫(PAS)雙重染色，在CRC組織切片中觀察到由腫瘤細(xì)胞排列形成的管腔樣結(jié)構(gòu)，CD34陽性證實(shí)其為VM。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

正常人腸上皮細(xì)胞HCO培養(yǎng)于含10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，CRC細(xì)胞株HT-29、HCT116、SW480、LOVO分別培養(yǎng)于含有10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，5% CO2、37 ℃ 條件培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，將si-NC(si-NC組，陰性對照)、si-Twistl(si-Twistl組)轉(zhuǎn)染于HCT116細(xì)胞。取對數(shù)生長期細(xì)胞， 于轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞以3×105/孔接種于6孔板；轉(zhuǎn)染時加入相應(yīng)試劑并混合均勻，將細(xì)胞培養(yǎng)基換為無血清培養(yǎng)基，5% CO2、37 ℃ 條件培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，然后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。si-Twistl正向：5′-CUG CAG ACG CAG CGG GUC A-3′；反向：5′-UGA CCC GCU GCG UCU GCA G-3′。si-NC 正向：5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG U-3′。反向：5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA A-3′。

1.7 Western blot

收集細(xì)胞，加入裂解液完全裂解細(xì)胞，12 000×g離心10 min，收集上清液，即為總蛋白溶液。BCA法檢測蛋白濃度，并定量。蛋白上樣，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，孵育一抗后，置于冰箱中4 ℃過夜，加入用封閉液稀釋的二抗，室溫孵育60 min。通過凝膠成像系統(tǒng)檢測并計(jì)算Twist1、VE-cadherin、EMT和VE相關(guān)蛋白表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參。

1.8 體外遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)

在Transwell下室中加入趨化因子表皮生長因子(EGF，10 ng/mL) 600微升/孔，細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液,每種細(xì)胞做3個復(fù)孔，在上室孔中加入200 μL 1×105/L細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h，棄去上室液體，用濕棉簽擦去膜上未穿膜的細(xì)胞，蘇木素染色，倒置顯微鏡下觀察穿膜細(xì)胞(200×)，每張膜中央部分和周圍部分各取3個視野，計(jì)數(shù)每個視野內(nèi)穿孔的細(xì)胞數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)需要加Matrigel凝膠鋪于Transwell上室。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Twist1、VE-cadherin在CRC中的表達(dá)及CRC組織中VM形成情況

Twist1在CRC組織中陽性70例，陰性54例，陽性率56.5%；Twist1在正常結(jié)直腸黏膜組織中陽性2例，陰性28例，陽性率6.7%。VE-cadherin在CRC組織中陽性60例，陰性64例，陽性率48.4%；VE-cadherin在正常結(jié)直腸黏膜組織中陽性1例，陰性29例，陽性率3.3%。Twist1、VE-cadherin在CRC組織中的陽性率較正常結(jié)直腸黏膜高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。VM在CRC組織中陽性21例，陰性103例，陽性率16.9%。見圖1。

2.2 CRC中Twist1、VE-cadherin的表達(dá)和VM與臨床病理學(xué)的關(guān)系

為了研究Twist1和VE-cadherin對CRC預(yù)后的判斷作用，分析了免疫組織化學(xué)結(jié)果與患者臨床病例資料的關(guān)系，結(jié)果表明，Twist1表達(dá)與病理分級(P=0.03)、血管侵犯(P=0.04)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.01)有關(guān)。VE-cadherin表達(dá)與血管侵犯(P<0.01)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.01)有關(guān)。VM與病理分級(P<0.01)、TNM分期(P=0.03)、血管侵犯(P<0.01)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.01)有關(guān)。見表1。

A：Twist1在正常黏膜組織中陰性表達(dá)；B：Twist1在CRC組織中陽性表達(dá)；C：VE-cadherin在正常黏膜組織中陰性表達(dá)；D:VE-cadherin在CRC組織中陽性表達(dá)；E:CD34和 PAS雙染,紅色箭頭指示VM結(jié)構(gòu)，黑色箭頭指示血管結(jié)構(gòu)。

表1 Twist1、VE-cadherin表達(dá)和VM與CRC臨床病理因素的關(guān)系[n(%)]

續(xù)表1 Twist1、VE-cadherin表達(dá)和VM與CRC臨床病理因素的關(guān)系[n(%)]

2.3 CRC組織Twist1高表達(dá)與低表達(dá)組術(shù)后5年生存率比較

124例CRC患者隨訪數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，Twist1高表達(dá)組(n=69)術(shù)后5年生存率明顯低于Twist1低表達(dá)組(n=62),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

圖2 Twist1高表達(dá)組與低表達(dá)組術(shù)后5年生存率比較

2.4 Twist1在CRC細(xì)胞株中的表達(dá)

Western blot檢測顯示，與正常腸上皮細(xì)胞HCO比較，CRC細(xì)胞株HCT116、HT-29、SW480、LOVO中Twist1的表達(dá)水平分別是其5.1、4.3、3.4、3.9倍。見圖3。根據(jù)細(xì)胞株表達(dá)情況，選擇表達(dá)水平最高的HCT116細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

A:Western blot；B：Western blot定量分析；a:P<0.05。

2.5 siRNA沉默Twist1表達(dá)后檢測CRC細(xì)胞中Twist1表達(dá)水平

Western blot檢測顯示，與si-NC組比較，si- Twist1組HCT116細(xì)胞中Twist1水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

A:Western blot；B：Western blot定量分析；a:P<0.05。

2.6 Twist1對CRC細(xì)胞EMT的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-Twist1組HCT116細(xì)胞中N-cadherin、Snail的表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

A:Western blot；B：Western blot定量分析；a:P<0.05。

2.7 Twist1對CRC細(xì)胞VM的影響

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-Twist1組48 h HCT116細(xì)胞遷移數(shù)少于si-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-Twist1組48 h HCT116細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)少于si-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western blot檢測顯示，與si-NC組比較，si-Twist1組中VE-cadherin表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。

A：細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)及定量分析；B：VE-cadherin Western blot檢測及定量分析；a:P<0.05。

3 討 論

CRC在世界范圍內(nèi)發(fā)病率排名第3，病死率排名第4，其中70%為結(jié)腸癌[4]。盡管CRC的治療有了進(jìn)步，但其病死率仍很高[5]。因此，需要更可靠的分子預(yù)后標(biāo)志物來改善CRC的診斷和治療。

腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移需要足夠的營養(yǎng)和氧氣，“抗腫瘤血管生成的治療”已成為近年來腫瘤研究一大熱點(diǎn)。在惡性腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)的一種PAS染色陽性，CD34等內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物染色陽性的管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被命名為VM，并推測其參與了腫瘤的微循環(huán)過程[6]。VM是指某些高侵襲性腫瘤為滿足自身的血供，腫瘤細(xì)胞在沒有血管內(nèi)皮細(xì)胞的參與下，能夠模擬內(nèi)皮細(xì)胞并形成管樣結(jié)構(gòu)，引起惡性腫瘤細(xì)胞可塑性改變、細(xì)胞外基質(zhì)重塑并可以與宿主的微循環(huán)系統(tǒng)相通[7]。VM能夠促進(jìn)新生血管形成，并與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后密切相關(guān)，在諸如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌等上皮來源的腫瘤中相繼證實(shí)了VM 的存在[8-10]。

VE-cadherin是血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)cadherin超家族的成員，是內(nèi)皮細(xì)胞黏附連接的主要黏附受體。研究表明VE-cadherin在VM的形成中起著重要作用。VE-cadherin已被報道在多種腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，并參與腫瘤的新血管形成、生長和進(jìn)展。已有研究表明，VE-cadherin的異常表達(dá)促進(jìn)了惡性黑色素瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，并參與了該腫瘤的VM。TANG等[11]預(yù)測HIF-1α可以直接或間接調(diào)控VE-cadherin、EphA2和Laminin 5γ2 (LN5γ2)基因的表達(dá)。它還能促進(jìn)VM的形成，為CRC提供血供。但尚不清楚CRC中VM與VE-cadherin的相關(guān)性是否與其他因子的異常表達(dá)有關(guān)。

近年來，多項(xiàng)研究表明Twist家族堿性bHLH轉(zhuǎn)錄因子1(即Twist1)在膀胱癌、胃癌、鼻咽癌、前列腺癌、乳腺癌和滑膜肉瘤等多種癌癥中均高表達(dá)。本研究通過收集CRC患者數(shù)據(jù)，同時結(jié)合免疫組織化學(xué)結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)Twist1、VE-cadherin在CRC中高表達(dá)。在高度惡性的CRC中存在VM現(xiàn)象，Twist1、VE-cadherin的過表達(dá)和VM與CRC的血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)明顯相關(guān)。對術(shù)后患者進(jìn)行隨訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)，Twist1高表達(dá)組術(shù)后5年生存率明顯低于Twist1低表達(dá)組。本研究創(chuàng)新性地利用臨床數(shù)據(jù)分析了Twist1、VE-cadherin和VM與CRC臨床病理特征的相關(guān)性，并且發(fā)現(xiàn)Twist1的表達(dá)與臨床預(yù)后相關(guān)。

Twist1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用涉及多種機(jī)制，包括調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長、分化、抑制凋亡、增加化療耐藥性、促進(jìn)腫瘤血管生成[12-16]。已有研究表明，Twist1下調(diào)了肝癌細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)水平，上調(diào)了VE-cadherin和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、MMP-2的表達(dá)水平，以促進(jìn)肝癌細(xì)胞VM的形成[17]。然而，關(guān)于Twist1在CRC中VM形成的研究有限。為進(jìn)一步驗(yàn)證臨床結(jié)果Twist1對VM的影響。本研究沉默CRC細(xì)胞株HCT116 Twist1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CRC細(xì)胞侵襲、遷移及EMT受到抑制。此結(jié)果說明Twist1表達(dá)水平可能影響侵襲、遷移及EMT。為了進(jìn)一步研究Twist1與VM的關(guān)系，本研究通過Western blot檢測VM重要分子VE-cadherin的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)抑制Twist1表達(dá)水平，VE-cadherin的表達(dá)水平也受到抑制。這些結(jié)果均表明，Twist1的表達(dá)水平與VM相關(guān)分子VE-cadherin表達(dá)相關(guān)。然而，筆者并未深入研究VM形成的機(jī)制，本課題組將在后續(xù)研究中繼續(xù)深入探索。

綜上所述，Twist1在CRC組織中高表達(dá)并與腫瘤的轉(zhuǎn)移和發(fā)展相關(guān)，對評估預(yù)后具有一定的價值。基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Twist1通過影響VM來影響腫瘤的轉(zhuǎn)移和發(fā)展。而其具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。