黃亞麗，李亞倬，李蕊婷，于紅紅，盧士玲

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832003）

新疆熏馬腸是一種自然發(fā)酵香腸，具有高蛋白水解活性和較長的成熟期，因此有利于微生物積累生物胺。酪胺是一種廣泛存在于發(fā)酵肉制品中的生物胺[1]，攝入過量可能會引起偏頭痛、惡心、心血管疾病等[2-3]。歐洲食品安全局建議健康人群對酪胺的每日最大攝取量為600 mg，但服用經(jīng)典單胺氧化酶抑制劑的人群每日最多可攝取酪胺6 mg[4]。食品中細(xì)菌通過酶解酪氨酸生成酪胺，已知腸桿菌、腸道球菌、乳酸桿菌等細(xì)菌在食品發(fā)酵過程中產(chǎn)生酪胺[5-6]。研究人員發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生酪胺的基因由編碼酪氨酸脫羧酶（tyrosine decarboxylase，tdcA）、酪氨酸/酪胺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體（tyrosine/tyramine antiporter，tyrP）、酪氨酸t(yī)-RNA合成酶（tyrosine t-RNA synthetases，tyrS）和Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體（Na＋/H＋antiporter，nhaC）4 個基因組成[7]，nhaC在酪胺生物合成中的作用仍未知[8]。

多酚作為一種抗菌劑具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，可提高肉制品的質(zhì)量和安全性[9]。阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）是肉桂酸衍生物之一，是一種普遍存在于植物界的酚酸。Lemos等[10]證實(shí)，F(xiàn)A可以破壞蠟樣芽孢桿菌的生物膜結(jié)構(gòu)，從而抑制其生長。但FA水溶性差、光穩(wěn)定性低從而影響其利用率[11]。研究表明包封技術(shù)能夠有效保持多酚穩(wěn)定性和利用率。Kfoury等[12]使用2-羥丙基-β-環(huán)糊精（2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD）包埋苯丙烷類化合物，顯著提高了其溶解度和光穩(wěn)定性，分別為未包埋組的14 倍和44 倍。此外，Gong Liang等[13]研究HP-β-CD包埋丁香酚的抗真菌作用模式，發(fā)現(xiàn)包埋能夠提高丁香酚在食品應(yīng)用中的穩(wěn)定性。然而，目前關(guān)于FA包合物HP-β-CD/FA對熏馬腸產(chǎn)酪胺的抑制作用，及其對產(chǎn)酪胺基因表達(dá)影響的研究鮮見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)研究HP-β-CD/FA包合物對陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）L63生長、基因表達(dá)和酪胺積累的影響，明確HP-β-CD/FA包合物對新疆熏馬腸中產(chǎn)酪胺途徑機(jī)制的影響，以期提高熏馬腸等發(fā)酵肉制品的安全性，為HP-β-CD/FA包合物應(yīng)用于熏馬腸及其他發(fā)酵肉制品提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陰溝腸桿菌L63（GenBank登錄號：MW386397）由石河子大學(xué)食品學(xué)院畜產(chǎn)品加工與安全控制中心實(shí)驗(yàn)室分離。

FA（反-4-羥基-3-甲氧基肉桂酸≥98%） 北京博鰲科技有限公司；HP-β-CD 上海麥克林生化試劑有限公司；丹磺酰氯、甲醇（色譜純） 美國Sigma公司；乙腈（色譜純） 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；腦心浸液（brain heart infusion，BHI）、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂（violet red bile glucose agar，VRBGA）、甘露醇鹽瓊脂（mannitol salt agar，MSA）和MRS（Man Rogosa Sharpe）瓊脂培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；TRIzol試劑（MagZolTMReagent） 美國Invitrogen公司；cDNA合成試劑盒 加拿大Applied Biological Materials公司；2×S6 Universal SYBR qPCR Mix 新貝（上海）生物科技有限公司；馬肉、天然腸衣 新疆伊犁市伊卡孜有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Beta 2-8 LD plus冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；IX71倒置熒光顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社；Nicolet IS10傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）儀、ND-2000C超微量核酸測定儀 美國賽默飛世爾公司；H1M多功能酶標(biāo)儀美國伯騰儀器有限公司；PHS-3C pH計(jì) 上海儀電有限公司；MX3000P實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國安捷倫科技公司；LC-20AT高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）儀 日本島津制作所；高速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼公司；T25均質(zhì)機(jī) 德國艾卡設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HP-β-CD/FA包合物和物理混合物的制備

采用Hsu等[14]方法，準(zhǔn)確稱取0.58 g FA和4.6 g HP-β-CD分別溶解在10 mL無水乙醇和10 mL蒸餾水中，然后將FA溶液緩慢加入HP-β-CD溶液中，搖床室溫（22～26 ℃）振蕩24 h，將獲得的澄清溶液4 ℃放置12 h。置于-80 ℃冰箱冷凍24 h，真空冷凍干燥12 h獲得固體HP-β-CD/FA包合物。

物理混合物：FA和HP-β-CD按物質(zhì)的量比1∶1置于研缽中研磨2 min，獲得均勻的混合物。

1.3.2 HP-β-CD/FA包合物的表征

1.3.2.1 微觀結(jié)構(gòu)觀察

取少量FA、HP-β-CD、HP-β-CD/FA包合物及其物理混合物分別放置在載玻片上，蒸餾水分散制成懸濁液并將蓋玻片放置在頂部，使用倒置熒光顯微鏡觀察并記錄每個樣品。

1.3.2.2 FT-IR分析

采用溴化鉀壓片法，取FA、HP-β-CD、HP-β-CD/FA包合物及其物理混合物與光譜級溴化鉀混合（2 mg KBr/200 mg樣品），每個樣品粉末研磨5 min，在20 MPa下壓制40 s，以獲得1 mm透明顆粒，置于FT-IR光譜儀中掃描樣品測定紅外光譜吸收曲線。掃描范圍4 000～400 cm-1，分辨率2 cm-1。

1.3.2.3 HP-β-CD/FA包合物和FA最低抑菌濃度的測定

使用微量肉湯稀釋法[15]，采用無菌96 孔板，每孔中加入100 μL BHI肉湯，同時制備質(zhì)量濃度為100 mg/mL的HP-β-CD/FA包合物原液。將100 μL原液添加到第1行每孔中，然后從第1行每孔取100 μL與第2行相應(yīng)孔中肉湯混合，再從第2行取100 μL與第3行相應(yīng)孔肉湯混合，依次倍增稀釋至第7行（第7行每孔中取100 μL棄用）。然后每孔中加入100 μL 106CFU/mL菌液，每組3 個復(fù)孔。使用僅含菌液培養(yǎng)基、僅含HP-β-CD/FA包合物原液培養(yǎng)基以及不含HP-β-CD/FA包合物和菌液培養(yǎng)基作為對照。96 孔板在37 ℃培養(yǎng)持續(xù)24 h。目測96 孔板孔中肉湯濁度未改變的質(zhì)量濃度為最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。按相同方法測定FA的MIC。

1.3.2.4 陰溝腸桿菌L63生長量和pH值的測定

制備3 組菌液：L組：培養(yǎng)液中添加酪氨酸；L＋MIC包合物組：培養(yǎng)液中添加酪氨酸和質(zhì)量濃度為MIC的HP-β-CD/FA；L＋FA組：培養(yǎng)液中添加酪氨酸和質(zhì)量濃度為MIC的HP-β-CD/FA包合物中相同質(zhì)量的FA；酪氨酸添加量均為0.2 g/100 mL。每組3 個重復(fù)，接入200 μL供試菌液在37 ℃下恒溫培養(yǎng)，每組不添加供試菌作為陰性對照，48 h內(nèi)每4 h采集樣品一次（2 mL），測定OD600nm和pH值。

1.3.3 酪氨酸脫羧酶相關(guān)基因表達(dá)量的測定

1.3.3.1 RNA提取和cDNA合成

按照1.3.2.4節(jié)方法制備3 組培養(yǎng)物，接入供試菌后在37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。根據(jù)于紅紅等[16]的方法激活酪氨酸脫羧酶（tyrosine decarboxylase，TDC）基因簇的轉(zhuǎn)錄，用MagZol試劑法從陰溝腸桿菌L63中提取總RNA。純化的RNA樣品在無RNA酶的水中重浮，分別在260 nm和280 nm波長處測定吸光度，以確定RNA濃度。采用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶，以檢測RNA完整性。然后根據(jù)cDNA合成試劑盒進(jìn)行cDNA的合成。取2 μg符合要求的RNA加入2 μL AccuRT Reaction Mix（4×），加無酶水至終體積為8 μL，42 ℃孵育2 min，去除gDNA后加入2 μL AccuRT Reaction Stopper（5×），隨后加入4 μL 5×All-in-One RT MasterMix和6 μL無酶水，反應(yīng)終體積20 μL。20 ℃孵育10 min，42 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 min后終止反應(yīng)，于冰上冷卻。

1.3.3.2 實(shí)時熒光定量PCR檢測基因表達(dá)

使用表1所列引物通過PCR分析cDNA樣本。以引物對recA-F/recA-R和tuf-F/tuf-R作為參考。反應(yīng)體系（總體積20 μL）：2×S6 Universal SYBR qPCR Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL和cDNA模板2 μL，加入無酶水補(bǔ)至20 μL。每次實(shí)驗(yàn)中未加cDNA模板作為陰性對照。根據(jù)公式R＝2?ΔΔCt計(jì)算基因相對表達(dá)量[17]。

表1 實(shí)時熒光定量PCR所用引物Table 1 Primers used for real-time PCR

1.3.4 酪胺質(zhì)量濃度的測定

參考Lu Shiling等[21]的方法并作修改，采用HPLC法測定樣品中的酪胺質(zhì)量濃度。準(zhǔn)確稱取酪胺標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，加入0.4 mol/L高氯酸溶液定容至5 mL，分別稀釋成質(zhì)量濃度10、20、50、100、200、400 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。按照1.3.2.4節(jié)方法制備3 組菌液樣品，并在48 h內(nèi)每4 h采集2 mL菌液，然后12 000×g離心10 min，取1 mL上清液加入200 μL 2 mol/L NaOH溶液、300 μL飽和NaHCO3溶液和2 mL 5 mg/mL丹磺酰氯溶液，35 ℃暗反應(yīng)45 min后加入100 μL氨水終止反應(yīng)，然后乙腈定容至5 mL。過0.22 μm過濾器后進(jìn)行HPLC分析。檢測條件：Agilent C18柱（4.6 mm×250 mm），柱溫30 ℃，上樣體積20 μL，流動相A超純水、流動相B乙腈；按照黃笠原等[22]的程序進(jìn)行梯度洗脫。

1.3.5 HP-β-CD/FA包合物對熏馬腸中酪胺積累影響的研究

1.3.5.1 熏馬腸的制備

原料肉去除淋巴、血管、筋膜等組織，優(yōu)質(zhì)瘦肉、肥肉質(zhì)量比80∶20。在肉塊表面噴涂體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液灼燒，紫外燈照射30 min滅菌。將原料肉切成邊長1～2 cm塊狀，以肉質(zhì)量計(jì)，加入2.0%食鹽、2.0%白糖、0.1%味精、0.2%姜粉、0.1%八角、0.1%胡椒粉、0.15%花椒粉、0.1%五香粉和0.01%亞硝酸鈉充分混勻，再加入1%煙熏液攪拌均勻。4 ℃下腌制1 h，用灌腸機(jī)將已調(diào)味的肉粒灌入天然腸衣內(nèi)，灌腸要求飽滿，過程中用牙簽扎孔，保證腸內(nèi)無空氣。

制備5 組熏馬腸：A組：空白；B組：添加質(zhì)量濃度為MIC的HP-β-CD/FA；C組：接種103CFU/mL陰溝腸桿菌L63；D組：接種103CFU/mL陰溝腸桿菌L63和質(zhì)量濃度為MIC的HP-β-CD/FA；E組：接種103CFU/mL陰溝腸桿菌L63和質(zhì)量濃度為MIC的HP-β-CD/FA包合物中相同質(zhì)量的FA。以上菌株接種量均為3%（以熏馬腸質(zhì)量計(jì)），每組3 個重復(fù)。制作完成后于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵，分別在0、3、7、14、21、28 d取樣進(jìn)行指標(biāo)測定，每個處理平行測定3 次。發(fā)酵條件如表2所示。

表2 熏馬腸的發(fā)酵條件Table 2 Fermentation conditions of smoked horsemeat sausage

1.3.5.2 微生物計(jì)數(shù)

在無菌條件下稱取10 g熏馬腸樣品加入90 mL生理鹽水，拍打機(jī)拍打20 min直至樣液在無菌生理鹽水中完全渾濁，按照Yu Honghong等[23]的方法采用平板計(jì)數(shù)法，連續(xù)稀釋后在選擇培養(yǎng)基上涂布，分別對腸桿菌科、腸球菌、乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）計(jì)數(shù)。

1.3.5.3 熏馬腸pH值的測定

采用無菌拍打袋稱取熏馬腸樣品10 g，加入90 mL生理鹽水，拍打機(jī)拍打20 min使樣液在無菌生理鹽水中完全渾濁，靜置沉淀后用pH計(jì)測定上清液pH值。

1.3.5.4 熏馬腸生物胺質(zhì)量濃度的測定

取5 g熏馬腸樣品加入0.4 mol/mL 20 mL高氯酸溶液后均質(zhì)，于10 ℃、5 000 r/min均質(zhì)10 min，取上清液；再次重復(fù)上述操作，將上清液用乙腈定容到50 mL。取1 mL處理好的樣品液按1.3.4節(jié)方法測定酪胺質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用GraphPad Prism 9.0.0軟件采用單因素方差分析和鄧肯多范圍檢驗(yàn)進(jìn)行組間顯著性差異比較，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 FA、HP-β-CD、HP-β-CD/FA包合物和物理混合物的微觀形貌觀察結(jié)果

經(jīng)冷凍干燥法制備的HP-β-CD/FA包合物外觀為淡粉色粉末，略有FA氣味。如圖1所示，F(xiàn)A為短柱狀晶體，而HP-β-CD呈球形結(jié)構(gòu)；FA和HP-β-CD的物理混合物保留了二者原始形態(tài)，物理混合后沒有發(fā)生形態(tài)變化，表明物理混合僅為疊加；而HP-β-CD/FA包合物的表面形貌與FA和HP-β-CD均不同，呈不規(guī)則塊狀結(jié)構(gòu)且變化明顯，表明包合物形成。Zhong Yuanyuan等[24]也報(bào)道了類似結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)HP-β-CD/FA包合物的形成。

圖1 FA（A）、HP-β-CD（B）、物理混合物（C）和HP-β-CD/FA包合物（D）的微觀圖像Fig. 1 Micrographs of FA (A), HP-β-CD (B), physical mixture (C), and HP-β-CD/FA inclusion complex (D)

2.2 FA、HP-β-CD、HP-β-CD/FA包合物和物理混合物的FT-IR分析結(jié)果

如圖2所示，F(xiàn)A在3 436 cm-1處存在O—H鍵的伸縮振動、1 620～1 433 cm-1處存在C—C鍵的伸縮振動[25]；此外，1 691cm-1處為芳香共軛羰基特征峰，804 cm-1和851 cm-1處的銳帶是由FA苯環(huán)上兩個相鄰氫原子引起[26]。HP-β-CD在2 931 cm-1處表現(xiàn)出明顯的C—H伸縮振動吸收峰[27]，在1 155 cm-1和1 033 cm-1處表現(xiàn)出顯著的C—O伸縮振動吸收峰[24]。與單組分相比，物理混合物的FT-IR光譜沒有顯著變化，表現(xiàn)為FA和HP-β-CD特征峰的疊加。然而，HP-β-CD/FA包合物的FT-IR光譜與FA顯著不同，由于羥基數(shù)量改變，HP-β-CD/FA包合物在3 436 cm-1附近的寬峰強(qiáng)度增加[28]，位于FA上1 691、1 620、1 516 cm-1和851 cm-1的特征峰發(fā)生位移且強(qiáng)度減小，而位于1 433 cm-1和804 cm-1處的峰則完全被HP-β-CD的峰掩蓋。表明FA成功進(jìn)入HP-β-CD形成包合物，這與顯微觀察結(jié)果一致。

圖2 FA、HP-β-CD、物理混合物和HP-β-CD/FA包合物FT-IR圖Fig. 2 FT-IR spectra of FA, HP-β-CD, physical mixture and HP-β-CD/FA inclusion complex

2.3 HP-β-CD/FA包合物和FA對陰溝腸桿菌L63的MIC

研究表明FA對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和酵母菌具有較強(qiáng)的抗菌活性[29]，并對一些人體胃腸道菌群表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用，如大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌、銅綠假單胞菌和幽門螺桿菌等[30]。如表3所示，HP-β-CD/FA包合物質(zhì)量濃度不同對供試菌的抑制效果不同。FA對陰溝腸桿菌L63的MIC為0.781 mg/mL。此前，趙利利等[31]報(bào)道FA對大腸桿菌和蠟狀芽孢桿菌的MIC分別為0.31 mg/mL和0.63 mg/mL，表明大腸桿菌和蠟狀芽孢桿菌對FA的敏感度要高于陰溝腸桿菌L63。王麗平[32]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A包合物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和蠟狀芽孢桿菌的MIC分別為1.25、5 mg/mL和2.5 mg/mL。本研究中HP-β-CD/FA包合物對陰溝腸桿菌L63的MIC為3.125 mg/mL。Chan等[33]研究發(fā)現(xiàn)，6 種酚類植物提取物對5 種常見食源性致病菌的MIC范圍在0.31～2.5 mg/mL之間，低于本研究結(jié)果，這可能是因?yàn)榉宇惡凸┰嚲牟煌?，也可能由于FA被β-CD包埋。

表3 HP-β-CD/FA包合物和FA對陰溝腸桿菌L63的MICTable 3 MICs of HP-β-CD/FA inclusion complex and FA against E. cloacae L63

2.4 HP-β-CD/FA包合物對陰溝腸桿菌L63生長量和pH值的影響

如圖3A所示，供試菌OD600nm為L組＞L＋FA組＞L＋MIC包合物組，說明HP-β-CD/FA包合物對陰溝腸桿菌L63生長有一定的抑制作用。FA包埋后抑制效果更明顯，這可能是因?yàn)镕A包埋后釋放緩慢，同時在介質(zhì)中擴(kuò)散性增強(qiáng)[10]。添加HP-β-CD/FA包合物延緩了供試菌的生長期和對數(shù)期，整個時期生長趨勢沒有改變，培養(yǎng)48 h，L＋MIC包合物組OD600nm較L組降低了63.67%，這與Hsu等[14]的研究結(jié)果類似。

如圖3B所示，培養(yǎng)48 h期間，L組pH值逐漸升高，這可能是由于酪氨酸在TDC作用下脫羧產(chǎn)生酪胺；L＋FA和L＋MIC包合物組的pH值先略下降，隨后逐漸升高，這表明初期酸性物質(zhì)的產(chǎn)生速率略高于酪胺的產(chǎn)生速率，與于紅紅等[16]研究結(jié)果一致。L＋FA和L＋MIC包合物組的pH值均低于L組，表明FA和HP-β-CD/FA包合物均抑制了陰溝腸桿菌L63的生長，進(jìn)而減緩了酪胺積累，添加HP-β-CD/FA包合物的抑制效果更明顯。Hu Yongjin等[34]報(bào)道混合發(fā)酵劑培養(yǎng)可快速降低pH值，并抑制酪胺的累積。部分學(xué)者認(rèn)為，快速降低pH值有利于控制生物胺的產(chǎn)生[35]。

圖3 HP-β-CD/FA包合物在48 h內(nèi)對陰溝腸桿菌L63 OD600 nm（A）和pH值（B）的影響Fig. 3 Effects of HP-β-CD/FA inclusion complex on OD600 nm (A) and pH (B) of E. cloacae L63 during 48 h of culture

2.5 HP-β-CD/FA包合物對TDC簇中相關(guān)基因表達(dá)的影響

酪胺產(chǎn)生基因的排列順序依次為tyrS、tdcA、tyrP、nhaC[36]。由圖4A可知，與L組相比，添加L＋MIC包合物顯著抑制tdcA和tyrP基因在陰溝腸桿菌L63中的表達(dá)。相反，tyrS和nhaC的轉(zhuǎn)錄不受HP-β-CD/FA包合物的調(diào)控。L組中tdcA、tyrP和nhaC表達(dá)水平較高，tyrS的轉(zhuǎn)錄未顯著表達(dá)。Linares等[37]觀察到在大腸桿菌的TDC基因簇中tyrS表達(dá)取決于酸性pH和酪氨酸缺乏，tyrS的過表達(dá)不影響tdcA的表達(dá)。此外，tdcA和nhaC起始密碼子的上游存在假定的啟動子和終止子[38]，tdcA和tyrP之間沒有假定的啟動子和終止子[39]。這表明tdcA和tyrP的表達(dá)可能是獨(dú)立的，tyrS和nhaC在酪氨酸脫羧途徑中不是必需的[40]。酪胺由tdcA和tyrP蛋白相互作用形成，tdcA依賴磷酸吡哆醛催化酪氨酸脫羧生成酪胺并釋放CO2[41]；tyrP作為一種特殊的膜逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，不僅促進(jìn)酪氨酸的攝取和酪胺的釋放，還可以在沒有酪胺交換的情況下將酪氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中，但速率較慢[18]。本研究中，與FA相比，HP-β-CD/FA包合物較FA更顯著地抑制了陰溝腸桿菌L63中tdcA和tyrP的表達(dá)。通過降低pH值，HP-β-CD/FA包合物也可以間接影響tdcA和tyrp基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而減少酪胺積累。

圖4 HP-β-CD/FA包合物對陰溝腸桿菌L63中TDC相關(guān)基因表達(dá)（A）和酪胺積累（B）的影響Fig. 4 Effects of HP-β-CD/FA inclusion complex on the expression of TDC-related genes (A) and tyramine accumulation (B) in E. cloacae L63

2.6 HP-β-CD/FA包合物對陰溝腸桿菌L63酪胺積累的影響

如圖4B所示，在8～20 h，酪胺質(zhì)量濃度明顯增加；穩(wěn)定期酪胺積累速率明顯減慢，質(zhì)量濃度逐漸趨于穩(wěn)定，48 h時L組中酪胺質(zhì)量濃度為471.414 μg/mL。Zhang Qiuqin等[9]證明玫瑰多酚可抑制生物胺的形成和細(xì)菌腐敗生長。于紅紅等[16]報(bào)道百里香微膠囊可以抑制摩根氏菌ND和變形桿菌R3的生長，分別有效減少了61.08%和55.89%的組胺積累。相同培養(yǎng)時間下，L＋MIC包合物組酪胺質(zhì)量濃度明顯低于L＋FA組，這說明FA包埋后抑制效果更好，培養(yǎng)48 h時，與L組相比，L＋MIC包合物組酪胺積累減少了64.46%，優(yōu)于之前研究中添加發(fā)酵劑的抑制效果[42-43]。結(jié)果證實(shí)HP-β-CD/FA包合物能顯著抑制陰溝腸桿菌L63的生長和tdcA、tyrP基因的轉(zhuǎn)錄，有效減少酪胺的積累。

2.7 HP-β-CD/FA包合物對熏馬腸中酪胺積累的影響

2.7.1 微生物分析

如表4所示，0～7 d腸球菌和LAB數(shù)量逐漸增加，第14天時略有降低。LAB為整個發(fā)酵期間的優(yōu)勢菌。第28天時，A、D、E組的LAB數(shù)量沒有顯著差異，B組的LAB數(shù)量顯著高于A組（P＜0.05），這說明HP-β-CD/FA包合物對LAB的生長可能有促進(jìn)作用。此前，Zhao Danyue等[44]研究表明葡萄多酚可以促進(jìn)LAB的生長。此外，HP-β-CD/FA包合物抑制了腸桿菌科的生長，但沒有表現(xiàn)出明顯的殺菌活性，Lu Shiling等[45]在不同植物提取物對熏馬腸影響的研究中得到了類似結(jié)果。在第28天發(fā)酵成熟時，B、D組中腸桿菌科數(shù)量較A、C組顯著降低，表明HP-β-CD/FA包合物能夠抑制腸桿菌科微生物的生長。D組中腸桿菌科數(shù)量低于E組，表明HP-β-CD/FA包合物對腸桿菌的抑制效果較FA更顯著。HP-β-CD/FA包合物通過干擾細(xì)胞膜磷脂，破壞其生物膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)滲出，從而達(dá)到抑菌效果[46]。因此，HP-β-CD/FA包合物的高抗菌性能歸因于FA的緩慢釋放和更好的溶解性，使其具有更穩(wěn)定的抑菌作用。

表4 熏馬腸成熟過程中微生物計(jì)數(shù)Table 4 Microbial counts during ripening of smoked horsemeat sausage

2.7.2 熏馬腸的pH值

pH值是影響肉制品中生物胺生成的一個重要因素。pH值對細(xì)菌污染、酵母菌生長以及發(fā)酵速率有抑制作用[45]。正常情況下，新鮮馬肉的pH值為5.5～6.2。如圖5A所示，5 組熏馬腸的初始pH值在5.32～5.47之間。在0～3 d時pH值迅速下降，這是由于微生物分解碳水化合物為乳酸或發(fā)酵過程中氨基酸脫氨轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸[47]。在發(fā)酵7 d開始pH值緩慢回升，這可能是因?yàn)槲⑸锇l(fā)生脫羧或脫氨反應(yīng)積累生物胺從而抵抗酸性環(huán)境。此外，B、D和E組的pH值低于A、C組，說明加入FA和HP-β-CD/FA包合物均能夠有效降低熏馬腸pH值，抑制腐敗菌生長；此外，D組pH值低于E組，說明FA包埋后的抑制效果較FA更顯著。

圖5 熏馬腸發(fā)酵期間pH值（A）和酪胺質(zhì)量濃度（B）的變化Fig. 5 Changes in pH (A) and tyramine content (B) in smoked horsemeat sausage during fermentation

2.7.3 酪胺質(zhì)量濃度

如圖5B所示，在0～21 d酪胺質(zhì)量濃度明顯增加，第21天時A組和C組中檢測到較高質(zhì)量濃度的酪胺，第28天時略有下降，分別下降至315.94 μg/mL和384.19 μg/mL，這可能是因?yàn)檠R腸中某些微生物產(chǎn)生了生物胺氧化酶，降低了生物胺含量[48]。Zhao Lili等[49]證明，在發(fā)酵和成熟過程中，F(xiàn)A可以減少熏馬肉中32.17%的組胺。薛林林等[50]報(bào)道FA分別減少了屎腸球菌和糞腸球菌中19.9%和27%的酪胺積累。第28天時，與C組相比，D組酪胺質(zhì)量濃度減少了63.27%，E組酪胺質(zhì)量濃度僅減少49.61%。這些結(jié)果表明，與FA相比，HP-β-CD/FA包合物在減少酪胺積累方面更有效。Li Lu[42]和Dias[51]等研究不同葡萄球菌和乳桿菌作為發(fā)酵劑對生物胺積累的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酪胺積累量僅減少了7.45%～29.24%。本研究中，發(fā)酵結(jié)束時B組酪胺積累量較A組減少74.34%。HP-β-CD/FA包合物抑制產(chǎn)酪胺相關(guān)基因以及tdcA和tyrP表達(dá)的細(xì)菌生長，從而減少酪胺形成。因此，添加HP-β-CD/FA包合物是抑制腐敗菌（腸桿菌科）生長和減少酪胺積累的有效途徑，有助于提高熏馬腸的安全性。

3 結(jié) 論

添加HP-β-CD/FA包合物抑制腸桿菌效果好于FA，能夠明顯降低pH值，減少酪胺含量，以及TDC基因簇的表達(dá)。在純菌體系中HP-β-CD/FA包合物對tyrS和nhaC基因表達(dá)影響不顯著，但能顯著抑制tdcA和tyrP基因的轉(zhuǎn)錄。在熏馬腸中添加HP-β-CD/FA包合物能降低pH值，減少酪胺積累，添加MIC HP-β-CD/FA包合物與空白對照組相比酪胺積累減少74.34%?？傊?，HP-β-CD/FA包合物能夠有效抑制酪胺積累和tdcA和tyrP基因表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)可為提高傳統(tǒng)新疆熏馬腸和其他發(fā)酵肉制品的安全性提供一定理論依據(jù)。