王 洋，趙瑜玲，陳孟涵，張錦錦，臧明伍，趙紫華，郝建雄，韓俊華,*

（1.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）屬于假單胞菌屬，廣泛分布于自然界中，在4 ℃條件下能快速生長繁殖，是果蔬、乳、肉等食品中一種常見的嗜冷性腐敗菌。它能夠產(chǎn)生極耐熱的蛋白酶和脂肪酶，這些酶即使在高溫下也難以滅活，在食品貯藏過程中嚴(yán)重影響食品的風(fēng)味、口感、組織狀態(tài)等，并能在食品、食品加工設(shè)備及包裝材料等表面形成生物膜，對(duì)食品持續(xù)進(jìn)行污染[1]，嚴(yán)重危害食品質(zhì)量與安全。

光動(dòng)力滅活（photodynamic inactivation，PDI）因其高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)成為食品行業(yè)的一種新型殺菌方法[2]。PDI過程是一種光物理和光化學(xué)反應(yīng)，需要氧氣、可見光和光敏劑同時(shí)存在[3]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并合成了許多新型光敏劑，包括抗菌光敏劑、抗癌光敏劑等[4]。在這些光敏劑中，姜黃素因具有成本低、安全性高、殺菌效果好等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[5-7]。姜黃素是從姜黃根莖中提取出的一種植物多酚化合物，常被用作天然色素或膳食補(bǔ)充劑[8-9]，其可在藍(lán)光（400～500 nm）下被激發(fā)而產(chǎn)生活性氧[10]。此外，姜黃素的光激發(fā)還可以產(chǎn)生姜黃素自由基，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的DNA損傷[11]。基于姜黃素光動(dòng)力作用的殺菌技術(shù)在食品貯藏和保鮮方面已顯示出巨大的應(yīng)用潛力。例如，姜黃素介導(dǎo)的PDI已成功應(yīng)用于鮮切蘋果[12]和梨[13]的保鮮。到目前為止，已有諸多研究者嘗試?yán)肞DI替代或輔助傳統(tǒng)殺菌技術(shù)[14-16]。

本實(shí)驗(yàn)探究以姜黃素為光敏劑的PDI技術(shù)對(duì)果蔬、乳品及肉品中的優(yōu)勢(shì)嗜冷菌——熒光假單胞菌的滅活效果；分析乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）對(duì)姜黃素介導(dǎo)PDI的協(xié)同增效作用；采用自行研制的小型光動(dòng)力設(shè)備進(jìn)行新鮮豬肉的PDI處理，初步分析自制設(shè)備的保鮮效果，從而為姜黃素介導(dǎo)的PDI在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用提供理論參考和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熒光假單胞菌由本課題組分離自原料乳中，現(xiàn)保藏于河北科技大學(xué)食品生物技術(shù)與食品安全實(shí)驗(yàn)室；新鮮豬肉購于石家莊市北國超市。

姜黃素（純度99%） 山東西亞化工有限公司；殼聚糖（脫乙酰度≥95%） 上海阿拉丁試劑有限公司；EDTA 天津市永大化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉、無水乙醇均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為無菌去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

YT-CJ-1N超凈工作臺(tái) 北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；SHZ-82A恒溫振蕩器 常州市國旺儀器制造有限公司；TGL-16C高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；SPX-100B-Z生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BM-103CE生物顯微鏡 廈門麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；BS600＋電子天平 上海友聲衡器有限公司；CR-400色差儀 深圳市歐亞精密儀器有限公司；pH211哈納酸度計(jì) 北京泰亞賽?？萍及l(fā)展有限公司。

實(shí)驗(yàn)用PDI裝置（裝置1）為實(shí)驗(yàn)室自制，由96 孔板、LED燈珠（3.0～3.2 V、2.0 mA、460 nm）、LED調(diào)光器等組成，光功率密度為200 mW/cm2。

小型應(yīng)用型PDI裝置（裝置2）為實(shí)驗(yàn)室自制，由箱體（40 cm×40 cm×40 cm）、LED燈條（12～24 V、460 nm）、變壓器等組成，光功率密度為100 mW/cm2。

1.3 方法

1.3.1 熒光假單胞菌的培養(yǎng)

將熒光假單胞菌（-20 ℃保存于25%（體積分?jǐn)?shù)）甘油管中）接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min搖床恒溫培養(yǎng)24 h，按照2%（體積分?jǐn)?shù)）進(jìn)行傳代，同樣條件下培養(yǎng)24 h，10 000×g離心5 min，收集菌體，用無菌生理鹽水清洗2 次并稀釋至濃度約1×108CFU/mL，備用。

1.3.2 光敏劑配制

稱取0.036 8 g姜黃素，用無水乙醇定容至100 mL，得到1 mmol/L的姜黃素母液。取0.5 g殼聚糖置于燒杯中，加入99 mL無菌去離子水，不斷攪拌，再加入1 mL冰醋酸使殼聚糖充分溶解，得到0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）的殼聚糖溶液。以此殼聚糖溶液為溶劑稀釋姜黃素母液，配制濃度分別為5、25、50、75、100 μmol/L的姜黃素溶液，并在60 ℃恒溫水浴鍋中避光孵育15～20 min，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 姜黃素聯(lián)合EDTA的PDI條件確定

1.3.3.1 姜黃素濃度

按照200 μL/孔在48 孔板中加入1.3.1節(jié)熒光假單胞菌菌懸液，然后按照100 μL/孔分別加入0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）EDTA溶液，孵育10 min（室溫，下同），再按照200 μL/孔加入不同濃度（0（對(duì)照組）、5、25、50、75、100 μmol/L）的姜黃素溶液，避光孵育10 min，隨后放入裝置1光照20 min，光照結(jié)束后，每孔取100 μL混合液涂布于LB固體培養(yǎng)基，27 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3.3.2 光照時(shí)間

按照200 μL/孔在48 孔板中加入1.3.1節(jié)熒光假單胞菌菌懸液，然后按照100 μL/孔分別加入0.5% EDTA溶液，孵育10 min后按照200 μL/孔加入75 μmol/L姜黃素溶液，避光孵育10 min，隨后放入裝置1分別光照0（對(duì)照組）、5、10、20、30、40 min，光照結(jié)束后，每孔取100 μL混合液參照1.3.3.1節(jié)方法測定菌落數(shù)。對(duì)照組不進(jìn)行光照。

1.3.3.3 EDTA質(zhì)量分?jǐn)?shù)

按照200 μL/孔在48 孔板中加入1.3.1節(jié)熒光假單胞菌菌懸液，然后按照100 μL/孔分別加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0（對(duì)照組）、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）的EDTA溶液，孵育10 min后按照200 μL/孔加入75 μmol/L的姜黃素溶液，避光孵育10 min，利用裝置1光照20 min，光照結(jié)束后，每孔取100 μL混合液參照1.3.3.1節(jié)方法測定菌落數(shù)。

1.3.4 姜黃素聯(lián)合EDTA對(duì)熒光假單胞菌生物膜的PDI作用分析

1.3.4.1 顯微鏡觀察熒光假單胞菌生物膜

按照2 mL/孔在6 孔板（放置了20 mm×20 mm的玻璃蓋玻片）中加入LB液體培養(yǎng)基，同時(shí)每孔加入200 μL 1.3.1節(jié)熒光假單胞菌菌懸液，于27 ℃下恒溫培養(yǎng)，分別在0、6、12、24、36、48、60、72 h用無菌鑷子將蓋玻片取出，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4）沖洗數(shù)次蓋玻片以除去浮游菌，然后用無水甲醇固定10 min，隨后用PBS沖洗3 次，自然干燥。在蓋玻片表面滴加1.0%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）結(jié)晶紫染液，靜置2 min，用PBS洗去多余染液，自然干燥后置于生物顯微鏡下觀察生物膜，放大倍數(shù)100 倍。

1.3.4.2 PDI處理玻璃表面熒光假單胞菌生物膜

按1.3.4.1節(jié)方法培養(yǎng)72 h后，將附著有熒光假單胞菌生物膜的蓋玻片取出，用無菌水沖洗除去表面浮游細(xì)菌后置于6 孔板中。75 μmol/L姜黃素-0.5% EDTA組加入0.5 mL 0.5% EDTA溶液，孵育10 min后加入1 mL 75 μmol/L的姜黃素溶液，避光孵育10 min；75 μmol/L姜黃素組加入0.5 mL無菌水，孵育10 min后加入1 mL 75 μmol/L的姜黃素溶液，避光孵育10 min；0.5%殼聚糖組加入0.5 mL無菌水溶液，孵育10 min后加入1 mL 0.5%殼聚糖溶液，避光孵育10 min；0.5%殼聚糖-0.5% EDTA組加入0.5 mL 0.5% EDTA溶液，孵育10 min后加入1 mL 0.5%殼聚糖溶液，避光孵育10 min；空白組加入1.5 mL無菌水，孵育10 min。將6 孔板于裝置1中光照0、20 min，然后吸取100 μL混合液參照1.3.3.1節(jié)方法測定菌落數(shù)。

1.3.4.3 PDI處理丙烯腈二乙烯丁二烯樹脂板表面熒光假單胞菌生物膜

參照1.3.4.1節(jié)生物膜的制備方法，用厚度為0.5 mm的丙烯腈二乙烯丁二烯樹脂（acrylonitrile-butadienestyrene，ABS）方格板（4 cm2）代替玻璃蓋玻片。生物膜培養(yǎng)完成后按照1.3.4.2節(jié)方法進(jìn)行分組和處理，測定處理后的菌落數(shù)。

1.3.5 新鮮豬肉PDI處理效果分析

1.3.5.1 新鮮豬肉的PDI處理

將新鮮豬肉用無菌水清洗后用吸水紙將豬肉表面水分吸干，在超凈臺(tái)中將其切分成豬肉片（4.0 cm×4.0 cm×0.5 cm），采用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液浸泡5 min，進(jìn)行表面殺菌，用無菌水沖洗3 次，置于超凈臺(tái)中風(fēng)干5 min。吸取100 μL熒光假單胞菌菌懸液（取1.3.1節(jié)熒光假單胞菌菌懸液調(diào)整濃度約6.0×107CFU/mL）均勻涂抹在豬肉片表面，靜置30 min，使熒光假單胞菌充分黏附。空白組、殼聚糖對(duì)照組、PDI組分別在豬肉片表面均勻噴灑0.5 mL無菌水，PDI＋EDTA組噴灑0.5 mL 0.5% EDTA，孵育10 min；然后空白組噴灑1.0 mL無菌水，殼聚糖對(duì)照組噴灑1.0 mL 0.5%殼聚糖溶液，PDI＋EDTA組和PDI組分別噴灑1.0 mL 75 μmol/L姜黃素，避光孵育10 min后，將PDI＋EDTA組和PDI組樣品置于裝置2中光照處理20 min。處理完成后，各組樣品于4 ℃下貯藏。

1.3.5.2 豬肉熒光假單胞菌菌落數(shù)的測定

取貯藏第0、1、3、7、10天的豬肉，參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》測定豬肉表面熒光假單胞菌菌落數(shù)。

1.3.5.3 豬肉質(zhì)量損失率的測定

在處理前用電子天平稱量樣品質(zhì)量m0/g，PDI處理后，用吸水紙將各組樣品表面的水吸干，稱量貯藏0、3、6、9 d后的樣品質(zhì)量m1/g，精確至0.01 g，按式（1）計(jì)算質(zhì)量損失率。

1.3.5.4 姜黃素溶液和豬肉色澤的測定

在24 孔板各孔中加入1 mL濃度分別為5、25、50、75、100 μmol/L的姜黃素溶液，在裝置1中照射20 min，同時(shí)設(shè)置未光照組，對(duì)光照前后姜黃素溶液的顏色變化進(jìn)行拍照觀察。

參照1.3.5.1節(jié)方法切分豬肉，立即測定樣品的亮度（L*值）、紅綠度（a*值）、黃藍(lán)度（b*值），在豬肉片（4.0 cm×4.0 cm×0.5 cm）表面噴灑0.5 mL 0.5% EDTA，孵育10 min，然后分別噴灑1.0 mL不同濃度（5、50、75 μmol/L）姜黃素溶液，對(duì)照組噴灑等體積無菌水，避光孵育10 min后，立即將樣品置于裝置2中光照處理20 min。處理完成后，各組樣品于4 ℃下貯藏。

取光照處理后貯藏第0、3、6、9、12天的豬肉，采用色差儀分別測定各處理樣品的L*、a*、b*值，并按式（2）計(jì)算色差（ΔE）。

式中：L*、a*、b*值分別表示樣品貯藏一定時(shí)間的亮度、紅綠度、黃藍(lán)度；值分別表示樣品在第0天光照處理前的亮度、紅綠度、黃藍(lán)度。

1.3.5.5 豬肉pH值的測定

取1.3.5.1節(jié)貯藏第0、2、4、6、10天的豬肉，根據(jù)GB 5009.237—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品pH值的測定》測定豬肉的pH值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)中每組樣品設(shè)置3 個(gè)平行，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS Statistics 24.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan’s多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。采用OriginPro 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PDI對(duì)熒光假單胞菌的滅活作用

2.1.1 姜黃素濃度對(duì)PDI作用的影響

姜黃素濃度對(duì)熒光假單胞菌的PDI作用的影響如圖1所示。隨著姜黃素濃度的增加，熒光假單胞菌的菌落數(shù)明顯降低。當(dāng)姜黃素濃度為5 μmol/L時(shí)，與對(duì)照組相比，熒光假單胞菌菌落數(shù)對(duì)數(shù)值減小1.84（lg（CFU/mL））（P＜0.05）；隨著姜黃素濃度的增大，對(duì)熒光假單胞菌的PDI效果也隨之增強(qiáng)，當(dāng)姜黃素濃度增加至75 μmol/L時(shí)，PDI效果達(dá)到最大，熒光假單胞菌菌落數(shù)對(duì)數(shù)值減小7.46（lg（CFU/mL）），滅活效果顯著強(qiáng)于其他組（P＜0.05）。姜黃素濃度為100 μmol/L時(shí)，對(duì)熒光假單胞菌的滅活效果不再增強(qiáng)，反而略有降低。推測原因可能是，姜黃素濃度過高時(shí)，藍(lán)光的照射劑量有限，部分姜黃素未能吸收藍(lán)光而不能發(fā)生光敏化，從而影響PDI效果；也可能是姜黃素濃度增加到一定程度時(shí)，會(huì)在熒光假單胞菌細(xì)胞內(nèi)外形成動(dòng)態(tài)平衡，阻礙姜黃素進(jìn)一步進(jìn)入細(xì)胞，從而降低PDI效果[17]。于金珅[18]在研究姜黃素濃度對(duì)鮮切馬鈴薯表面大腸桿菌PDI效果的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在姜黃素濃度為30 μmol/L時(shí)，對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出最佳殺菌效果，進(jìn)一步提高姜黃素濃度，殺菌效果反而下降，本研究結(jié)果與之相似。綜上，選擇75 μmol/L的姜黃素溶液進(jìn)行后續(xù)PDI處理。

圖1 姜黃素濃度對(duì)熒光假單胞菌菌落數(shù)的影響Fig. 1 Effect of curcumin concentration on total count of P. fluorescens

2.1.2 光照時(shí)間對(duì)PDI作用的影響

光照時(shí)間對(duì)熒光假單胞菌的PDI作用的影響如圖2所示。光照時(shí)間對(duì)熒光假單胞菌的PDI效果影響顯著，且呈現(xiàn)出隨光照時(shí)間延長先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)。光照時(shí)間為20 min時(shí)，光動(dòng)力殺菌效果達(dá)到最佳，選擇此條件進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與對(duì)照組相比，熒光假單胞菌菌落數(shù)對(duì)數(shù)值顯著減小6.40（lg（CFU/mL））（P＜0.05）。隨著光照時(shí)間的繼續(xù)延長，滅活效果反而減弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，并非光照時(shí)間越長殺菌效果越好，這可能是光照時(shí)間過長導(dǎo)致周圍環(huán)境的溫度升高，更有利于熒光假單胞菌的生長繁殖[19]。因此，PDI技術(shù)在進(jìn)行工業(yè)化應(yīng)用時(shí)，應(yīng)在保證殺菌效果的同時(shí)，盡量縮短光照時(shí)間，力求在符合生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)的前提下滿足殺菌要求，提高生產(chǎn)效率。綜上，選擇光照20 min進(jìn)行后續(xù)PDI處理。

圖2 光照時(shí)間對(duì)熒光假單胞菌菌落數(shù)的影響Fig. 2 Effect of illumination time on total count of P. fluorescens

2.1.3 EDTA質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)PDI作用的影響

革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外層含有脂多糖層，相對(duì)于革蘭氏陽性菌更能耐受PDI處理[5]。EDTA作為一種金屬螯合劑能夠螯合革蘭氏陰性菌表面穩(wěn)定生物膜基質(zhì)所需的二價(jià)金屬離子[20]，會(huì)破壞革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜[21]。已有報(bào)道稱EDTA可以增加非陽離子光敏劑對(duì)革蘭氏陰性菌的PDI效果[22]。如Hu Jiamiao等[23]發(fā)現(xiàn)EDTA可以促進(jìn)對(duì)洋蔥伯克霍爾德菌的PDI作用。因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析EDTA作為協(xié)同劑對(duì)革蘭氏陰性菌——熒光假單胞菌PDI作用的促進(jìn)效果。

如圖3所示，EDTA對(duì)PDI的協(xié)同增效作用隨著其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，當(dāng)EDTA質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.3%時(shí)，熒光假單胞菌菌落數(shù)對(duì)數(shù)值分別顯著降低了0.37、0.91（lg（CFU/mL））（P＜0.05）；當(dāng)EDTA質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至0.5%時(shí)，PDI協(xié)同促進(jìn)效果最佳，熒光假單胞菌菌落數(shù)對(duì)數(shù)值顯著下降2.29（lg（CFU/mL））（P＜0.05）；之后隨著EDTA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，其對(duì)PDI的協(xié)同效果反而逐漸減弱。這很可能是由于EDTA質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高，與姜黃素的稀釋劑-殼聚糖發(fā)生酸堿反應(yīng)，間接影響姜黃素的結(jié)構(gòu)，從而降低了其光敏性?？梢?，EDTA對(duì)姜黃素介導(dǎo)的PDI作用確實(shí)表現(xiàn)出對(duì)熒光假單胞菌的顯著的協(xié)同促進(jìn)效果，很可能是通過破壞細(xì)菌細(xì)胞外膜的穩(wěn)定性，增強(qiáng)了光敏劑向胞內(nèi)的滲透。這對(duì)于后續(xù)優(yōu)化EDTA的PDI協(xié)同劑量具有一定的參考價(jià)值。綜上，選擇0.5% EDTA溶液進(jìn)行后續(xù)PDI處理。

圖3 EDTA質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)熒光假單胞菌菌落數(shù)的影響Fig. 3 Effect of EDTA concentration on total count of P. fluorescens

2.2 熒光假單胞菌生物膜的形成

了解生物膜的形成過程，有助于早期對(duì)食品表面及食品加工設(shè)備表面生物膜形成的不同階段進(jìn)行干預(yù)，為生物膜的去除提供有價(jià)值的參考。采用結(jié)晶紫染色法觀察熒光假單胞菌在玻璃表面形成生物膜的過程。圖4A～H分別為培養(yǎng)0、6、12、24、36、48、60、72 h后的熒光假單胞菌生物膜經(jīng)結(jié)晶紫染色后的顯微圖片。圖4A無生物膜形成；圖4B、C的熒光假單胞菌稀疏分散，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌體分布逐漸密集；圖4D的菌體數(shù)量明顯增多，菌體之間相互聚集；培養(yǎng)至60 h時(shí)，生物膜已經(jīng)相對(duì)成熟，菌體之間更加密集（圖4G）；培養(yǎng)至72 h，熒光假單胞菌已經(jīng)將蓋玻片完全覆蓋（圖4H）?？梢姡瑹晒饧賳伟鷱拈_始的游離狀態(tài)到形成致密的生物膜是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程。綜上，選擇培養(yǎng)72 h后形成的熒光假單胞菌生物膜用于后續(xù)PDI處理效果研究。

圖4 熒光假單胞菌生物膜的形成Fig. 4 Formation process of P. fluorescens biofilm

2.3 姜黃素介導(dǎo)的PDI對(duì)熒光假單胞菌生物膜的破壞效果

2.3.1 對(duì)玻璃表面熒光假單胞菌生物膜的破壞效果

隨著冰箱、冷柜等冷藏設(shè)備的普及，冷藏和冷凍食品在日常飲食中所占比例逐漸增加。熒光假單胞菌為一種優(yōu)勢(shì)嗜冷菌，常常黏附在冰箱、冷柜內(nèi)部，逐漸形成生物膜，進(jìn)而污染食品，導(dǎo)致食物發(fā)生腐敗[24]。本實(shí)驗(yàn)采用冰箱、冷柜內(nèi)部玻璃板作為載體，在其表面培養(yǎng)并形成熒光假單胞菌生物膜，研究姜黃素介導(dǎo)的PDI對(duì)其表面形成生物膜的破壞作用。姜黃素介導(dǎo)的PDI對(duì)玻璃表面熒光假單胞菌生物膜的破壞效果如表1所示。與空白組相比，光照條件下的姜黃素對(duì)熒光假單胞菌生物膜有顯著的破壞效果，菌落數(shù)對(duì)數(shù)值減小3.44（lg（CFU/mL）），加入EDTA后菌落數(shù)對(duì)數(shù)值減小4.57（lg（CFU/mL）），EDTA顯著提高了姜黃素的PDI作用（P＜0.05）。而無光照條件下的姜黃素對(duì)熒光假單胞菌生物膜的破壞作用有限，加入EDTA溶液后，滅活效果仍未得到改善。姜黃素處理浮游熒光假單胞菌的PDI作用可使菌落數(shù)對(duì)數(shù)值減小7.00（lg（CFU/mL））以上（2.1.1節(jié)結(jié)果），明顯優(yōu)于對(duì)生物膜中細(xì)菌的PDI效果，這是由于細(xì)菌生物膜具有特殊的結(jié)構(gòu)。致密的生物膜中包含大量的胞外多糖保護(hù)層，較浮游細(xì)菌具有更強(qiáng)的抵抗化學(xué)和熱滅活能力[25]。

表1 PDI處理對(duì)玻璃表面生物膜的破壞效果Table 1 Destructive effect of PDI on P. fluorescens biofilm formed on glass

2.3.2 對(duì)ABS板表面熒光假單胞菌生物膜的破壞效果

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用冰箱、冷柜等內(nèi)部材質(zhì)ABS板作為載體，在其表面培養(yǎng)并形成熒光假單胞菌生物膜，研究姜黃素介導(dǎo)的PDI對(duì)其表面形成生物膜的破壞效果。由表2可知，姜黃素介導(dǎo)的PDI處理使其表面生物膜菌落數(shù)對(duì)數(shù)值下降4.42（lg（CFU/mL））；加入0.5% EDTA溶液后，菌落數(shù)對(duì)數(shù)值減小約6.60（lg（CFU/mL）），顯著提高了PDI效果（P＜0.05）。

表2 PDI處理對(duì)ABS板表面生物膜的破壞效果Table 2 Destructive effect of PDI treatment on biofilm formed on ABS plates

單一及混合生物膜的形成會(huì)加速食品的腐敗，引起食品安全問題，甚至造成食品加工設(shè)備的損壞。對(duì)食品表面、食品包裝材料表面及食品加工設(shè)備表面微生物生物膜的去除，是食品領(lǐng)域有待解決的一項(xiàng)難題。Cai Zhiyu等[26]研究報(bào)道，抗菌劑聯(lián)合PDI處理能顯著降低鈦表面金黃色葡萄球菌生物膜中的微生物數(shù)量。本課題組前期研究[27]報(bào)道了以姜黃素作為光敏劑的PDI處理可以有效滅活玻璃和不銹鋼表面金黃色葡萄球菌生物膜中的微生物。檀利軍等[28]也報(bào)道了姜黃素介導(dǎo)的光動(dòng)力技術(shù)對(duì)副溶血性弧菌、腐敗希瓦氏菌生物被膜的清除效果。可見，姜黃素及聯(lián)合EDTA等協(xié)同劑的PDI處理可為傳統(tǒng)殺菌技術(shù)提供有效的補(bǔ)充，為去除微生物生物膜提供一種新型、經(jīng)濟(jì)有效的方法。

2.4 PDI處理對(duì)新鮮豬肉的保鮮效果

2.4.1 熒光假單胞菌菌落數(shù)變化

不同豬肉4 ℃貯藏期間熒光假單胞菌的菌落數(shù)變化如圖5所示。貯藏0 d，與空白組相比，PDI處理豬肉表面熒光假單胞菌菌落數(shù)對(duì)數(shù)值減小了2.68（lg（CFU/g）），添加0.5% EDTA后，豬肉表面菌落數(shù)對(duì)數(shù)值減少3.23（lg（CFU/g）），表明PDI處理對(duì)新鮮豬肉表面的熒光假單胞菌具有良好的滅活效果，而且EDTA能夠進(jìn)一步提高其滅活效果。隨貯藏時(shí)間的延長，空白組豬肉表面的熒光假單胞菌快速生長，第3天時(shí)菌落數(shù)增長至7.90（lg（CFU/g）），而經(jīng)PDI處理后的豬肉中熒光假單胞菌生長緩慢，第3天時(shí)PDI組的菌落數(shù)為5.00（lg（CFU/g）），顯著低于空白組（P＜0.05）；第10天時(shí)，空白組豬肉的熒光假單胞菌菌落數(shù)增長至8.99（lg（CFU/g）），而PDI組的菌落數(shù)為6.57（lg（CFU/g）），PDI＋EDTA組豬肉中熒光假單胞菌菌落數(shù)僅為5.94（lg（CFU/g）），顯著低于其他處理組（P＜0.05），表明PDI＋EDTA處理對(duì)新鮮豬肉表面的熒光假單胞菌具有更好的抑菌效果。

圖5 貯藏期間豬肉表面熒光假單胞菌菌落數(shù)的變化Fig. 5 Changes in P. fluorescens count on pork during storage

本課題組前期研制了姜黃素/殼聚糖/γ-聚谷氨酸可食性復(fù)合膜，并評(píng)價(jià)了該可食性膜對(duì)培根和火腿的光動(dòng)力保鮮效果，該膜具備優(yōu)良的物理特性和一定的機(jī)械強(qiáng)度，經(jīng)PDI處理后對(duì)培根和火腿表面微生物起到顯著的抑制作用，且提升了產(chǎn)品的感官品質(zhì)[29]。因此，在后續(xù)的研究中可以結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，進(jìn)一步優(yōu)化光動(dòng)力殺菌條件，提高殺菌效果，同時(shí)開發(fā)更好的涂膜或包裝材料用于食品表面殺菌或保鮮。

2.4.2 質(zhì)量損失率的變化

如圖6所示，在經(jīng)過PDI處理后的當(dāng)天，PDI組質(zhì)量損失率最大，為2.14%；PDI＋EDTA組的質(zhì)量損失率為1.79%。殼聚糖對(duì)照組及PDI組豬肉的質(zhì)量損失率隨著貯藏時(shí)間的延長逐漸增大。豬肉經(jīng)一定時(shí)間的光照處理后，表面溫度出現(xiàn)短暫、輕微的升高，這可能與豬肉質(zhì)量損失有一定的關(guān)系。這也提示本實(shí)驗(yàn)所用PDI處理設(shè)備需要增加冷卻裝置或提高光照強(qiáng)度以縮短光照時(shí)間?？傊?，解決光照引起的升溫及設(shè)備內(nèi)部散熱差的問題，對(duì)于PDI技術(shù)及設(shè)備的應(yīng)用是非常必要的。

圖6 貯藏期間豬肉的質(zhì)量損失率Fig. 6 Mass loss percentage of pork during storage

2.4.3 色澤的變化

姜黃素是一種天然的黃色色素，由于其著色力強(qiáng)，具有一經(jīng)著色就不易褪去等特點(diǎn)，在一定程度上限制了其在各個(gè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用[30]。而通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，姜黃素經(jīng)藍(lán)色LED燈照射一段時(shí)間后，其顏色變淺，這一發(fā)現(xiàn)有助于拓展姜黃素在食品殺菌領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。光照處理前后不同濃度的姜黃素溶液顏色如圖7A所示，光照20 min后，不同濃度的姜黃素溶液顏色均較光照前明顯變淺。王雪梅等[31]研究發(fā)現(xiàn)，乙醇溶液中的姜黃素在光照后會(huì)分解產(chǎn)生香草醛和阿魏酸，導(dǎo)致姜黃素溶液顏色變淺。

為了進(jìn)一步探明不同濃度姜黃素在豬肉上的使用效果，采用色差儀分別測定不同濃度姜黃素PDI處理后豬肉的色澤，并計(jì)算ΔE，結(jié)果如圖7B所示，新鮮豬肉的ΔE與姜黃素濃度總體呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。75 μmol/L的姜黃素溶液處理豬肉經(jīng)光照后，第0天ΔE為3.03，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），但感官上可以接受。姜黃素濃度越大，ΔE越大。同時(shí)，隨著新鮮豬肉貯藏時(shí)間的延長，ΔE沒有呈現(xiàn)出明顯的變化規(guī)律，且同一濃度姜黃素處理的豬肉無顯著性差異（P＞0.05）。

圖7 姜黃素溶液（A）和豬肉（B）色澤的變化Fig. 7 Color changes of curcumin solution (A) and changes in ΔE of pork (B)

2.4.4 pH值的變化

pH值是反映肉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。如圖8所示，隨著貯藏時(shí)間的延長，各處理組豬肉的pH值逐漸升高，這主要是由于豬肉中細(xì)菌數(shù)量的增加其蛋白質(zhì)和氨基酸發(fā)生降解，形成氨和胺類等堿性物質(zhì)[32]。在10 d的貯藏期內(nèi)，PDI＋EDTA組豬肉pH值從5.87增加至6.17，與空白組及其他處理組相比，pH值增加相對(duì)平緩。由此可以看出，PDI＋EDTA作用能夠減緩豬肉在貯藏過程中的腐敗速率，更好地保持豬肉的新鮮程度。

圖8 貯藏期間豬肉pH值的變化Fig. 8 Changes in pH of fresh pork during storage

3 結(jié) 論

本研究結(jié)合光敏劑姜黃素濃度、光照時(shí)間、協(xié)同劑EDTA，優(yōu)化了對(duì)熒光假單胞菌PDI作用的最佳條件，明確了姜黃素協(xié)同EDTA的PDI作用對(duì)熒光假單胞菌生物膜的去除效果。應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室自行研制的光動(dòng)力殺菌裝置，嘗試分析EDTA聯(lián)合姜黃素的PDI作用對(duì)新鮮豬肉的保鮮效果。結(jié)果表明，姜黃素聯(lián)合EDTA的PDI作用對(duì)優(yōu)勢(shì)嗜冷性腐敗菌-熒光假單胞菌及其生物膜均具有良好的滅活效果，并能顯著抑制新鮮豬肉表面的熒光假單胞菌，改善豬肉感官品質(zhì)，延長豬肉的保鮮期。

PDI作為一種新型的非熱殺菌技術(shù)在食品領(lǐng)域逐漸顯示出巨大的應(yīng)用潛力。但該技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中還存在一定的局限性，結(jié)合他人研究以及本實(shí)驗(yàn)室開展的工作，認(rèn)為后續(xù)研究可集中在以下方面進(jìn)行：1）可以結(jié)合光動(dòng)力協(xié)同劑、成膜劑等，研發(fā)可用于食品包裝、食品表面涂膜、加工設(shè)備殺菌的新型光動(dòng)力殺菌材料，以提高殺菌效率和安全性；2）光動(dòng)力殺菌設(shè)備的研發(fā)和優(yōu)化，包括選擇合適的光源、光強(qiáng)度，并考慮溫度控制、對(duì)不同樣品的適應(yīng)性等，以擴(kuò)大光動(dòng)力殺菌技術(shù)的應(yīng)用范圍，實(shí)現(xiàn)可操作性；3）探討光動(dòng)力殺菌與熱殺菌、化學(xué)殺菌等傳統(tǒng)殺菌技術(shù)的結(jié)合，嘗試將其運(yùn)用在實(shí)際生產(chǎn)中，彌補(bǔ)傳統(tǒng)殺菌的缺陷和不足，以充分發(fā)揮光動(dòng)力殺菌技術(shù)的優(yōu)勢(shì)。