田雅寧，陳遠哲，王巧華,2,3,*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學工學院，湖北 武漢 430070；2.國家蛋品加工技術研發(fā)分中心，湖北 武漢 430070；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江中下游農(nóng)業(yè)裝備重點實驗室，湖北 武漢 430070）

皮蛋又名松花蛋、變蛋，是我國特有的傳統(tǒng)風味禽蛋制品[1]，含有豐富的營養(yǎng)成分，具有清熱去火，止咳潤肺等功效[2-4]，深受消費者喜愛[5]。傳統(tǒng)的清料皮蛋是利用堿液、銅鹽及紅茶等原料復配成腌制液浸泡鴨蛋進行腌制[6-7]，從而使鴨蛋形成獨特的松花、顏色及彈性凝膠[8]。皮蛋凝膠是判斷其腌制品質的重要指標[9]。

蛋殼作為皮蛋腌制液與蛋內部環(huán)境物質交換的第一道屏障，是皮蛋腌制的重要介質。蛋殼內部的蛋殼膜分為內膜及外膜，兩種蛋殼膜內部均呈現(xiàn)為一種由角蛋白和少量黏蛋白纖維交織構成的網(wǎng)狀結構，有利于皮蛋凝膠貼壁生長。同時，蛋殼膜作為一種半透性親水生物活性膜，具有良好的透氣性，交織的纖維莖稈形成的孔隙可作為有效的皮蛋腌制液滲透通道[10-13]。Wang Yuting等[14]發(fā)現(xiàn)皮蛋內部的水分會透過蛋殼流失到殼外，并出現(xiàn)蛋白質類物質降解、游離氨基酸含量緩慢增加的現(xiàn)象，同時，產(chǎn)生揮發(fā)性堿性含氮物質，導致pH值降低。

蛋品的新鮮度是衡量蛋內部品質的核心指標，不同新鮮度鴨蛋內部所含的營養(yǎng)物質及理化指標具有一定差異[15]。隨著貯藏時間的延長，原料蛋的新鮮度降低，鴨蛋蛋清中蛋白質含量及結構功能也產(chǎn)生變化，且蛋白質變性過程是皮蛋凝膠形成的關鍵反應。研究表明當?shù)扒宄两趶妷A環(huán)境中時，卵清蛋白（蛋清中的主要蛋白質）的二級和三級結構被破壞，從而導致解折疊[13]。隨后，這些蛋白質鏈逐漸形成聚集體，最終形成穩(wěn)定的蛋清凝膠網(wǎng)絡[16-17]。因此，原料蛋新鮮度的變化會對皮蛋的凝膠形成過程產(chǎn)生影響。

以往對皮蛋的研究多是針對皮蛋的無損檢測方法或是加工過程中皮蛋凝膠變化情況[18-20]，但有關原料蛋新鮮度對蛋殼、膜的超微結構的影響，以及蛋殼及蛋殼膜與腌制期間皮蛋品質變化的關聯(lián)等問題鮮見報道。因此，本研究以不同新鮮度的鴨蛋作為原料蛋進行腌制，通過掃描電子顯微鏡獲取腌制過程中蛋殼內膜、外膜及蛋殼斷面的圖像，經(jīng)過處理分析獲取各項圖像系數(shù)，結合皮蛋在腌制期間凝膠品質指標的變化規(guī)律來探尋原料蛋新鮮度與腌制期間皮蛋的凝膠品質、蛋殼及殼膜的變化趨勢及相關關系，以期為后續(xù)皮蛋腌制過程的品質控制與檢測提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮青殼鴨蛋 河南特產(chǎn)館。乙醇（95%（體積分數(shù)，下同））（分析純）、氫氧化鈉（質量分數(shù)95%）（分析純）、硫酸銅（食品級） 國藥集團化學試劑有限公司；紅茶 福建省合盛康生物科技有限公司；食鹽中鹽上海市鹽業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設備

TMS-PRO質構儀 美國Food Technology Corporation公司；JFC-1600離子濺射裝置、JSM-6390 LV掃描電子顯微鏡 日本Nissan Technical Center公司；JY3002電子天平 上海精密科學儀器有限公司；EA-01蛋品質分析儀 以色列奧卡食品科技有限公司；電子游標卡尺 上海美耐特實業(yè)有限公司；JYD-400拍擊式均質器 上海之信儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 皮蛋的腌制

根據(jù)體系質量以氫氧化鈉4.5%、硫酸銅0.4%、食鹽4%、紅茶3%和水88.1%的比例腌制皮蛋[21]。

將同一批次的540 枚新鮮鴨蛋分為3 組，每組各180 枚，分別在室溫下貯藏0、16、32 d，原料蛋根據(jù)貯藏時間不同，以新鮮度差異分為A、B、C 3 組，分別放入3 個腌制箱中進行腌制。另選取50 枚大小、形態(tài)相近的鴨蛋為對照組，不腌制，測定其新鮮度及超微結構。實驗為期40 d，其中0～33 d為腌制期，34～40 d為貯藏期，在開始腌制的第33天將皮蛋從腌制液中取出，擦除表面殘留腌制液后在室溫下貯藏，因皮蛋凝膠自腌制第8天開始形成[22]，故以第0、8、13、16、19、22、25、40天為取樣日期[20]，每次取20 枚測定各指標。其中，第0天測定各批次原料蛋的新鮮度及蛋殼、膜超微結構，自第8天起增加測定凝膠pH值、含水率及質構參數(shù)。根據(jù)皮蛋的成品數(shù)量與皮蛋總數(shù)的比值計算皮蛋成品率。

1.3.2 皮蛋內容物理化指標測定

含水率的測定參考陳遠哲等[23]的方法。用電子天平稱取皮蛋蛋白凝膠與蛋黃各10 g切碎，選用潔凈、干燥的金屬鋁盒稱質量記為m3/g，將樣本放入鋁盒后稱質量記為m1/g，置于105 ℃電熱鼓風烘干箱內烘干后樣本與鋁盒稱質量記為m2/g，皮蛋樣本的含水率按公式（1）計算。

pH值的測定參考GB/T 5009.47—2003《食品安全國家標準 蛋與蛋制品衛(wèi)生標準的分析方法》。將皮蛋凝膠與蛋黃分離，按m（皮蛋凝膠）∶V（水）＝2∶1的比例加蒸餾水稀釋，搗成勻漿，稱取15.00 g勻漿，加水攪勻，稀釋至150 mL，用雙層紗布過濾，量取50 mL勻漿測其pH值。

1.3.3 皮蛋質構參數(shù)測定

將皮蛋樣本的凝膠部分剝落，切割成1 cm×1 cm×1 cm的正方體，利用質構儀進行質地剖面分析，測定條件：測試前速率1 mm/s、測試速率1 mm/s、測試后速率1 mm/s、壓縮程度60%、間隔5 s，平行測定20 次。

1.3.4 原料蛋新鮮度的測定方法

應用蛋品質分析儀測定原料蛋的哈夫單位，計算方法如公式（2）所示。

式中：h為蛋清高度/mm；m為鴨蛋質量/g。

利用電子游標卡尺測量蛋黃高度及蛋黃直徑，平行測量3 次，取平均值，蛋黃指數(shù)計算如公式（3）所示。

式中：H為蛋黃高度/mm；φ為蛋黃直徑/mm。

1.3.5 蛋殼膜品質測定

將蛋殼內膜、外膜從鈍端氣室處剝離，用乙醇溶液浸泡清洗并晾至干燥狀態(tài)[24]。將制備好的樣品裁剪至4 mm×4 mm大小，分別將蛋殼膜樣本的內膜內表面、內膜外表面、外膜內表面、外膜外表面順序粘貼至樣品臺。在掃描電子顯微鏡下觀察，蛋殼膜表面的放大倍數(shù)為2 000，并將不同放大倍數(shù)下獲取的超微結構圖像保存。

1.3.6 孔隙度的計算

選取蛋殼內膜與外膜放大2 000 倍的掃描電子顯微鏡圖像，利用Image J軟件計算出蛋殼膜纖維莖桿的孔隙度，如公式（4）所示。

式中：s為空隙面積；S為圖像總面積。

1.3.7 皮蛋內部菌落總數(shù)測定方法

根據(jù)GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》的方法對樣品皮蛋中菌落總數(shù)的含量進行測定。將皮蛋表面清洗干凈，稱取25 g皮蛋樣品置于裝有225 mL生理鹽水的無菌均質袋內，用拍擊式均質器拍打2 min，制成質量分數(shù)10%的皮蛋勻液。吸取1 mL勻液于無菌培養(yǎng)皿內，每個濃度做兩次重復，倒入適量瓊脂并轉動平皿使其混合均勻，待瓊脂凝固后，將平板翻轉，置于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后計數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)用平均值±標準偏差表示，使用Duncan多重比較法進行顯著性分析，使用Pearson相關性分析法對數(shù)據(jù)進行相關性分析。應用Image J軟件對蛋殼及殼膜的超微結構圖像進行圖像處理及分析，獲取3 批次樣品的超微結構數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 原料蛋新鮮度對腌制期間皮蛋內容物理化指標的影響

2.1.1 原料蛋新鮮度對腌制期間皮蛋含水率的影響

如圖1所示，3 組皮蛋在腌制前16 d含水率呈劇烈下降的趨勢，且同時期含水率均為A組＜B組＜C組，C組與A、B兩組之間存在顯著差異（P＜0.05），原因可能是蛋殼膜孔隙度隨原料蛋新鮮度的降低而升高，因此腌制液更易滲透入皮蛋內使C組皮蛋含水率較高。在腌制第16天時，3 組皮蛋的含水率之間無顯著差異（P＞0.05），自第16天后，3 組皮蛋的含水率均呈現(xiàn)降低趨勢，原料蛋新鮮度與含水率呈正相關關系。第40天時，A組與B、C組之間具有顯著性差異（P＜0.05），B組與C組無顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 不同新鮮度原料蛋在皮蛋腌制期間含水率的變化Fig. 1 Changes in moisture content of raw eggs with different freshness during preserved egg pickling

2.1.2 原料蛋新鮮度對腌制期間皮蛋pH值的影響

如圖2所示，原料蛋的pH值隨新鮮度的降低而略有上升，其主要原因是二氧化碳從蛋殼上的氣孔溢出，而溢出的二氧化碳呈酸性，隨著貯存時間的延長，二氧化碳含量逐漸減少，使得pH值呈上升趨勢。在腌制過程中A組與C組之間除第8、13天外均具有顯著性差異（P＜0.05），隨著腌制時間的延長，3 組皮蛋凝膠的pH值均呈現(xiàn)總體下降的趨勢，第16天時呈現(xiàn)首個最低點，且A組與B、C組存在顯著性差異（P＜0.05）。第19天時凝膠的pH值升高，且原料蛋新鮮度越高，凝膠pH值的回升幅度越大。第40天，A組與B、C兩組之間具有顯著性差異（P＜0.05），B組與C組之間無顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 不同新鮮度原料蛋在皮蛋腌制期間凝膠pH值的變化Fig. 2 Changes in gel pH of raw eggs with different freshness during preserved egg pickling

2.2 原料蛋新鮮度對腌制期間皮蛋凝膠質構特性的影響

皮蛋的質構特性主要與凝膠形成程度以及蛋白質結構有關，腌制過程中腌制液滲透入蛋內與內容物相互作用使蛋白質變性，從而引起凝膠質構特性的變化。原料蛋新鮮度與腌制期間皮蛋凝膠品質密切相關，由圖3可知，皮蛋在腌制過程中凝膠硬度、彈性均呈現(xiàn)出波動上升的趨勢。腌制前19 d，3 種新鮮度皮蛋的凝膠硬度無顯著性差異（P＞0.05），自第22天起，A組與C組的硬度之間具有顯著性差異（P＜0.05），B組與另兩組之間差異不顯著（P＞0.05）。腌制進行到第40天，3 組皮蛋凝膠的硬度均達到峰值，此時皮蛋凝膠硬度隨原料蛋新鮮度的降低而升高，C組凝膠硬度為3 組中最大（9.43 N），A組的凝膠硬度最?。?.00 N）。同時，由圖3B可知，腌制過程中除16～22 d外，A、C兩組原料蛋凝膠彈性之間均具有顯著性差異（P＜0.05）。

圖3 不同新鮮度原料蛋在皮蛋腌制過程中凝膠的質構特性變化Fig. 3 Trend of gel texture characteristics of raw eggs with different freshness during the pickling process of preserved eggs

2.3 原料蛋新鮮度分析結果

由表1可知，A組新鮮原料蛋與B組次新鮮原料蛋之間哈夫單位差異不顯著（P＞0.05），與C組不新鮮原料蛋之間哈夫單位存在顯著差異（P＜0.05），B組與C組原料蛋的哈夫單位差異不顯著（P＞0.05）。同時，A組的蛋黃指數(shù)與另兩組之間具有顯著性差異（P＜0.05），B組與C組的蛋黃指數(shù)之間無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 原料蛋新鮮度的哈夫單位和蛋黃指數(shù)Table 1 Haugh unit and egg yolk index for raw egg freshness

2.4 蛋殼內外膜品質變化

不同新鮮度原料蛋在腌制第0天時，蛋殼膜內膜纖維莖稈交織的致密程度隨新鮮度降低逐漸下降，孔隙度上升，其中A組的纖維交疊最緊密（圖4A），C組第0天時每一層莖桿纖維的數(shù)量略有減少，可觀察到莖桿間有孔洞出現(xiàn)（圖4C2）。

圖4 不同新鮮度原料蛋在腌制第0、40天蛋殼膜內膜微觀結構比較（2 000×）Fig. 4 Comparison of inner eggshell membrane of raw eggs with different freshness on the 0th and 40th days of curing (2 000 ×)

對同批次腌制前后的皮蛋進行對比發(fā)現(xiàn)，由于腌制液中堿液及金屬離子的不斷滲透腐蝕作用，重疊的纖維莖桿層數(shù)逐漸減少，交織的致密程度下降，可觀察到明顯的孔隙（圖4），腌制第40天時蛋殼膜內膜孔隙度顯著增大。

由圖5可見，蛋殼外膜相比于內膜的纖維莖稈直徑略顯增大。不同于蛋殼內膜與皮蛋內容物直接相連[25]，內膜的纖維莖稈上存在被腐蝕的蛋白顆粒，蛋殼外膜的莖稈分布更為清晰，且原料蛋新鮮度越低，其外膜的纖維直徑越大，纖維之間的孔徑也隨之升高。同時，蛋殼外膜莖稈較粗，交織的致密性更低。隨著腌制過程的進行，腌制40 d時蛋殼膜外膜在腌制液的腐蝕作用下孔隙度有所上升，其中C組外膜內側孔隙度最大。

圖5 不同新鮮度原料蛋在腌制第0、40天蛋殼膜外膜微觀結構比較（2 000×）Fig. 5 Comparison of outer eggshell membrane of raw eggs with different freshness on the 0th and 40th days of curing (2 000 ×)

2.5 原料蛋新鮮度對腌制期間皮蛋蛋殼膜孔隙度的影響

蛋殼膜是由蛋白纖維莖稈交織而成的多孔網(wǎng)狀結構[26]，隨著莖稈的粗細、交織的致密程度與纖維層數(shù)的變化而具有不同形態(tài)。蛋殼膜作為皮蛋內容物與皮蛋腌制液之間進行物質交換的通道，隨著腌制期間堿液不斷滲透腐蝕會造成其結構發(fā)生改變?？紫抖饶軌蚍从尺@種結構變化，故選取蛋殼膜的內膜外側與外膜內側作為實驗樣本進行孔隙度分析。以新鮮蛋腌制第0天內膜外側為例，經(jīng)掃描電子顯微鏡拍攝后圖片效果模糊（圖6A），故利用Image J圖像處理軟件對纖維莖稈之間的孔隙進行識別分析（圖6B），紅色區(qū)域即為孔隙識別部分，表征蛋殼膜內外進行物質交換通道的密度。

圖6 蛋殼膜孔隙度圖像處理過程（2 000×）Fig. 6 Original and Image J processed images showing eggshell membrane porosity (2 000 ×)

由圖7可知，隨著腌制時間的延長，3 組蛋殼膜內膜及外膜孔隙度均呈現(xiàn)出波動變化的趨勢。原料蛋新鮮度越低，蛋殼膜的孔隙度越高，蛋殼外膜孔隙度均高于同組蛋殼內膜孔隙度，A組蛋殼膜孔隙度在腌制全周期均為最小，B組與C組之間差異較小。原因可能是A組皮蛋的哈夫單位與蛋黃指數(shù)均與C組之間存在顯著性差異（P＜0.05），而B、C組的蛋黃指數(shù)之間無顯著差異（P＞0.05）（表1）。同時，第0天時，C組不新鮮蛋的蛋殼內外膜孔隙度均顯著高于A組（P＜0.05），可能更有利于腌制液滲透入蛋內，從而導致在腌制過程中堿液對于蛋殼膜纖維莖桿的腐蝕更為劇烈。因此，在腌制過程中，A組與C組的蛋殼內膜及外膜孔隙度之間均存在顯著性差異（P＜0.05），B組與另兩組之間的差異性隨腌制過程的推進存在變化，在腌制后期內膜外側孔隙度差異更明顯。

圖7 不同新鮮度原料蛋在皮蛋腌制過程中蛋殼內膜及外膜孔隙度的變化趨勢Fig. 7 Changes in the porosity of inner and outer shell membranes of raw eggs with different freshness during the curing of preserved eggs

2.6 原料蛋新鮮度對腌制期間皮蛋品質整體的影響

表2為使用Pearson相關性分析法對實驗結果進行分析，對3 組皮蛋在腌制過程中蛋殼膜的外膜內側、內膜外側孔隙度與凝膠質構參數(shù)（硬度、彈性）及內容物理化性質（凝膠pH值、含水率）之間的相關性進行分析。

隨著堿液與皮蛋內容物發(fā)生作用，自腌制第8天皮蛋凝膠開始形成[27]，隨著凝膠含水率下降、蛋殼內膜及外膜孔隙度上升，凝膠的硬度與彈性逐漸升高。由表2可知，凝膠的含水率與硬度之間存在顯著負相關關系（r＝-0.463）（P＜0.05），蛋殼內膜與外膜的孔隙度均與凝膠的硬度及彈性存在正相關關系（P＜0.01、P＜0.05），可能由于蛋殼膜莖稈之間的孔隙作為腌制液滲透入蛋內的通道，可有效影響腌制液與皮蛋內容物相互作用，從而控制凝膠品質。同時，原料蛋新鮮度與蛋殼膜內膜及外膜孔隙度呈現(xiàn)極顯著負相關關系（r＝-0.702、r＝-0.714）（P＜0.01），且同新鮮度蛋殼內膜與外膜孔隙度之間具有極顯著正相關關系（r＝0.936）（P＜0.01）。研究表明，孔隙度在一定程度上可以表征蛋殼內部與外界交換通道的數(shù)量，在貯藏期間蛋內的CO2及水分會從透過蛋殼及蛋殼膜向外逸散，因此造成質量損失[24]。因此，推測蛋殼膜會隨皮蛋內容物一起產(chǎn)生水分散失，使得莖稈之間的纖維交織不再致密，造成3 組皮蛋孔隙度之間出現(xiàn)差異，孔隙度與原料蛋新鮮度之間呈負相關關系。

表2 蛋殼膜超微結構參數(shù)、原料蛋新鮮度、質構參數(shù)與內容物理化指標的相關性分析Table 2 Correlational analysis between eggshell membrane ultrastructure parameters, raw egg freshness, texture parameters and physical indexes

腌制中期，通過堿液的不斷滲透腐蝕作用，蛋殼腐蝕孔逐漸形成，此時堿液更易進入蛋內，使得腌制中期皮蛋凝膠的pH值產(chǎn)生變化（圖2）。隨著腌制時間的延長，腌制液中的金屬離子在蛋殼表面產(chǎn)生附著作用，使得堿液難以進入蛋內，并產(chǎn)生“堵孔”作用，進一步抑制堿液的滲透。同時，腌制液中的金屬鹽硫酸銅可能與蛋白質分子產(chǎn)生聚合作用形成凝膠網(wǎng)絡結構[28]，且pH值與凝膠硬度存在顯著負相關關系（r＝-0.459）（P＜0.05），使得腌制中期凝膠的硬度和彈性產(chǎn)生波動變化。

由圖2可知，腌制后期凝膠中的pH值下降趨勢加劇，Sun Naxin等[29]研究發(fā)現(xiàn)腌制過程中部分堿液會滲透入蛋黃內部，且第33天時皮蛋進入貯藏期，堿液不再滲透入蛋內，含水率持續(xù)降低，待蛋內體系平衡穩(wěn)定后，凝膠的硬度及彈性又呈現(xiàn)升高的趨勢。

皮蛋凝膠是變性的蛋白質分子間或其與溶劑分子之間排斥和吸引相互作用力相平衡的結果[28]，形成和維持蛋白凝膠網(wǎng)絡的作用力主要包括疏水作用、氫鍵、靜電作用以及二硫鍵等。有研究表明，卵白蛋白的降解過程是導致蛋清水樣化的因素之一，卵白蛋白分子中的α-螺旋和β-折疊結構含量下降，使得卵白蛋白的分子結構在貯藏期間逐漸變得松散、無序[30]。因此，原料蛋新鮮度降低導致蛋清水樣化，使得蛋白質分子變得松散無序，且在貯藏過程中，伴隨著蛋黃脂質的水解及氧化，使不新鮮蛋在堿誘導下更易形成凝膠，從而產(chǎn)生原料蛋新鮮度越低，皮蛋成品凝膠質構硬度及彈性越高的現(xiàn)象。

通過菌落計數(shù)實驗發(fā)現(xiàn)3 組皮蛋在腌制完成后成品皮蛋內部均無細菌存在，可能由于蛋內pH值較高，導致微生物難以存活。同時，3 組皮蛋的成品率分別為91.25%、83.75%、62.50%，C組的成品率極低且蛋殼表面黑斑較多。研究表明，蛋品在室溫下貯藏期間，前16 d新鮮度顯著下降，且貯藏時間超出20 d的蛋品不再具有食用價值，因此不宜作為原料蛋進行腌制[31]。本實驗選取3 組不同新鮮度鴨蛋作為實驗原料僅用于控制新鮮度梯度，探尋腌制期間皮蛋品質變化規(guī)律及原料蛋的新鮮度對腌制期皮蛋品質的影響。

本研究以不同新鮮度原料蛋在相同條件下進行腌制，結果表明，原料蛋新鮮度越低則達到同一皮蛋成品凝膠品質的腌制時間越短，成品蛋A組與C組的凝膠品質及蛋殼膜孔隙度均具有顯著性差異，且隨著原料蛋的新鮮度變化各指標的變化幅度存在差異，間接說明皮蛋的品質與原料蛋的新鮮度之間具有密切關系。

3 結 論

本研究探尋了不同新鮮度原料蛋在腌制過程中不同指標之間的差異性，發(fā)現(xiàn)腌制過程中蛋殼膜超微結構與皮蛋凝膠品質之間具有緊密聯(lián)系，原料蛋新鮮度越低，腌制液更易滲透入蛋內促進凝膠形成。因此在相同皮蛋成品要求條件下，原料蛋新鮮度越低，腌制時間越短，但原料蛋新鮮度降低的同時會導致皮蛋成品率顯著下降，造成經(jīng)濟損失，且貯藏時間超出20 d的蛋品不再具有食用價值，因此不宜作為原料蛋腌制皮蛋。本實驗對皮蛋加工過程中的質量控制和皮蛋蛋殼膜超微結構等的研究具有一定參考意義。