張孟琴,歐根友,徐路,張俊波,2,羅永梅

1(銅仁學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院,貴州 銅仁,554300)2(銅仁學(xué)院, 貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護與利用重點實驗室,貴州 銅仁,554300)3(銅仁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,貴州 銅仁,554300)

果膠具有良好的凝膠、增稠、吸附、乳化、穩(wěn)定等功能,已用于食藥、紡織、化工等眾多領(lǐng)域[1]。植物果膠主要由α-D-(1,4)-半乳糖醛酸重復(fù)片段組成的平滑區(qū)和帶有大量中性糖側(cè)鏈的α-D-(1,4)-半乳糖醛酸和α-L-(1,2)-鼠李糖交替連接的毛發(fā)區(qū)組成,主要有3種結(jié)構(gòu)域:均聚半乳糖醛酸、I-型聚鼠李糖半乳糖醛酸和Ⅱ-型聚鼠李糖半乳糖醛酸[2-4]。果膠的結(jié)構(gòu)及其相應(yīng)功能隨著物種、生長環(huán)境、提取工藝等不同而有一定差別。目前天然植物果膠在抗癌、抗氧化等方面的功能已得到關(guān)注[2，4],但主要集中在柑橘和蘋果果膠上。我國每年消耗果膠約5 000 t,但80%依賴進(jìn)口,因此,發(fā)掘新的果膠資源是一個極具潛力的研究方向。

三葉木通(Akebiatrifoliatekoiaz)屬于木通屬落葉木質(zhì)藤本植物,因其八九月份果實成熟,沿腹線自然開裂,故稱“八月瓜”、“八月炸”、“爆肚拿”[5]。其果實呈長圓形,直或腰果狀,個大飽滿,果皮顏色因生長氣候和地理位置而不同,多呈棕褐色、紫褐色或棕黃色,果肉乳白,漿汁甘甜,具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值[5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明,三葉木通富含黃酮、果酸、皂苷、多酚、萜類等活性成分,有保肝防癌、清熱利尿,活血通絡(luò)、生津止渴、抑菌美白之功效[6-7]。三葉木通廣泛分布于我國黃河流域以南等省份,僅在貴州省野生三葉木通面積高達(dá)數(shù)萬公頃。由于其極高的營養(yǎng)藥用價值,人工栽培三葉木通已在貴州、陜西、四川、河南等省份規(guī)?；N植,每公頃產(chǎn)量為100～135 kg,最高每公頃達(dá)165 kg,產(chǎn)生了較高的社會經(jīng)濟效益。三葉木通厚重果皮占到果實總重量的50%以上,通常在食用果肉后將其丟棄。隨著大規(guī)模的種植和推廣,如果三葉木通果皮不加以開發(fā)利用,不僅造成資源的浪費,而且將對環(huán)境造成一定破壞。三葉木通果皮中果膠含量豐富,但有關(guān)三葉木通果膠的提取及藥用功能研究鮮見報道。

本研究以三葉木通果皮為材料,采用酸提醇沉法對來自地理環(huán)境不同、氣候差異的貴州凱里和河南南陽一帶的三葉木通果膠進(jìn)行提取并比較其理化性質(zhì)和功能活性,以期為三葉木通資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三葉木通果實采自貴州凱里和河南南陽山區(qū)一帶。用去離子水清洗三葉木通果實2～3遍,晾干水分后取其果皮,先置于45 ℃溫水中浸泡20 min,去除可溶性的糖、色素及苦味素等成分,然后放入沸水中蒸煮10 min后再用去離子水淋洗2遍,紗布包好擰出水分,烘干箱內(nèi)50 ℃烘干,粉碎,過20目篩,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

人肺癌細(xì)胞株(A549)和人髓系慢性白血病細(xì)胞株(K562-2)由貴州大學(xué)生物實驗室提供。

咔唑、D-半乳糖醛酸等單糖標(biāo)準(zhǔn)樣品、焦性沒食子酸,上海麥克林生化科技有限公司;牛血清蛋白(BR),國藥集團化學(xué)試劑有限公司;考馬斯亮藍(lán)G-250,福州文萊生物科技有限公司;DPPH,思域化工有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基,北京鈕因華信科技發(fā)展有限公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl terazolium,MTT)、二甲基亞砜(BR)、優(yōu)級胎牛血清、青霉素、鏈霉素混合液,北京索萊寶科技公司;胰蛋白酶,美國Sigma 公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-25酸度計、721G可見分光光度計,上海儀電分析儀器股份有限公司;傅立葉紅外光譜儀,日本Shimadzu公司;LGJ-30S真空冷凍干燥箱,北京松源華興科技發(fā)展有限公司;Spectra Mr型全波長酶標(biāo)儀,美國Dynex公司;倒置顯微鏡,德國Leica公司;ICS-3000型高效液相離子交換色譜儀(配有脈沖安培檢測器),美國DIONEX公司。

1.3 實驗方法

果膠制備:三葉木通果皮干燥粉末20.00 g和酸水溶液(pH=2.00,亞硫酸調(diào)節(jié))按1∶20(g∶mL)進(jìn)行料液配比,90 ℃恒溫浸提120 min,6層紗布過濾,濾渣重復(fù)提取1次,合并2次濾液,再在4 000 r/min下離心15 min,以除掉多余的淀粉、纖維素等不溶物,用水浴鍋濃縮上清液至原體積的1/3,加入約1.5倍無水乙醇,冷卻至常溫后置于冰箱內(nèi)4 ℃靜置4 h后抽濾,濾出的果膠用60%(體積分?jǐn)?shù))乙醇反復(fù)洗滌2～3次,真空冷凍干燥48 h[8]。用上述方法分別獲得貴州凱里果膠(PAG)和河南南陽果膠(PAH)制品。

果膠鑒定和干燥失重:采用國標(biāo)GB 2553—2010對PAG和PAH三葉木通果膠進(jìn)行鑒定和干燥失重測定。

果膠半乳糖醛酸含量：配制1.0 g/L半乳糖醛酸溶液,配制成7個不同質(zhì)量濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別加入12 mL濃H2SO4,冰浴,邊冷卻邊加入半乳糖醛酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各2 mL,沸水加熱10 min,冷卻至室溫再加入1 mL 0.15%咔唑溶液,搖勻室溫靜置30 min,以蒸餾水作空白參比,530 nm波長下測定吸光度,以半乳糖醛酸濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]。同法顯色三葉木通果皮果膠溶液并測定其吸光度,計算其半乳糖醛酸的含量。

果膠酯化度(degree of esterification,DE)的評價:用少量無水乙醇潤濕0.050 0 g果膠樣品,再用100 mL去離子水溶解,滴加2～3滴酚酞指示劑,堿性標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1 mol/L NaOH)滴定至粉紅色且30 s內(nèi)不褪色,記錄使用的NaOH體積(V1);加入20 mL 0.5 mol/L NaOH溶液,混勻靜置15 min后加入20 mL標(biāo)準(zhǔn)酸性溶液(0.5 mol/L HCl)至粉紅色消失,再滴加2～3滴酚酞指示劑,用上述堿性溶液滴定至淺粉紅色即為終點,記錄第2次用去的NaOH體積(V2)[10]。果膠DE計算如公式(1)所示:

(1)

果膠溶解度:采用酸化法測定果膠溶解度[10]。

果膠灰分含量、pH值和果膠酸不溶灰分含量:均采用輕工標(biāo)準(zhǔn)QBT 2484—2000《食品添加劑—果膠》進(jìn)行測定。

多酚含量:用Folin-Ciocalten法制作沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線[11]。果膠樣液同法顯色,由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算果膠樣品中多酚含量。

蛋白質(zhì)含量:采用考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定果膠中蛋白質(zhì)含量[12]。

三葉木通果膠中性糖組成測定:水解0.01 g三葉木通果膠樣品,少量乙醇浸潤后再加入2 mL去離子水溶解果膠;加入2 mL 8% H2SO4溶液,121 ℃ 60 min使其充分反應(yīng);冷卻后加入0.16 mL 50% NaOH中和,稀釋100倍,采用DINOXICS-3000型高效液相離子交換色譜儀進(jìn)行定量分析(Dione Car- boPac PA20色譜柱和脈沖安培檢測器)。色譜條件:柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μL,葡萄糖、半乳糖及阿拉伯糖的流動相均為0.2 mol/L NaOH,流速0.2 mL/min;鼠李糖和半乳糖醛酸的流動相為0.2 mol/L NaOH和0.5 mol/L CH3COONa,流速0.3 mL/min[13]。

羥自由基(·OH)清除能力:采用文獻(xiàn)[14]的方法測定,510 nm處測定吸光度。

DPPH自由基清除能力:采用文獻(xiàn)[14]的方法測定,517 nm處測定吸光度。

體外抗腫瘤活性:用MTT法測定三葉木通果膠對人肺癌細(xì)胞(A549)和人慢性髓系白血病細(xì)胞(K562-2)增殖的抑制率[15]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用IBM SPSS Statistics 24及Origin Pro8進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理和繪制圖表,3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠鑒別

果膠的鑒別見圖1。

上述提取冷卻后兩類果膠均形成黏稠狀的液體(圖1-A、圖1-B),加入NaOH靜止后出現(xiàn)了凝膠沉淀(圖1-C、圖1-D),說明提取的兩產(chǎn)地三葉木通果膠均符合果膠的表觀特征。PAG明顯比PAH的成色好,這可能與三葉木通的品種、果皮的顏色及生長環(huán)境有關(guān)。

圖1 三葉木通果膠鑒別圖Fig.1 Identification of pectin in Akebia trifoliata peels注:A和B分別為提取冷卻的貴州凱里和河南南陽三葉木通果膠;C和D分別為加入NaOH的貴州凱里和河南南陽三葉木通果膠

2.2 三葉木通果膠理化特性

由表1可知,2種產(chǎn)地果膠的干燥失重、灰分、酸不溶灰分、溶解度、pH等均符合國家食品安全果膠標(biāo)準(zhǔn),且均為高酯果膠;果膠PAG半乳糖醛酸的含量(72.08%)和酯化度(89.50%)均低于果膠PAH半乳糖醛酸的含量(77.93%)和酯化度(91.60%);2種果膠的溶解度均大于80%。

表1 三葉木通果皮果膠理化性質(zhì)指標(biāo)測定Table 1 Physical and chemical indexes of pectin in the Akebia trifoliata peels

2.3 果膠糖基成分分析

由表2可知,兩產(chǎn)地三葉木通果膠的主要組成成分是酸性半乳糖醛酸基,中性糖主要包括葡萄糖基、半乳糖基、木糖基、鼠李糖基和阿拉伯糖等組成。其中PAG和PAH中酸性半乳糖醛酸的比例分別為65.10%和69.52%。這與表1中采用的顯色法測定數(shù)值趨勢一致,但有一定的差異,這可能是由于測定方法的不同所造成。PAG和PAH中的中性糖基總質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為16.76%和15.46%。

表2 三葉木通果皮果膠的糖基組成 單位:%

2.4 三葉木通果皮果膠的紅外光譜分析

圖2 果膠PAG的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrum of pectin

2.5 蛋白質(zhì)和多酚含量

由于提取果膠采用的是酸提醇沉法,部分溶于酸的物質(zhì)(蛋白質(zhì)和多酚等)可能會被提取出來,故對兩物質(zhì)的含量進(jìn)行檢測。由圖3可知,兩產(chǎn)地果膠中蛋白質(zhì)和多酚的含量均較低。PAG中蛋白質(zhì)的含量為2.3 mg/g,PAH中蛋白質(zhì)的含量為2.56 mg/g,且二者差異不顯著(P<0.05);PAG中多酚含量(6.15 mg/g)高于PAH中多酚的含量(3.83 mg/g),差異顯著(P<0.05)。該研究結(jié)果說明果膠的抗氧化活性主要由果膠多糖引起。

圖3 PAG和PAH三葉木通果膠中蛋白質(zhì)及多酚的含量Fig.3 Contents of proteins and polyphenols in PAG and PAH注:柱上不同的小寫字母分別代表兩產(chǎn)地果膠中蛋白質(zhì)及多酚的含量存在顯著性差異(P<0.05)

2.6 三葉木通果膠對·OH清除能力

由圖4可知,2個產(chǎn)地三葉木通果膠對·OH的清除能力雖不及維生素C,但均具有一定的清除作用。當(dāng)質(zhì)量濃度<0.5 mg/mL時,PAG和PAH果膠清除·OH 能力差異較小;當(dāng)果膠質(zhì)量濃度≥0.5 mg/mL時,PAH清除·OH能力顯著高于PAG;當(dāng)果膠液質(zhì)量濃度≥3 mg/mL時,PAG清除·OH能力(44.7%)僅為PAH清除·OH能力(75.4%)的60%,說明來源不同的三葉木通果膠其抗氧化能力不同。SPSS 24.0軟件Probit線性回歸分析果膠PAG的IC50的值為3.3 mg/mL,PAH的IC50為1.72 mg/mL。

圖4 果膠PAG、PAH對·OH的清除作用Fig.4 Scavenging effect of PAG and PAH on hydroxyl radical

2.7 三葉木通果皮果膠對DPPH自由基的清除活性

DPPH是一種紫色溶液,其在517 nm處有特征吸收,當(dāng)它獲得氫后,其溶液的顏色會隨著供氫體濃度的變化而逐漸變成黃色,吸光值也隨之改變。由圖5可知,當(dāng)果膠液質(zhì)量濃度大于0.2 mg/mL后,PAH清除DPPH自由基等能力遠(yuǎn)高于PAG,當(dāng)果膠液的質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL時,果膠PAH對DPPH自由基清除率(90.5%)為PAG對DPPH自由基清除率(10.4%)的9倍,幾乎和維生素C對DPPH自由基清除率(95.6%)相當(dāng)。SPSS 24.0軟件Probit線性回歸分析PAG的IC50值為3.55 mg/mL,PAH的IC50值為0.545 mg/mL。

圖5 PAG和PAH果膠對DPPH自由基的清除作用Fig.5 Scavenging effect of PAG and PAH on DPPH radical

2.8 三葉木通果皮果膠體外抗癌活性

PAG和PAH果膠均對癌細(xì)胞A549及K562-2增殖具有一定的抑制作用(圖6),果膠PAG對A549抑制率[(13.55±2.39)%]和對K562-2抑制率[(11.41±1.94)%]均高于果膠PAH對A549的抑制率[(11.29±3.57)%]及K562-2的抑制率[(9.70±2.23)%],差異性均不顯著(P> 0.05);兩產(chǎn)地果膠對A549的抑制作用均比K562-2略強。該研究結(jié)果初步說明三葉木通果膠在防治肺癌和髓系白血病等疾病方面具有一定的開發(fā)利用價值。已有文獻(xiàn)表明,柑橘果膠降解后其產(chǎn)物的抗癌活性較降解前大副提高[20],故將三葉木通果膠進(jìn)行降解改性以提高其抗癌活性將是后續(xù)要研究的重點。

圖6 PAG和PAH果膠對癌細(xì)胞A549和K562-2增殖的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of PAG and PAH on proliferation of cancer cells A549 and K562-2V注:不同小寫字母分別代表兩產(chǎn)地果膠及吉非替尼對人肺癌細(xì)胞A549和人慢性髓系白血病細(xì)胞K562-2的抑制作用存在顯著差異(P<0.05)

3 結(jié)論

本研究選取南北氣候差異較大的貴州凱里和河南南陽一帶的三葉木通為原料,對兩產(chǎn)地三葉木通果膠的理化性質(zhì)、抗氧化能力進(jìn)行測定評價,并初步探究兩產(chǎn)地果膠對癌細(xì)胞A549和K562-2的抑制作用,以期為三葉木通這種新型水果尋找更多的開發(fā)利用價值。研究結(jié)果表明,酸提醇沉法制取的兩產(chǎn)地果膠均為高酯果膠,其半乳糖醛酸含量、酯化度、pH等理化指標(biāo)均符合果膠食品安全標(biāo)準(zhǔn)。灰分主要由一些金屬氧化物及其鹽類組成,過高的灰分能影響其品質(zhì),降低膠凝度和溶解度,色澤變差,故它是國家食品安全果膠標(biāo)準(zhǔn)的重要指標(biāo)之一。本研究提取的三葉木通果膠灰分含量(≤3.31%)符合國家安全標(biāo)準(zhǔn)(≤5%),故其灰分可能不對提取果膠的理化特性產(chǎn)生顯著影響。

提取果膠時,其提取溶劑的pH越低,越容易造成果膠脫酯并使半乳糖醛酸含量增加酯化度降低,同時果膠產(chǎn)率下降。本研究中的河南三葉木通果膠的酯化度(91.6%)高于石兵艷等[10]研究的陜西八月瓜果膠酯化度(82.84%),其原因可能是提取河南三葉木通果膠時溶劑pH值(pH=2)高于后者提取溶劑的pH值(pH=1.5),同時也造成了三葉木通果膠半乳糖醛酸含量(≥72.08%)低于后者提取的八月瓜果膠半乳糖醛酸含量(81.35%)。

兩產(chǎn)地果膠對·OH和DPPH自由基均具有一定的清除能力,且與濃度成量效關(guān)系。在相同的果膠溶液濃度下,PAH(河南三葉木通果膠)清除DPPH自由基及·OH的能力均顯著高于PAG(貴州產(chǎn)地三葉木通果膠);當(dāng)溶液的質(zhì)量濃度為4 mg/mL時,PAH對·OH的清除率(76.2%)高于馬麗蘋等[14]研究的商品蘋果果膠(清除率為71.0%)。清除·OH的機制主要表現(xiàn)在抑制·OH的產(chǎn)生和清除反應(yīng)產(chǎn)生的·OH兩方面。多糖中的羧基可絡(luò)合金屬離子如Fe2+與Cu2+從而抑制金屬離子與H2O2反應(yīng)生成·OH,另一方面多糖中羥基和羧基能提供氫供體與·OH作用從而清除·OH。因此半乳糖醛酸含量高的三葉木通果膠清除·OH的能力更強。這與VENZON等[21]研究的甜橙果膠相似。同時研究結(jié)果還顯示,PAH對DPPH自由基的清除率(93.9%)是姜美云等[22]研究的商品柑橘果膠(清除率<15%)的6倍和馬麗蘋等[14]研究商品蘋果果膠(清除率<65%)的1.5倍。這可能由于該產(chǎn)地三葉木通果膠中半乳糖醛酸含量較高,其羧基更容易解離,使DPPH自由基更易還原成DPPH-H,從而對DPPH自由基的清除能力更強。

果膠的生物活性不僅與其半乳糖醛酸的含量有關(guān),也與酯化度的大小有關(guān)。SALMAN等[23]研究了不同酯化度的柑橘果膠對炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響,結(jié)果顯示高酯果膠能顯著減少IL-1β的產(chǎn)生,抗炎效果更佳。本研究提取的三葉木通果膠其半乳糖醛酸含量、酯化度均高于商品柑橘果膠和商品蘋果果膠,表明三葉木通果皮果膠在醫(yī)藥及保健方面具有更好地開發(fā)潛力。

MTT研究結(jié)果表明,2種產(chǎn)地三葉木通果膠的抗癌活性雖不及光譜抗癌藥吉非替尼,但均對癌細(xì)胞A549和K562-2有較好的抑制作用,其中果膠PAG對2種實驗癌細(xì)胞的抑制作用略強。在崇尚綠色、回歸自然、倡導(dǎo)環(huán)保健康的今天,本研究從河南和貴州兩產(chǎn)地的野生三葉木通果皮中提取出了高質(zhì)量果膠并進(jìn)行了理化特性研究,發(fā)現(xiàn)它們具有較好的抗氧化活性和抗癌能力,這為三葉木通資源的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。