張蓋天，祁惠，楊鎖寧，褚志云，袁素霞，劉春

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

八仙花（Hydrangea macrophylla）又名繡球花，為虎耳草科八仙花屬植物，觀賞部位為大部分不孕花及其萼片組成的傘狀頂生花序[1]，原產(chǎn)于中國(guó)、日本等國(guó)家[2-3]。八仙花品種眾多、花色豐富、花型繁多，在歐美地區(qū)被廣泛應(yīng)用于庭院綠化、切花等。近年來(lái)，八仙花盆栽、切花和干花也受到越來(lái)越多中國(guó)消費(fèi)者的喜愛(ài)。

八仙花具有特殊的栽培學(xué)特性，即在合適的土壤pH條件下，部分品種施鋁處理后花萼片顏色會(huì)由原本的粉色變?yōu)樗{(lán)色[4]，因此，八仙花花色變化機(jī)理逐漸成為研究熱點(diǎn)。八仙花萼片有色細(xì)胞主要集中于花萼片上表皮下部和葉肉細(xì)胞上部的組織中[5]，為方便對(duì)有色細(xì)胞獨(dú)有的生理與分子特性進(jìn)行深入研究，揭示花器官有色細(xì)胞中特有的膜結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)及功能[6-10]，需將組織中的有色細(xì)胞與無(wú)色細(xì)胞有效分離，因此，必需建立八仙花萼片有色原生質(zhì)體游離體系。原生質(zhì)體是細(xì)胞除去細(xì)胞壁后所得的由膜包裹的結(jié)構(gòu)，包括膜結(jié)構(gòu)、液泡、細(xì)胞核、質(zhì)體及線粒體等，其中，液泡是植物儲(chǔ)藏色素類物質(zhì)的器官，成熟細(xì)胞的液泡體積約占細(xì)胞體積的90%[11]，即在顯微鏡下觀察到的有色細(xì)胞液泡內(nèi)含有色素類物質(zhì)，而無(wú)色細(xì)胞液泡內(nèi)不含色素類物質(zhì)。

原生質(zhì)體用途廣泛，主要用于瞬時(shí)表達(dá)，如亞細(xì)胞定位[12]、原生質(zhì)體融合[13]等，其游離受諸多因素影響，主要包括植物組織材料類型[14]、預(yù)處理方式[12]、酶濃度及配比[15]、滲透壓[16]、酶解時(shí)間[17]和離心力[18]等。目前，在擬南芥（Arabidopsisthaliana）[19]和水稻（Oryza sativa）[20]中已建立了成熟的原生質(zhì)體游離體系。而關(guān)于八仙花有色原生質(zhì)體游離體系的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，極大地限制了八仙花花色形成機(jī)理的相關(guān)研究。因此，本研究擬建立高效的八仙花有色細(xì)胞原生質(zhì)體游離體系，并應(yīng)用于不同品種八仙花萼片的原生質(zhì)體游離，以期為后續(xù)八仙花有色細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)化相關(guān)研究、細(xì)胞水平上的生理生化研究以及單細(xì)胞測(cè)序奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究選用種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地的4個(gè)八仙花（Hydrangea macrophylla）品種‘Bailmer’‘Baby Blue’‘Bela’和‘Duro’進(jìn)行研究，所有材料均選用盛花期萼片。其中,‘Bailmer’‘Baby Blue’和‘Bela’在不施鋁栽培條件下花萼片呈粉色，施鋁栽培條件下花萼片呈藍(lán)色；‘Duro’在施鋁和不施鋁栽培條件下萼片顏色變化較小，基本均呈品紅色。

1.2 試劑和儀器

試 劑：纖 維 素 酶（cellulase）、離 析 酶（macerozyme R-10）、甘露醇（D-mannitol）、嗎啉乙磺酸（morpholine ethyl sulfonic acid，MES）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、KCl、NaCl、MgSO4·7H2O、乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（ethylene glycol tetraacetic acid，EGTA）和甘油（glycerol）購(gòu)自于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；聚-L-賴氨酸（poly-L-lysine）購(gòu)自于西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；CaCl2購(gòu)自于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器：電子天平（BSM-220.4，上海卓精電子科技有限公司）、恒溫震蕩儀（MQT-60R，上海旻泉儀器有限公司）、離心機(jī)（BY-80C，北京白洋醫(yī)療器械有限公司）、低溫離心機(jī)（1-14K,Sigma）、倒置顯微鏡（DMIL LED，Leica）、非損傷微測(cè)儀（NMTYG-100，Younger）。

1.3 原生質(zhì)體游離

取盛花期萼片0.8~1.0 g，經(jīng)預(yù)處理后，立即移至含有10 mL酶解液的離心管中；之后，將離心管放置在恒溫震蕩儀（28℃，40 r·min-1）內(nèi)進(jìn)行酶解；待酶解后，將混合液置于200目篩網(wǎng)過(guò)濾殘?jiān)脼V液倒入燒杯中；將所得濾液移至10 mL離心管中，并用改良后的W5洗液[19]（154 mmol·L-1NaCl、125 mmol·L-1CaCl2、5 mmol·L-1KCl和4 mmol·L-1MES-Tris pH 6.3，滅菌，4℃保存）輕柔沖洗濾網(wǎng)上的殘?jiān)盁?，沖洗后的液體移入離心管中，2 000 r·min-1離心5 min，棄上清；沉淀由W5洗液重懸后移至1.5 mL離心管中，低溫（4℃）離心5 min，棄上清；最后，用200μL儲(chǔ)存液[5]將離心管中的沉淀懸浮，4℃保存。酶解液配制方法：將纖維素酶、離析酶、甘露醇和20 mmol·L-1pH 6.3的MES-Tris混勻后于55℃水浴10 min，待冷涼至室溫后加入0.1%（質(zhì)量體積比）BSA和10 mol·L-1CaCl2；儲(chǔ)存液配制方法：甘露醇、2 mmol·L-1MgSO4、10 mmol·L-1KCl、20 mmol·L-1MES-Tris、5 mmol·L-1EGTA（pH 6.0）和2%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）甘油，滅菌，4℃保存。

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別設(shè)置不同預(yù)處理方式、酶濃度、酶解時(shí)間、甘露醇濃度、離心力、添加BSA和CaCl2，對(duì)原生質(zhì)體游離體系和方法進(jìn)行優(yōu)化。

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.4.1 試驗(yàn)材料預(yù)處理方式 對(duì)試驗(yàn)材料采用2種不同的預(yù)處理方式進(jìn)行處理，分別為：花萼片切絲法、花萼片上下表皮分離法。原生質(zhì)體游離所用的纖維素酶和離析酶濃度分別為4%和0.4%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)），甘露醇濃度為0.6 mol·L-1，酶解時(shí)間2 h，4℃條件下1 426 r·min-1離心；儲(chǔ)存液甘露醇濃度為0.6 mol·L-1，其余同1.3。

1.4.2 酶濃度 設(shè)置纖維素酶質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)分別為2%、4%、6%和8%；離析酶的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)分別為0.2%、0.4%、0.6%和0.8%。試驗(yàn)材料預(yù)處理方式采用花萼片上下表皮分離法，甘露醇0.6 mol·L-1，酶解時(shí)間2 h，4℃條件下1 426 r·min-1離心5 min，儲(chǔ)存液甘露醇0.6 mol·L-1，其余同1.3。

1.4.3 酶解時(shí)間 酶解時(shí)間設(shè)4個(gè)水平，分別為1、2、3和4 h。試驗(yàn)材料預(yù)處理方式采用花萼片上下表皮分離法，纖維素酶與離析酶濃度質(zhì)量體積比分?jǐn)?shù)分別為4%和0.4%，甘露醇0.6 mol·L-1，4℃條件下1 426 r·min-1離心5 min，儲(chǔ)存液甘露醇0.6 mol·L-1，其余同1.3。

1.4.4 甘露醇 對(duì)酶解液與儲(chǔ)存液中的甘露醇分別設(shè)0.4、0.6和0.8 mol·L-13個(gè)梯度。試驗(yàn)材料預(yù)處理方式為花萼片上下表皮分離法，纖維素酶與離析酶質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)分別為4%和0.4%，酶解時(shí)間2 h，4℃條件下1 426 r·min-1離心5 min，其余同1.3。

1.4.5 添加BSA和CaCl2酶與甘露醇融于含20 mmol·L-1MES-Tris（pH 6.3）的溶液并水浴后，加入0.1%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）BSA和10 mmol·L-1CaCl2，以不加BSA和CaCl2的酶解液為對(duì)照。試驗(yàn)材料預(yù)處理方式均為花萼片上下表皮分離法，纖維素酶與離析酶質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)分別為4%和0.4%，甘露醇0.6 mol·L-1，酶解時(shí)間2 h，4℃條件下1 426 r·min-1離心5 min，其余同1.3。

1.4.6 離心力 在4℃條件下，分別用1 164、1 426、1 646和1 841 r·min-1離心5 min。試驗(yàn)材料預(yù)處理方式為花萼片上下表皮分離法，纖維素酶與離析酶質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)分別為4%和0.4%，甘露醇0.6 mol·L-1，酶解時(shí)間2 h，其余同1.3。

1.5 游離原生質(zhì)體計(jì)數(shù)

使原生質(zhì)體均勻懸浮后，分別制片3張，每張滴30μL懸浮液后覆24 mm×50 mm蓋玻片，鏡檢拍照，分別從3張制片中選取9張鏡檢圖并統(tǒng)計(jì)有色原生質(zhì)體數(shù)量，SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖。

1.6 液泡H+流測(cè)定

將牙簽尖頭部用少量脫脂棉包裹成拖把狀，蘸取0.008%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）聚-L-賴氨酸[21]涂抹在一次性培養(yǎng)皿中，置于冰箱冷藏層晾干備用。

使用特定檢測(cè)H+流的離子交換液及質(zhì)子選擇性微電極制作探針，液泡H+流測(cè)試液繪制H+流測(cè)定標(biāo)線。

吸取部分原生質(zhì)體懸浮液移至培養(yǎng)皿中，加入特定液泡H+流測(cè)試液，避光條件下靜置，使原生質(zhì)體在重力作用下下沉，根據(jù)陰陽(yáng)離子互作原理，聚-L-賴氨酸涂層吸附住原生質(zhì)體，保證非損傷微測(cè)儀質(zhì)子選擇性微電極在運(yùn)行過(guò)程中不移動(dòng)。

分別隨機(jī)選取‘Baby Blue’粉色、藍(lán)色原生質(zhì)體各7個(gè)，將探針置于靠近液泡的位置，對(duì)其液泡H+、Na+流進(jìn)行測(cè)定并繪制相應(yīng)測(cè)定曲線，導(dǎo)出曲線相應(yīng)讀數(shù)，SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)有色原生質(zhì)體酶解的影響

2.1.1 材料預(yù)處理方式對(duì)有色原生質(zhì)體游離效率的影響 對(duì)‘Bailmer’和‘Baby Blue’的粉色和藍(lán)色花萼片分別采用切絲和上下表皮分離法進(jìn)行處理，結(jié)果表明，相較于切絲法，萼片上下表皮分離法更能高效地游離4種花萼片的有色原生質(zhì)體（圖1A），每個(gè)視野分別獲得有色原生質(zhì)體11~14個(gè)（‘Bailmer’）和17~22個(gè)（‘Baby Blue’）。

2.1.2 不同酶含量對(duì)有色原生質(zhì)體游離效率的影響 由圖1B可知，當(dāng)纖維素酶與離析酶質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)分別為4%和0.4%時(shí)，4份材料所獲得的有色原生質(zhì)體數(shù)量（每個(gè)視野）均顯著高于其他含量組合。因此，4%和0.4%為纖維素酶與離析酶最佳酶解含量。

2.1.3 不同酶解時(shí)間對(duì)有色原生質(zhì)體游離效率的影響 不同的酶解時(shí)長(zhǎng)的結(jié)果（圖1C）表明，對(duì)‘Bailmer’藍(lán)色和粉色萼片來(lái)說(shuō)，酶解2 h獲得有色原生質(zhì)體的數(shù)量均顯著高于酶解1、3和4 h；而對(duì)于‘Baby Blue’藍(lán)色和粉色萼片，酶解1和2 h所得有色原生質(zhì)體的數(shù)量無(wú)明顯差異，但均顯著高于酶解3和4 h。綜合考慮，2 h為最適酶解時(shí)長(zhǎng)。

2.1.4 不同甘露醇濃度對(duì)有色原生質(zhì)體游離效率的影響 對(duì)酶解液與儲(chǔ)存液中甘露醇的不同濃度進(jìn)行比較，結(jié)果（圖1D）表明，當(dāng)甘露醇濃度為0.6 mol·L-1時(shí)，其滲透壓最適合有色原生質(zhì)體的解離與儲(chǔ)存。

2.1.5 添加BSA和CaCl2對(duì)有色原生質(zhì)體游離效率的影響 由于前4組酶解離條件篩選試驗(yàn)中，同一八仙花品種不同顏色萼片的有色原生質(zhì)體游離結(jié)果表現(xiàn)趨勢(shì)一致，故本試驗(yàn)只選用了‘Bailmer’藍(lán)色萼片和‘Baby Blue’粉色萼片為試驗(yàn)材料。結(jié)果（圖1E）顯示，在酶解液中添加0.1%BSA和10 mmol·L-1CaCl2后，‘Bailmer’藍(lán)色萼片所得有色原生質(zhì)體的數(shù)量與對(duì)照差異不顯著；但‘Baby Blue’粉色萼片在添加0.1%BSA和10 mmol·L-1CaCl2后，酶解液中所得有色原生質(zhì)體的數(shù)量顯著高于對(duì)照。綜合考慮，在酶解液中添加0.1%BSA和10 mmol·L-1CaCl2效果較好。

圖1 單因素對(duì)有色原生質(zhì)體酶解的影響Fig.1 Effect of single foctor on enzymatic hydrolysis

2.1.6 不同離心力對(duì)有色原生質(zhì)體游離效率的影響 以‘Bailmer’藍(lán)色萼片和‘Baby Blue’粉色萼片為材料，分析不同離心力下獲得有色原生質(zhì)體數(shù)量的差異，結(jié)果（圖1F）顯示，4℃條件下，1 426 r·min-1離心時(shí)獲得有色原生質(zhì)體的數(shù)量顯著高于其他3種離心速率。離心速率過(guò)低，不能有效地沉淀有色原生質(zhì)體；而離心速率過(guò)高會(huì)破損有色原生質(zhì)體，降低產(chǎn)量。

上述研究表明，采用花萼片上下表皮分離法、纖維素酶和離析酶的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)分別為4%和0.4%、加入0.1%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）BSA和10 mmol·L-1CaCl2、酶解時(shí)間2 h、4℃條件下1 426 r·min-1離心5 min、甘露醇0.6 mol·L-1為八仙花萼片有色原生質(zhì)體游離的最佳條件。

2.2 八仙花萼片有色細(xì)胞原生質(zhì)體酶解體系應(yīng)用

2.2.1 不同品種中酶解體系的應(yīng)用 按上述最優(yōu)酶解體系對(duì)4個(gè)八仙花品種在施鋁處理（+Al3+）和未施鋁處理（CK）條件下的花萼片進(jìn)行有色原生質(zhì)體游離。將原生質(zhì)體懸浮均勻后制片，200×鏡下單視野內(nèi)可獲得13~35個(gè)有色的原生質(zhì)體（圖2）。

圖2 不同品種八仙花花器官及原生質(zhì)體游離示意圖（Bar=50μm）Fig.2 Schematic diagram of floral organs and protoplast dissociation of different species of Hydrangea（Bar=50μm）

2.2.2 液泡H+離子流分析 使用非損傷微測(cè)技術(shù)對(duì)八仙花品種‘Baby blue’粉色、藍(lán)色液泡的H+、Na+流進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果（圖3）表明，從H+流平均值來(lái)看，藍(lán)色液泡H+流外排趨勢(shì)較粉色液泡更加明顯，由此推斷，藍(lán)色液泡的pH高于粉色液泡；從Na+流平均值來(lái)看，藍(lán)色液泡Na+流吸收趨勢(shì)更為明顯，由此推斷，H+在外流后，液泡吸收Na+來(lái)維持液泡內(nèi)部原有溶質(zhì)含量。

圖3 ‘Baby blue’離子流Fig.3 ‘Baby blue’ion flux

3 討論

八仙花萼片酶解游離出的原生質(zhì)體分為有色原生質(zhì)體與無(wú)色原生質(zhì)體兩種，其中，有色原生質(zhì)體是研究花色形成的重要研究對(duì)象。原生質(zhì)體游離的基礎(chǔ)是酶解細(xì)胞壁釋放原生質(zhì)體。1960年，Cocking[22]首次利用從疣孢菌中獲得的纖維素酶，以番茄根系為材料游離出了原生質(zhì)體，這也是酶解法游離原生質(zhì)體在植物上的首次應(yīng)用。隨后從木霉素中提取出纖維素酶，這也是后續(xù)大量原生質(zhì)體游離試驗(yàn)中使用頻率最高的酶[23]。酶解游離原生質(zhì)體越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于不同物種。

本研究發(fā)現(xiàn)，八仙花萼片原生質(zhì)體游離的數(shù)量少于其他植物葉片、嫩莖和愈傷組織產(chǎn)生的原生質(zhì)體數(shù)量，這可能是由組織材料的差異造成。酶解液更容易浸入疏松的組織，充分與細(xì)胞壁接觸，斷開(kāi)纖維鏈并消解果膠。Yoo等[19]對(duì)擬南芥葉片原生質(zhì)體游離時(shí)發(fā)現(xiàn)，酶解材料切絲時(shí)應(yīng)避免擠壓損傷，因?yàn)閿D壓會(huì)造成原生質(zhì)體在細(xì)胞壁構(gòu)筑的小室內(nèi)破裂。然而，八仙花萼片組織質(zhì)密、韌性強(qiáng)，如果對(duì)萼片采用切絲的預(yù)處理方法，會(huì)在創(chuàng)口處留下明顯的擠壓損傷，導(dǎo)致其原生質(zhì)體游離的難度增大。本研究發(fā)現(xiàn)，采用分離上下表皮對(duì)八仙花萼片進(jìn)行預(yù)處理，能增加酶液與材料的接觸面積，有利于打破組織質(zhì)密造成的酶解障礙，顯著增加原生質(zhì)體游離的數(shù)量。在對(duì)不同品種八仙花萼片原生質(zhì)體進(jìn)行游離時(shí)還發(fā)現(xiàn)，花萼片大且厚時(shí)，其上下表皮更易分離，更有利于原生質(zhì)體游離。

為了高效地游離原生質(zhì)體，必需配比合適比例的酶。若酶用量過(guò)低，則酶消解細(xì)胞壁的能力不足以支撐原生質(zhì)體游離工作的完成；若酶用量過(guò)高，則會(huì)造成原生質(zhì)體失活。Yoshida等[5]在游離八仙花萼片有色細(xì)胞原生質(zhì)體時(shí)，采用的纖維素酶與離析酶質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)分別為2%和0.2%，但本研究發(fā)現(xiàn)，纖維素酶與離析酶含量分別為4%和0.4%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）時(shí)，酶解產(chǎn)生的有色原生質(zhì)體數(shù)量顯著高于2%和0.2%（纖維素酶與離析酶水平）。另外，BSA能夠有效維持酶活，保障酶解過(guò)程中酶功能的持續(xù)性[24]；而Ca2+能與磷脂類物質(zhì)上的負(fù)電荷結(jié)合維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，在一定程度上保障原生質(zhì)體的活性，因此，在酶液中加入0.1%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）BSA和10 mmol·L-1CaCl2能獲得更多的原生質(zhì)體[25]。此外，若酶解時(shí)間較短，酶液無(wú)法與細(xì)胞壁充分反應(yīng)；若酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)拉長(zhǎng)試驗(yàn)周期，原生質(zhì)體會(huì)失活，因此，2 h為最優(yōu)酶解時(shí)長(zhǎng)。甘露醇濃度需匹配細(xì)胞滲透壓，細(xì)胞滲透壓過(guò)小或過(guò)大均會(huì)造成原生質(zhì)體活性降低，甚至失活，前人研究[18,26-27]中甘露醇濃度為0.4~1 mol·L-1。本研究結(jié)果表明，甘露醇濃度為0.6 mol·L-1時(shí)，八仙花有色原生質(zhì)體游離效果最佳。

由于解離花萼片產(chǎn)生的原生質(zhì)體數(shù)量較少，故需在離心過(guò)程中獲得盡可能多的原生質(zhì)體。純化原生質(zhì)體的方法主要有離心沉降法[18]與密度梯度自然沉降法[28]。離心速率較小或自然沉淀時(shí)，部分原生質(zhì)體會(huì)重懸于上清中；若離心速率過(guò)大，原生質(zhì)體會(huì)因受機(jī)械損傷而失活，甚至破裂。本研究表明，4℃條件下，最佳離心速率為1 426 r·min-1。

原生質(zhì)體游離能有效地分離花萼中有色細(xì)胞和無(wú)色細(xì)胞，以便于研究有色細(xì)胞的生理生化特性。Yoshida等[5]使用質(zhì)子選擇微電極測(cè)得八仙花藍(lán)色液泡pH約為4.1，紅色液泡約為3.2。本研究中，‘Baby blue’藍(lán)色原生質(zhì)體液泡H+流外排，液泡內(nèi)H+積累減少，pH相對(duì)較高；粉色原生質(zhì)體液泡H+流吸收，液泡內(nèi)H+積累增多，pH相對(duì)較低，與前人的研究結(jié)果一致。因此，本研究建立的有色原生質(zhì)體游離體系為后續(xù)八仙花花色形成機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。