王佩茵 徐亞幸 許曉婷 吳映明

（廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東廣州 510303）

猴頭菇Hericium erinaceus，屬猴頭菌科，猴頭菇屬，是一種藥食兩用菌，具有巨大的潛在研究?jī)r(jià)值[1?2]。當(dāng)下環(huán)境鎘污染嚴(yán)重，鎘易通過栽培料影響食用菌的正常生理生化，不利于食用菌產(chǎn)業(yè)的綠色發(fā)展，亦會(huì)通過食物鏈進(jìn)入人體進(jìn)而威脅人類健康[3?4]。乙二胺四乙酸（EDTA）是一種能夠與重金屬離子形成穩(wěn)定絡(luò)合物的螯合劑。研究表明EDTA 可有效緩解重金屬對(duì)生物的毒害[5?8]，但將EDTA 應(yīng)用于緩解食用菌重金屬脅迫的研究較少，且現(xiàn)有研究多以子實(shí)體為試材[9?10]，存在研究耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)。試驗(yàn)利用EDTA 螯合猴頭菇培養(yǎng)液中的鎘離子，采用液體培養(yǎng)的方式制備粗酶液檢測(cè)其生理活性，探索一種降低猴頭菇對(duì)鎘吸收的生產(chǎn)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）供試猴頭菇菌株

猴頭菇菌株（GDMCC 5.207），由廣東省微生物研究所提供。

（2）試劑與儀器設(shè)備

①試劑：四水合酒石酸鉀鈉（分析純，廣東廣試試劑科技有限公司），3，5?二硝基水楊酸（DNS）（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），羧甲基纖維素鈉（CMC?Na）（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），2，2′?聯(lián)氮?雙?3?乙基苯并噻唑啉?6?磺酸（ABTS）（化學(xué)純，上海麥克林生化科技有限公司），硝酸鎘（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），乙二胺四乙酸二鈉（EDTA?2Na）（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；②儀器設(shè)備：FA1004 電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司），WPX?9252 精密恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），YXQ?LS?75G 立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），CHA?S 氣浴恒溫振蕩器（常州澳華儀器有限公司），KH?45 A 電熱恒溫干燥箱（康恒儀器有限公司），UV?1500 紫外可見分光光度計(jì)（上海翱藝儀器有限公司）。

（3）培養(yǎng)基：PDA 平板培養(yǎng)基為馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH 7~8；液體培養(yǎng)基為馬鈴薯200 g，蛋白胨2 g，葡萄糖20 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 1 g，水1 000 mL，pH 7~8。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

挑取猴頭菇菌絲轉(zhuǎn)接至PDA 平板培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)20 d。

1.2.2 EDTA調(diào)控處理方法

液體培養(yǎng)基中加入20 mg/L 硝酸鎘，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定 5 個(gè) EDTA 處理（0、10、20、40、80 mg/L），以不添加鎘及EDTA 的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的液體培養(yǎng)菌絲為空白對(duì)照。挑取已活化的1 cm2的菌絲圓片3 塊接至各試驗(yàn)培養(yǎng)基中（125 mL/250 mL），28 ℃，150 r/min 振蕩培養(yǎng)，6 個(gè)處理各設(shè)置12個(gè)重復(fù)。

1.2.3 樣品制備

接種后培養(yǎng)4 d、8 d、12 d、16 d，然后分別在各處理中隨機(jī)取3 個(gè)重復(fù)樣品，拍照記錄菌絲球生長(zhǎng)情況；真空抽濾收集母液及菌絲體，菌絲體68 ℃恒溫烘干至恒重，稱干重。母液經(jīng)3 500 r/min 離心10 min，提取上清液即為粗酶液。

1.2.4 酶活性測(cè)定

羧甲基纖維素酶（CMC 酶）活性，采用3，5?二硝基水楊酸比色法[11]，于520 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定，葡萄糖回歸方程為y=6.5857x?0.0156；漆酶活性，采用ABTS 法[12]測(cè)定，于410 nm 處測(cè)定。定義每分鐘使OD 均值增加0.1 所需要的酶量為1 個(gè)酶活性單位（U）；淀粉酶活性參考朱啟忠[13]3，5?二硝基水楊酸比色法于540 nm 處測(cè)定，葡萄糖回歸方程為y=4.92x?0.0107。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用EXCEL 2018和SPSS 26.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 EDTA 對(duì)Cd2+脅迫下猴頭菇菌絲液體培養(yǎng)特征的影響

培養(yǎng)液顏色越淺，渾濁度越低，菌絲球體積越大，表明菌絲生長(zhǎng)發(fā)育越旺盛，對(duì)培養(yǎng)液中碳氮源的水解越充分[3]。試驗(yàn)培養(yǎng)16 d 時(shí)觀察猴頭菇液體培養(yǎng)菌絲特征如圖1。由圖1 可知，隨EDTA 質(zhì)量濃度上升，猴頭菇菌絲球體積明顯增大，培養(yǎng)液由橙黃色變?yōu)榈S色，由此可知，EDTA 能促進(jìn)Cd2+脅迫下猴頭菇菌絲對(duì)胞外物質(zhì)分解利用。40 mg/L EDTA 處理組菌絲球體積大于其他各處理組，與空白組相近，且培養(yǎng)液清晰度最高、顏色最淺，表明40 mg/L EDTA 對(duì)Cd2+抑制菌絲生長(zhǎng)的緩解效果最好，且對(duì)培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用好于空白組，其菌絲生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)更佳。

圖1 試驗(yàn)各處理猴頭菇液體培養(yǎng)菌絲特征（培養(yǎng)16 d，數(shù)字為Cd2+質(zhì)量濃度mg/L）

2.2 EDTA 對(duì)Cd2+脅迫下猴頭菇菌絲球干重的影響

由圖2可知，液體培養(yǎng)基接種培養(yǎng)8 d內(nèi)各處理組菌絲干重?zé)o顯著變化，培養(yǎng)12 d，空白組及40 mg/L、80 mg/L EDTA 處理組菌絲干重顯著上升，其他處理組的菌絲干重均無明顯上升。EDTA 各處理組的峰值出現(xiàn)在培養(yǎng)16 d，僅添加Cd2+的處理組菌絲干重顯著小于其他處理組（P<0.05）；向含Cd2+的培養(yǎng)液加入EDTA 后，菌絲干重隨EDTA 質(zhì)量濃度的升高先上升而后降低，40 mg/L EDTA 處理組菌絲干重最高（P<0.05），各處理組的菌絲干重均小于空白組。

圖2 EDTA對(duì)Cd2+脅迫下猴頭菇液體培養(yǎng)菌絲球干重的影響

2.3 EDTA 對(duì)Cd2+脅迫下猴頭菇菌絲體胞外羧甲基纖維素酶活性的影響

由圖3 可知，EDTA 能提高Cd2+脅迫下猴頭菇菌絲體胞外羧甲基纖維素酶（CMC）活性，隨液體培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，除10 mg/L EDTA 處理外，其他處理組的CMC 活性先升后降，并于接種后培養(yǎng)8~12 d出現(xiàn)峰值，這與前人研究香菇[14]和蟹味菇[15]的菌絲對(duì)纖維素的利用晚于淀粉的結(jié)果較一致。培養(yǎng)液加Cd2+后（圖3 中Cd?EDTA 0）猴頭菇菌絲的CMC 活性顯著 低 于 空 白 組（P<0.05），其 中 EDTA 20 mg/L、40 mg/L 處理組表現(xiàn)出較高酶活性，并以40 mg/L 處理組對(duì)Cd2+脅迫下猴頭菇菌絲CMC 活性的促進(jìn)作用最為顯著（P<0.05）。

圖3 EDTA對(duì)Cd2+脅迫下猴頭菇菌絲體胞外羧甲基纖維素酶活性的影響

2.4 EDTA 對(duì)Cd2+脅迫下猴頭菇菌絲體胞外漆酶活性的影響

由圖 4 可知，除添加 0 mg/L、10 mg/L EDTA 處理組外，其他處理組的猴頭菇菌絲體胞外漆酶活性均于接種后培養(yǎng)12 d 出現(xiàn)峰值，這與前人研究杏鮑菇[16]和金針菇[17]的結(jié)果相似，說明猴頭菇菌絲對(duì)木質(zhì)素的利用最遲。僅加硝酸鎘的對(duì)照組（圖4 Cd?EDTA 0）菌絲漆酶活性明顯低于空白組（P<0.05），且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌絲漆酶活性無明顯變化。除EDTA 10 mg/L 處理外，其他處理組均能顯著提高Cd2+脅迫下的菌絲漆酶活性（P<0.05）；EDTA 20 mg/L、40 mg/L 處理能明顯促進(jìn)菌絲漆酶活性，且以EDTA 40 mg/L 處理在接種12 d 時(shí)的漆酶活性最高，說明40 mg/L EDTA 處理組促進(jìn)猴頭菇菌絲對(duì)培養(yǎng)液中木質(zhì)素物質(zhì)的降解利用。

圖4 EDTA對(duì)Cd2+脅迫下猴頭菇菌絲體胞外漆酶活性的影響

2.5 EDTA 對(duì)Cd2+脅迫下猴頭菇菌絲體胞外淀粉酶活性的影響

由圖5 可知，各處理猴頭菇菌絲體胞外淀粉酶活性均在培養(yǎng)前期迅速升高，接種后培養(yǎng)4 d 達(dá)最高，與前人研究香菇[14]、金耳[18]的菌絲在培養(yǎng)初期可能利用淀粉為先的結(jié)果較一致。與空白組比較，Cd2+脅迫下猴頭菇菌絲體淀粉酶活性下降，EDTA 40 mg/L 處理菌絲體的淀粉酶活性最高（2.48 U/mL），顯著高于其他處理（P<0.05）；EDTA 10 mg/L 及EDTA 80 mg/L 處理對(duì)菌絲體淀粉酶活性影響不明顯（P>0.05）；EDTA 20 mg/L、EDTA 40 mg/L處理菌絲體的酶活性均高于對(duì)照組，其中以EDTA 40 mg/L 處理促進(jìn)猴頭菇菌絲體淀粉酶活性最為顯著。

圖5 EDTA對(duì)Cd2+脅迫下猴頭菇菌絲體胞外淀粉酶活性的影響

3 小結(jié)與討論

食用菌菌絲體胞外酶活性的變化與其生長(zhǎng)發(fā)育直接相關(guān)，如果菌絲體胞外酶活性降低，會(huì)阻止食用菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，影響食用菌正常代謝，降低食用菌產(chǎn)量及品質(zhì)。劉秋梅等[3]研究發(fā)現(xiàn)，隨培養(yǎng)液中鎘含量的升高，食用菌菌絲體胞外酶活性及菌絲球生物量降低。施加外源物是緩解生物重金屬毒害的有效途徑，王芳等[19]研究表明，一氧化氮能緩解鎘脅迫對(duì)玉米生長(zhǎng)的抑制作用；佘婷婷等[20]研究表明，外施SA（水楊酸）能顯著提高Hg 脅迫下金針菇的胞外酶活性。筆者研究表明：EDTA對(duì)Cd2+脅迫下猴頭菇菌絲生長(zhǎng)量、淀粉酶性、漆酶性、CMC 活性有重要影響；EDTA 40 mg/L 處理，猴頭菇液體培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)最佳、胞外酶活性最高，且胞外淀粉酶、CMC 活性均高于空白組。由此得出，該質(zhì)量濃度EDTA 可有效緩解Cd2+對(duì)猴頭菇菌絲的毒害，促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)及胞外酶活性。