戶恬，馮東，滕立，周革非，劉頌

煙臺大學(xué)煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（煙臺 264005）

水胡桃（Pterocarya rhoifoliaSieb.et Zucc）為胡桃科（Juglandaceae），楓楊屬（Pterocarya）植物，在我國主要分布于山東省境內(nèi)[1]。經(jīng)研究表明，該屬植物含有多種化學(xué)成分[2-4]，具有抑制腫瘤、抑菌、抗炎、抗氧化、抗病毒等豐富的藥理活性，其中萘醌類物質(zhì)作為楓楊屬植物主要活性物質(zhì)之一，具有極強的抗氧化活性，可以延緩衰老[5]。試驗探究水胡桃葉中萘醌類成分的最佳提取工藝，并對提取物體外抗氧化活性進行初步研究，以期為天然抗氧化劑的開發(fā)和楓楊屬植物的利用提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

水胡桃葉樣品（2021年5月采自山東萊陽，陰干后塑料袋封口保存）；DPPH（Sigma公司）；4, 8-二羥基-1-四氫萘醌標準品（實驗室分離鑒定的單體化合物）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

TU-1810型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線

精確稱取0.002 0 g的4, 8-二羥基-1-四氫萘醌標準品，以無水乙醇定容，制作標準曲線[6]，并得到回歸方程。

1.2.2 單因素試驗

選取乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度和提取時間4個單因素作為考察因素。乙醇體積分數(shù)分別為40%，50%，60%，70%和80%；料液比分別為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50和1∶60（mg/mL）；提取溫度分別為30，40，50，60和70 ℃；提取時間分別為3，4，5，6和7 h。在研究其中某一單因素變量的影響時，固定其他各因素條件：乙醇體積分數(shù)60%、料液比1∶30（mg/mL）、提取溫度40 ℃、提取時間3 h。按照1.2.1所述方法，測定水胡桃葉中萘醌含量，平行試驗3次，根據(jù)式（1）計算每次試驗萘醌的提取量R（mg萘醌/g水胡桃葉粉）。

式中：c為提取液中萘醌質(zhì)量濃度，mg/mL；v為提取液總體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為水胡桃葉粉末質(zhì)量，g。

1.2.3 正交試驗

根據(jù)單因素試驗設(shè)計出四因素三水平的正交試驗，以確定提取水胡桃葉中萘醌的最佳提取方案。正交因素水平表見表1。

表1 正交因素水平表

1.2.4 水胡桃葉萘醌類成分體外抗氧化活性試驗

根據(jù)1.2.3試驗結(jié)果，在確定的最優(yōu)提取條件下，制備水胡桃葉萘醌提取液，減壓濃縮至干。配制不同濃度的水胡桃葉萘醌提取液，以VC為對照測定其對DPPH·自由基[6-7]和·OH自由基[8-9]的清除率，并對其還原力進行測定[10]。各組試驗重復(fù)3次，并利用式（2）計算水胡桃葉萘醌取液對各自由基清除率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗和體外抗氧化性試驗數(shù)據(jù)均用“均數(shù)±標準差”表示；正交試驗利用SPASS軟件進行設(shè)計，數(shù)據(jù)處理和分析；數(shù)據(jù)顯著性分析用F-檢驗法檢驗。

2 結(jié)果分析

2.1 標準曲線及方程

根據(jù)1.2.1所示方法，可得標準曲線方程y=10.370 0x-0.026 7，回歸系數(shù)R2=0.999 7。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分數(shù)對萘醌提取量的影響

由圖1可以看出，在乙醇分數(shù)低于6%時，萘醌提取量隨乙醇體積分數(shù)的增大而增加，乙醇體積分數(shù)60%時，萘醌的提取量達到最高120.13 mg/g。但繼續(xù)增大乙醇體積分數(shù)時，萘醌提取量降低。造成這種現(xiàn)象的原因可能是：在一定范圍內(nèi)，乙醇體積分數(shù)越大，溶劑極性越小，溶液與萘醌類成分極性越接近，根據(jù)相似相溶原理，溶劑極性小有利于水胡桃葉萘醌類化合物析出，提取量變大；乙醇體積分數(shù)繼續(xù)增大，超過一定范圍時，溶劑與萘醌極性差距變大，提取量減小。因此，提取水胡桃葉中萘醌的最佳乙醇體積分數(shù)為60%。

圖1 乙醇體積分數(shù)對萘醌提取量的影響

2.2.2 料液比對萘醌提取量的影響

由圖2可以看出，萘醌提取量隨料液比中液體占比的增大而增加，但料液比1∶40（g/mL）后萘醌提取量增加幅度明顯降低，造成這種現(xiàn)象的原因可能是：提取溶劑的量較少時，萘醌溶解量達到飽和，使得萘醌提取量較低，但當(dāng)提取溶劑增加時萘醌溶解量增加，此時萘醌提取率逐漸增大。綜合后續(xù)提取工藝各因素考慮，水胡桃葉中萘醌提取最佳料液比1∶40（g/mL），此時萘醌的提取量為136.6 mg/g。

圖2 料液比對萘醌提取量的影響

2.2.3 提取溫度對萘醌提取量的影響

由圖3可以看出，在60 ℃之前萘醌提取量隨提取溫度的升高而增加，提取溫度60 ℃時，萘醌的提取量達到最高153.92 mg/g。但隨著提取溫度繼續(xù)上升，萘醌提取量降低。造成這種現(xiàn)象的原因可能是：在一定范圍內(nèi)，隨著溫度升高，萘醌的溶解度變大，提取量也隨之增大；但溫度過高時，乙醇揮發(fā)量增加，萘醌類成分也會因為溫度升高發(fā)生化學(xué)變化，導(dǎo)致萘醌的提取量下降。因此，水胡桃葉中萘醌最佳提取溫度為60 ℃。

圖3 提取溫度對萘醌提取量的影響

2.2.4 提取時間對萘醌提取量的影響

由圖4可知，在6 h之前，隨著提取時間的增加，萘醌提取量逐漸上升。提取時間6 h時，萘醌提取量達115.2 mg/g。但提取時間繼續(xù)延長，萘醌提取量下降。造成這種現(xiàn)象的原因可能是：在提取時間較短的情況下，水胡桃葉中的萘醌類物質(zhì)不能完全溶出，隨著提取時間不斷增加，水胡桃葉中萘醌類成分溶解在乙醇中的含量增加；但當(dāng)達到一定時間后，溶出的萘醌已達到平衡，反而有可能因提取時間過長導(dǎo)致萘醌類物質(zhì)水解，提取量下降。因此，水胡桃葉中萘醌最佳提取時間為6 h。

圖4 提取時間對萘醌提取量的影響

2.3 正交試驗分析結(jié)果

根據(jù)表2可知：4種因素對水胡桃葉中萘醌提取率的影響大小順序為A＞D＞B＞C，即料液比＞乙醇體積分數(shù)＞提取時間＞提取溫度；醇提取法提取水胡桃葉中萘醌類成分最優(yōu)的提取組合為A3B1C2D1，即以體積分數(shù)50%的乙醇溶液為提取溶劑，料液比1∶50（g/mL），提取溫度60 ℃，提取時間5 h，在此條件下，萘醌提取量可達168.14 mg/g。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 正交試驗結(jié)果方差分析表

2.4 水胡桃葉萘醌類成分體外抗氧化活性測定結(jié)果

2.4.1 萘醌類成分清除DPPH·活性測定

由圖5可知，隨著樣品質(zhì)量濃度增大，水胡桃葉萘醌提取物及VC兩者對DPPH·自由基清除能力逐漸增強。但水胡桃葉萘醌提取物及VC質(zhì)量濃度大于0.6 mg/mL時，兩者對DPPH·自由基的清除率逐漸趨于平穩(wěn)。且水胡桃葉萘醌提取物對DPPH·自由基的清除能力弱于同濃度同體積的VC溶液。

圖5 水胡桃葉萘醌類物質(zhì)對DPPH·的清除效果

2.4.2 萘醌類成分清除·OH活性測定

由圖6可知，水胡桃葉萘醌提取物及VC兩者對·OH自由基的清除率在質(zhì)量濃度0～0.6 mg/mL范圍內(nèi)，隨著濃度的增大而逐漸增大。水胡桃葉萘醌提取物及VC質(zhì)量濃度大于0.6 mg/mL時，雖然兩者對·OH自由基的清除率仍然上升，但整體逐漸趨于平穩(wěn)。且同濃度同體積的VC溶液對·OH自由基的清除能力優(yōu)于水胡桃葉萘醌提取物。

圖6 水胡桃葉萘醌類物質(zhì)對·OH的清除效果

2.4.3 萘醌類成分還原力測定

萘醌能使反應(yīng)體系中Fe3+還原成Fe2+，溶液由黃色變成不同程度的藍色[11]。還原能力越強，吸光度越大。由圖7可知，在一定濃度范圍內(nèi)，還原力隨著水胡桃葉萘醌提取物及VC溶液質(zhì)量濃度的增大而逐漸增強，表現(xiàn)出良好的還原能力。

圖7 水胡桃葉萘醌類物質(zhì)還原力測定結(jié)果

3 結(jié)論

試驗對可能影響試驗結(jié)果的4種因素進行研究與分析，通過單因素試驗與正交試驗結(jié)果分析得出：影響水胡桃葉中萘醌提取量的4種因素的影響程度為A＞D＞B＞C，即料液比＞乙醇體積分數(shù)＞提取時間＞提取溫度；萘醌最優(yōu)提取工藝條件為提取溶劑采用體積分數(shù)50%乙醇，料液比1∶50（g/mL），提取溫度60℃，提取時間5 h，該提取工藝條件下萘醌的提取量為168.14 mg/g。

通過對水胡桃葉萘醌提取物清除DPPH·、·OH的測定，并對其還原力進行測定，結(jié)果表明水胡桃葉萘醌類成分具有良好的體外抗氧化活性。隨著社會的進步，醫(yī)療產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及藥物的開發(fā)越來越受到社會的關(guān)注和重視，其中天然產(chǎn)物的開發(fā)仍占有相當(dāng)重要的地位。楓楊屬植物活性多樣，種類豐富，且生長速度快，具有潛在的藥用價值[12]。試驗結(jié)果可對楓楊屬植物的研究提供一定價值參考，為天然植物中抗氧化劑的開發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。